專利名稱：一種苯系物厭氧降解菌群的馴化篩選方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于受污染土壤與水的生物降解處理技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種苯系物厭氧降解菌群的馴化篩選方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
苯系物主要包括苯、甲苯、乙苯、鄰二甲苯、間二甲苯和對二甲苯(benzene，toluene，ethylbenzene，m-xylene，o-xylene，p-xylene，簡稱BTEX)的好氧生物降解是最快的。在文獻1 Shinoda Y， Sakai Y，Uenishi H，et al.2004.Aerobic and Anaerobic Toluene Degradation by a NewlyIsolated DenitrifyingBacterium，Thauera sp. Strain DNT-1. Applied and environmentalmicrobiology，70(3)1385-1392”中報導(dǎo)，在好氧條件下苯系物可以完全礦化為C02，然而，地下含水層或污染土壤通常是厭氧狀態(tài)，使污染帶中的好氧微生物被厭氧微生物所替代，因此，BTEX的厭氧生物降解比好氧生物降解更加可行且經(jīng)濟有效。在文獻2“Edwards E A and Grbic D.Complete mineralization ofbenzene by aquifer microorganisms under strictly anaerobic conditions.Appl Environ Microbiol，1992，582663-2666”中，在厭氧條件下也有將苯系物完全降解為CO2的報道，在四種BTEX污染物中苯是最難被厭氧降解，即使苯在特定馴化的條件下能夠被降解，但其降解速率也十分緩慢。由于缺少高效的BTEX厭氧降解菌，制約了BTEX污染土壤及地下水厭氧生物修復(fù)技術(shù)的進一步發(fā)展和應(yīng)用研究。因此，篩選出BTEX高效厭氧降解菌對于治理和修復(fù)BTEX污染土壤及地下水有重要的意義。
李小明，陳堅，倫世儀等在“環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2001，321～24”中的“降解對苯二甲酸厭氧微生物群快速馴化與富集技術(shù)”，是與本申請最為相關(guān)的技術(shù)，但是由于苯系物特別是苯和對二甲苯更難于被生物降解，同時由于苯系物的易于揮發(fā)，使得對苯二甲酸厭氧微生物群的馴化與富集技術(shù)無法適用于苯系物的厭氧降解微生物群的馴化篩選。同時，馴化的環(huán)境條件，馴化周期，及馴化的過程參數(shù)選定等都對馴化效果有密切的關(guān)系，這些都需要經(jīng)過一系列的試驗研究后才能確定出最佳范圍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種苯系物厭氧降解菌群的馴化篩選方法及應(yīng)用。其具體步驟如下(1)選用受石油污染的土壤，按質(zhì)量比為1～1.5∶1的比例加入去離子水，按質(zhì)量比為150～200∶1的比例加入硫化鈉，按質(zhì)量比為2000～2500∶1的比例加入BTEX混合物，按質(zhì)量比為100～150∶1的比例加入電子受體，混合均勻后密封靜置時間大于3個月。
(2)在充滿氮氣的厭氧箱內(nèi)向體積為50～200mL的厭氧瓶中按800∶5∶1的比例加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液和維生素c溶液，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為NH4Cl1.0g·L-1，KH2PO41.0 g·L-1，MgCl20.1 g·L-1，CaCl2·2H2O0.05 g·L-1；微量金屬液的組成為CoCl2·6H2O30mg·L-1，CuCl20.15mg·L-1，H3BO35.7mg·L-1，MnCl2·4H2O20mg·L-1，Na2MoO4·2H2O2.5mg·L-1，NiCl2·2H2O1.5mg·L-1，ZnCl22.1mg·L-1。
(3)在充滿氮氣的厭氧箱內(nèi)按水土質(zhì)量比為200～250∶1的比例向厭氧瓶內(nèi)接入步驟(1)馴化的土壤，按體積比7500～8000∶1的比例加入BTEX，按質(zhì)量比為25～30∶1的比例加入電子受體，按質(zhì)量比為200～250∶1的比例加入硫化鈉。
(4)將厭氧瓶在溫度為20±2℃、轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中培養(yǎng)7～9天后，按接種體積比為200～250∶1的比例轉(zhuǎn)入另一厭氧瓶內(nèi)，當轉(zhuǎn)接次數(shù)大于9之后即可獲得去除BTEX的降解菌群。
所述電子受體為硝酸鈉或硫酸鈉或三氯化鐵。
本發(fā)明的有益效果是所述的方法能夠馴化篩選到厭氧降解性能好的微生物菌群，對BTEX的最大降解速率范圍為1.6～3.5mg·L-1·d-1。
具體實施例方式
