專利名稱：一株用于污水處理的好氧反硝化菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)、環(huán)境微生物及水處理領(lǐng)域，尤其涉及了一種用于污水處理的好氧反硝化菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著水體富營養(yǎng)化的日益嚴(yán)重，去除水中氮素污染已經(jīng)成為當(dāng)今水污染防治領(lǐng)域的一個熱點(diǎn)問題。氮在污水中主要以分子態(tài)氮，有機(jī)氮，氨氮，硝態(tài)氮，亞硝態(tài)氮，硫氰化物及氰化物形式存在，而在未經(jīng)處理的原廢水中主要以有機(jī)態(tài)氮及氨氮的形式存在；經(jīng)二級生化處理后主要剩下氨氮及硝態(tài)氮。長期以來，脫氮主要強(qiáng)調(diào)污水中氨氮的脫除，不對硝態(tài)氮進(jìn)行處理，導(dǎo)致水體中硝酸鹽含量不斷升高。傳統(tǒng)生物脫氮包括硝化和反硝化兩個過程，即氨氮由好氧硝化細(xì)菌轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，然后再通過厭氧或缺氧的反硝化細(xì)菌還原為氮?dú)?，排出水體。近年來的國內(nèi)外研究表明，一些微生物在不同的溶氧條件下，也能表現(xiàn)出一定的反硝化能力。比如已經(jīng)報道過的 pan to tropha, Alcaligenes faecalis,Pseudomonas aeruginosa, Thaurea mechernichensis, Acinetobacter calcoaceticus，Providencia rettgeri, Pseudomonas stutzeri 取 Bacillus strains 等均可在好氧條件下進(jìn)行反硝化，而對于紅球菌屬)則報道較少。好氧反硝化菌的出現(xiàn)為生物脫氮提供了一條全新的途徑，使得傳統(tǒng)的生物脫氮途徑更加完善，也為脫氮工藝研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。好氧反硝化菌的篩選方法很多，主要包括:1.富集培養(yǎng)法:利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在培養(yǎng)基中添加限制性碳源和氮源，或根據(jù)反硝化為堿增加的過程在培養(yǎng)基中添加PH指示劑。2.稀釋法，將樣品稀釋一定倍數(shù)后培養(yǎng)，然后將pH值發(fā)生變化的再進(jìn)行稀釋，重復(fù)操作，將本來不占優(yōu)勢的好氧反硝化菌分離出來。3.間歇曝氣法，好氧反硝化菌可同時利用氧分子和硝態(tài) 氮，好氧、缺氧的頻繁轉(zhuǎn)換有利于其在競爭中取得優(yōu)勢地位。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株好氧反硝化菌，能夠在好氧條件下有效降解水體中的硝態(tài)氮及亞硝態(tài)氮。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案得以解決:
用于污水處理的好氧反硝化菌，所述好氧反硝化菌16S rDNA分子鑒定為紅平紅球菌iRhodococcus erythropolis )，命名為 Rhodococcus erythropolis Sunda 1101，該菌株于2011年6月23日，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏編號為CCTCC M 2011211。本發(fā)明提供一種篩選好氧反硝化菌的方法。本發(fā)明的菌種篩選采用多種篩選方法相結(jié)合，首先通過添加限制性氮源，間歇曝氣來富集好氧反硝化菌，然后再通過在培養(yǎng)基中添加PH指示劑來快速有效地篩選好氧反硝化菌。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:對污水處理廠的活性污泥進(jìn)行曝氣富集培養(yǎng)，篩選出好氧菌，然后根據(jù)反硝化菌產(chǎn)堿的性能，通過在培養(yǎng)基中添加溴甲基芬蘭指示劑的方法，來有效地篩選好氧反硝化菌。用模擬好污水復(fù)篩高反硝化能力的好養(yǎng)反硝化菌。其步驟依次是取樣，曝氣富集培養(yǎng)，初篩，復(fù)篩，最后得到I株在好氧條件下，能同時降解模擬污水中的硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮，反硝化能力較高的菌株。本發(fā)明提供了菌株鑒定的方法。本發(fā)明的菌株鑒定方法主要是通過16S rDNA鑒定的方法，利用通用引物擴(kuò)增出進(jìn)化過程中保守的16S rDNA片段進(jìn)行測序，然后與基因文庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，根據(jù)菌株同源性比例確定菌株的屬性，最后再根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行確認(rèn)。本發(fā)明的好氧反硝化菌應(yīng)用于降解污染的水體中的硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮。具體為對菌體進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，接種于含硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮污染的水體。本發(fā)明由于采用了以上技術(shù)方案，具有顯著的技術(shù)效果:
本發(fā)明提供的菌株可以有效的去除污水中的硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮，去除硝態(tài)氮和去除亞硝態(tài)氮的能力分別為3.01 mgN/ (g.L.h)和1.80 mgN/ (g.L.h)。該菌株的脫氮方法歸屬于生物脫氮領(lǐng)域，生物脫氮方法不僅高效而且成本較低，因此該菌株在應(yīng)用于含氮廢水的處理過程中具有很好的前景。生物材料保藏信息
生物材料名稱:紅平紅球菌erythropolis)；
保減單位:中國典型培養(yǎng)物保減中心；
保藏日期:2011年6月23日；
保藏編號:CCTCC M 2011211。


圖1是本發(fā)明16S rDNA PCR擴(kuò)增后的結(jié)果圖。圖2是本發(fā)明的菌株與其它菌株的親緣關(guān)系圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖1至附圖2與實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述:
實施例1
好氧反硝化菌的篩選1.富集培養(yǎng):將從蘆村污水處理廠取得的活性污泥進(jìn)行曝氣富集培養(yǎng)，裝液量2 L/3.6L，每天更換新鮮培養(yǎng)基。更換新鮮培養(yǎng)基時先靜置lh，移除600mL體積，然后再補(bǔ)加600mL新鮮培養(yǎng)基，總共富集約40天。2.初篩:將富集好的活性污泥進(jìn)行稀釋，在溴百里酚藍(lán)培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，然后置于30° C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3天。將溴百里酚藍(lán)培養(yǎng)基上出現(xiàn)的藍(lán)色單菌落進(jìn)行分類，革蘭氏染色，然后將每個形態(tài)的菌落挑選3-4個進(jìn)行劃線分離，置于30° C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3天。對劃線分離得到的藍(lán)色單菌落進(jìn)行分類，挑選有特征的菌落保存到斜面上，供復(fù)篩用。3.復(fù)篩:將初篩保存的菌株接入菌體擴(kuò)大培養(yǎng)基，30°C，200 rpm，培養(yǎng)24h，然后按1%的比例分別接入IOOmL檢測培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，30°C，200 rpm,測定接種前后硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的變化。選擇硝態(tài)氮降解率達(dá)40%以上且亞硝態(tài)氮降解率達(dá)25%以上的菌株進(jìn)行反硝化性能測試，得到一株性能相對較好的菌株。4.檢測方法:
4.1硝態(tài)氮的測定:紫外分光光度法，參見中華人民共和國環(huán)境保護(hù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)HJ/T346-2007。4.2亞硝態(tài)氮的測定:N-(l-萘基)_乙二胺鹽酸分光光度法，參見國標(biāo)GB7493-87。4.3菌體干重(DCW)的測定:取菌體培養(yǎng)液,在8000 rpm的條件下離心5min,棄去上清液，然后在105° C的恒溫干燥箱中干燥至菌體恒重。5.相關(guān)培養(yǎng)基
富集培養(yǎng)基(g/L): (NH4)2SO4 0.5 ;丁二酸鈉 2.17 ;維氏鹽溶液 50ml ；pH 7.2。維氏鹽溶液(g/L): K2HPO4 5.0 ；MgS04.7H20 2.5 ；NaCl 2.5 ；FeS04.7H20 0.05 ；MnSO4.4H20 0.05。初篩培養(yǎng)基(g/L):瓊脂20 ；ΚΝ03 I ；KH2PO4 I ；FeS04.7H20 0.5 ；CaCl2 0.2 ；MgSO4.7H20 I; 丁二酸鈉8.5;溴百里酚藍(lán)(取0.1g溴百里酚藍(lán)溶于IOmL酒精)lmL，pH7.0 7.3。菌體擴(kuò)大培養(yǎng)基(g/L)=KNO3 I ；KH2PO4 I ；FeS04.7H20 0.05 ；CaCl2 0.02 ；MgSO4.7H20 I ；T二酸鈉.6H20 8.5。檢測培養(yǎng)基(g/ L)=KH2PO4 I ；MgS04.7H20 I ； 丁二酸鈉 2.8 ；NaNO3 0.6 或 NaNO2
0.50。實施例2
好氧反硝化菌的鑒定1.提取細(xì)菌基因組
將目的菌株接入LB培養(yǎng)基，隔夜培養(yǎng)后，取ImL離心得菌體，然后用基因組試劑盒提取細(xì)菌基因組，瓊脂糖凝膠電泳(1%)驗證，紫外分析儀檢查電泳結(jié)果。2.PCR 擴(kuò)增 16S rDNA 片段