本發(fā)明提供一種苯系物厭氧降解菌群的馴化篩選方法及應(yīng)用。在污染的土壤中按質(zhì)量比加入水、硫化鈉、硝酸鈉和BTEX混合物，密封后進行土壤馴化。3個月后在充滿氮氣的厭氧箱內(nèi)按水、土的質(zhì)量比向按比例加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液和維生素c溶液的厭氧瓶內(nèi)接入馴化的土壤，并且按質(zhì)量比加入BTEX、加入硝酸鈉或硫酸鈉、加入硫化鈉。在溫度為20±2℃、轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中培養(yǎng)7～9天后，來回換并，在大于9次后即可得到去除BTEX的降解菌群。
所述BTEX厭氧降解菌群中的主要菌種有Thauera sp.[1]，Azoarcus sp.[2]，Thauera aroma tica[3]，Dechloromonas[4]這些菌種名稱相同的參考文獻(原文請查閱附件中的PDF文獻)[1]Shinoda Y，Sakai Y，Uenishi H，et al.2004.Aerobic and AnaerobicToluene Degradation by a Newly Isolated Denitrifying Bacterium，Thauerasp. Strain DNT-1. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，70(3)1385-1392[2]Beller H R and Edwards E A，2000.Anaerobic Toluene Activationby Benzylsuccinate Synthase in a Highly Enriched Methanogenic Culture.APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，66(12)5503-5505[3]Leutwein C and Heider J，1999.Anaerobic toluene-catabolic pathwayin denitrifyingThauera aromaticaactivation and b-oxidation of the firstintermediate，(R)-(M)-benzylsuccinate.Microbiology，145，3265-3271[4]Coates J D，Chakraborty R，Lack J G et al.，2001.Anaerobic benzeneoxidation coupled to nitrate reduction in pure culture by two strains ofDechloromonas.Nature，4111039-1043.
下面是以運用馴化的混合菌群進行了苯系化合物(BTEX)的厭氧降解試驗進一步說明本發(fā)明。
實施例1運用本發(fā)明方法馴化的混合菌群在硝酸鹽還原條件下進行了苯系化合物(BTEX)的厭氧降解試驗，結(jié)果表明混合菌群能夠?qū)Ρ健⒓妆?、乙苯、鄰二甲苯、間二甲苯和對二甲苯進行有效的厭氧降解。當初始濃度小于100mg/L時，60天后能降解到0.2mg/L以下。苯、甲苯、乙苯、鄰二甲苯、間二甲苯和對二甲苯的最大厭氧降解速率分別為(菌體濃度為108個/mL)2.44mg·L-1·d-1；3.54mg·L-1·d-1；3.43mg·L-1·d-1；2.73mg·L-1·d-1；2.84mg·L-1·d-1及2.54mg·L-1·d-1。
實施例2運用本發(fā)明方法馴化的混合菌群在硫酸鹽還原條件下進行了苯系化合物(BTEX)的厭氧降解試驗，結(jié)果表明混合菌群能夠?qū)Ρ?、甲苯、乙苯、鄰二甲苯、間二甲苯和對二甲苯進行有效的厭氧降解。當初始濃度小于100mg/L時，70天后能降解到0.2mg/L以下。苯、甲苯、乙苯、鄰二甲苯、間二甲苯和對二甲苯的厭氧降解速率分別為(菌體濃度為108個/mL)2.23mg·L-1·d-1，3.31mg·L-1·d-1，3.08mg·L-1·d-1，2.52mg·L-1·d-1，2.71mg·L-1·d-1及2.11mg·L-1·d-1。
實施例3運用本發(fā)明方法馴化的混合菌群在Fe3+還原條件下進行了苯系化合物(BTEX)的厭氧降解試驗，結(jié)果表明混合菌群能夠?qū)Ρ健⒓妆?、乙苯、鄰二甲苯、間二甲苯和對二甲苯進行有效的厭氧降解。當初始濃度小于100mg/L時，80天后能降解到0.2mg/L以下。苯、甲苯、乙苯、鄰二甲苯、間二甲苯和對二甲苯的厭氧降解速率分別為(菌體濃度為108個/mL)1.87mg·L-1·d-1，2.68mg·L-1·d-1，2.42mg·L-1·d-1，2.06mg·L-1·d-1，2.21mg·L-1·d-1及1.63mg·L-1·d-1。
權(quán)利要求