利用通用引物(8f: 5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’， 1492r:5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3)進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(1%)驗證，紫外分析儀檢查電泳結(jié)果，PCR片段大小約1500 bp。PCR 反應(yīng)體系(Takara LA Taq 50 M-L):10XBuffer 5M-L ； DNTP 8M-L ； PrimerlIM-L ； Premier2 I M-L ； DNA 模板 I KL ;Enzyme 0.5 M-L ；ddH20 33.5 KL。PCR 條件:預(yù)變性 94°C 5 min ;變性 94°C 35 sec ;退火 55°C 45sec ;延伸 72°C
2分鐘；Goto st印2，循環(huán) 30 次；終延伸 72°C 10 min I 次；12°C for ever。 3.PCR產(chǎn)物純化
利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行膠回收，然后將回收片段送去上海生工測序。4.序列比對及提交
將測序所得片段在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)該菌株與erythropolis 的同源性高達(dá) 97%,初步確定該菌株為 TPAot/ococci/s erythropolis。
5.菌株同源性分析
在比對后所得結(jié)果中挑選幾個有代表性的片段進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，進(jìn)一步確定菌株的名稱。根據(jù)圖2的結(jié)果顯示,在親緣關(guān)系上，Sunda 1101與TPAot/ococci/s erythropolis較接近。實施例3
好氧反硝化菌處理模擬污水1.相關(guān)培養(yǎng)基:
菌體擴(kuò)大培養(yǎng)基(/L) =KNO3 Ig ；KH2PO4 Ig ；FeS04.7H20 0.05g ；CaCl2 0.02g ；MgSO4.7H20 Ig ;丁二酸鈉 8.5g。檢測培養(yǎng)基(/L)= KH2PO4 Ig ；MgS04.7H20 Ig ;丁二酸鈉 2.8g ；NaNO3 0.6 或 NaNO2
0.50。2.工藝條件:
溫度:30°C ;搖床轉(zhuǎn)速:150rpm ;裝液量:100/250mL無流加。3.好氧反硝化菌的應(yīng)用
將斜面上的反硝化菌挑取一環(huán)接入擴(kuò)大培養(yǎng)基，在30°C，150rpm的條件下培養(yǎng)24h，取一部分體積測定菌體干重，其余部分按1%的比例分別接入富含硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的模擬污水中，30°C, 150rpm,培養(yǎng)24小時后，8000rpm的條件下離心5min,檢測上清液中的硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮含量，計算單位菌體的氮去除能力。表I菌株對硝態(tài)氮的去除能力
權(quán)利要求
1.一株用于污水處理的好氧反硝化菌，其特征在于:該菌株經(jīng)16S rDNA分子鑒定為紅平紅球菌(WAotZococciAs 6 r7iAro/7o7i5.),菌種保藏編號:CCTCC M 2011211,保藏時間:2011年6月23日，保藏地點(diǎn):中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于污水處理的好氧反硝化菌，其特征在于:所述的好氧反硝化菌應(yīng)用于降解污染的水體中的硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于污水處理的好氧反硝化菌，其特征在于:將好氧反硝化菌擴(kuò)大培養(yǎng)后按1%的比例投入含硝態(tài)氮的水體中。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于污水處理的好氧反硝化菌，其特征在于:將好氧反硝化菌擴(kuò)大培養(yǎng)后按1%的比例投 入含亞硝態(tài)氮的水體中。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的用于污水處理的好氧反硝化菌，其特征在于:所述的擴(kuò)大培養(yǎng)條件為30°C，200 rpm條件下培養(yǎng)24h。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)、環(huán)境微生物及水處理領(lǐng)域，公開了一種用于污水處理的好氧反硝化菌及其應(yīng)用。本發(fā)明菌株是從污水處理廠取得的活性污泥中篩選所得，本發(fā)明提供的菌株可以有效的去除污水中的硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮,去除硝態(tài)氮和去除亞硝態(tài)氮的能力分別為3.01mgN/(g·L·h)和1.80mgN/(g·L·h)。該菌株的脫氮方法歸屬于生物脫氮領(lǐng)域，生物脫氮方法不僅高效而且成本較低，該菌株在應(yīng)用于含氮廢水的處理過程中具有很好的前景。
文檔編號C02F3/02GK103074242SQ20111032686
公開日2013年5月1日 申請日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者鄭展望, 楊瑾, 王斌 申請人:浙江商達(dá)環(huán)保有限公司