1.一種苯系物厭氧降解菌群的馴化篩選方法，其特征在于，該方法的具體步驟如下(1)選用受石油污染的土壤，按質(zhì)量比為1～1.5∶1的比例加入去離子水，按質(zhì)量比為150～200∶1的比例加入硫化鈉，按質(zhì)量比為2000～2500∶1的比例加入BTEX混合物，按質(zhì)量比為100～150∶1的比例加入電子受體，混合均勻后密封靜置時間大于3個月；(2)在充滿氮氣的厭氧箱內(nèi)向體積為50～200mL的厭氧瓶中按800∶5∶1的比例加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液和維生素c溶液，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為NH4Cl1.0g·L-1，KH2PO41.0g·L-1，MgCl20.1g·L-1，CaCl2·2H2O0.05g·L-1；微量金屬液的組成為CoCl2·6H2O30mg·L-1，CuCl20.15mg·L-1，H3BO35.7mg·L-1，MnCl2·4H2O20mg·L-1，Na2MoO4·2H2O2.5mg·L-1，NiCl2·2H2O1.5mg·L-1，ZnCl22.1mg·L-1；(3)在充滿氮氣的厭氧箱內(nèi)按水土質(zhì)量比為200～250∶1的比例向厭氧瓶內(nèi)接入步驟(1)馴化的土壤，按體積比7500～8000∶1的比例加入BTEX，按質(zhì)量比為25～30∶1的比例加入電子受體，按質(zhì)量比為200～250∶1的比例加入硫化鈉；(4)將厭氧瓶在溫度為20±2℃、轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中培養(yǎng)7～9天后，按接種體積比為200～250∶1的比例轉(zhuǎn)入另一厭氧瓶內(nèi)，當轉(zhuǎn)接次數(shù)大于9之后即可獲得去除BTEX的降解菌群。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述苯系物厭氧降解菌群的馴化篩選方法，其特征在于，所述電子受體為硝酸鈉、硫酸鈉或三氯化鐵。
3.一種權(quán)利要求1所述苯系物厭氧降解菌群的應(yīng)用，其特征在于，運用馴化的混合菌群或混合菌群在硝酸鹽還原條件下進行了苯系化合物(BTEX)的厭氧降解試驗，結(jié)果表明混合菌群能夠?qū)Ρ?、甲苯、乙苯、鄰二甲苯、間二甲苯和對二甲苯進行有效的厭氧降解；當初始濃度小于100mg/L時，60天后能降解到0.2mg/L以下；苯、甲苯、乙苯、鄰二甲苯、間二甲苯和對二甲苯(菌體濃度為108個/mL)2.44mg·L-1·d-1；3.54mg·L-1·d-1；3.43mg·L-1·d-1；2.73mg·L-1·d-1；2.84mg·L-1·d-1及2.54mg·L-1·d-1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述苯系物厭氧降解菌群的應(yīng)用，其特征在于，運用本發(fā)明方法馴化的混合菌群在硫酸鹽還原條件下進行了苯系化合物(BTEX)的厭氧降解試驗，結(jié)果表明混合菌群能夠?qū)Ρ?、甲苯、乙苯、鄰二甲苯、間二甲苯和對二甲苯進行有效的厭氧降解；當初始濃度小于100mg/L時，70天后能降解到0.2mg/L以下；苯、甲苯、乙苯、鄰二甲苯、間二甲苯和對二甲苯(菌體濃度為108個/mL)2.23mg·L-1·d-1，3.31mg·L-1·d-1，3.08mg·L-1·d-1，2.52mg·L-1·d-1，2.71mg·L-1·d-1及2.11mg·L-1·d-1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述苯系物厭氧降解菌群的應(yīng)用，其特征在于，運用本發(fā)明方法馴化的混合菌群在Fe3+還原條件下進行了苯系化合物(BTEX)的厭氧降解試驗，結(jié)果表明混合菌群能夠?qū)Ρ?、甲苯、乙苯、鄰二甲苯、間二甲苯和對二甲苯進行有效的厭氧降解；當初始濃度小于100mg/L時，80天后能降解到0.2mg/L以下；苯、甲苯、乙苯、鄰二甲苯、間二甲苯和對二甲苯的厭氧降解速率分別為(菌體濃度為108個/mL)1.87mg·L-1·d-1，2.68mg·L-1·d-1，2.42mg·L-1·d-1，2.06mg·L-1·d-1，2.21mg·L-1·d-1及1.63mg·L-1·d-1。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于受污染土壤與水的生物降解處理技術(shù)領(lǐng)域的一種苯系物厭氧降解菌群的馴化篩選方法及應(yīng)用。在污染的土壤中按質(zhì)量比加入電子受體、硫化鈉和BTEX混合物，密封靜置3個月后在充滿氮氣的厭氧箱內(nèi)按比例加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液和維生素c溶液的混合液，進行土壤馴化，在充滿氮氣的厭氧箱內(nèi)按水、土的質(zhì)量比向厭氧瓶內(nèi)接入馴化的土壤，并且按質(zhì)量比加入BTEX、加入電子受體、加入硫化鈉。在溫度為20±2℃、在旋轉(zhuǎn)的振蕩器中培養(yǎng)7～9天后，循環(huán)9次以上，即可得到去除BTEX的降解菌群。本方法能夠馴化篩選到厭氧降解性能好的微生物菌群，對BTEX的降解速率范圍為1.6～3.5mg·L
文檔編號C02F11/04GK101016532SQ20071006309
公開日2007年8月15日 申請日期2007年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月26日
發(fā)明者劉翔, 豆俊峰, 鄧棟 申請人:清華大學(xué)