專利名稱：一種快速篩選具有吸附特性的多環(huán)芳烴降解菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及污染土壤的微生物修復技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種利用吸附性載體篩選多環(huán)芳烴降解菌的新方法。
背景技術(shù)：
多環(huán)芳烴是一大類環(huán)境有機污染物，具有致癌、致畸、致突變的作用，其中有16種被美國環(huán)保署列為優(yōu)先污染物。消除多環(huán)芳烴的污染，對于改善環(huán)境、提高人民生活質(zhì)量有很重要的意義。環(huán)境中的多環(huán)芳烴主要靠微生物降解，所以篩選高效降解菌是多環(huán)芳烴污染土壤生物修復技術(shù)的一個關(guān)鍵。目前，傳統(tǒng)的方法是采用液體搖瓶培養(yǎng)法篩選降解菌株。這種方法的主要缺點是僅篩選到在懸浮液體中快速生長的微生物類群，具有吸附能力的降解菌很難篩選到，而污染環(huán)境中污染物大都吸附在固體顆粒物上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種真實可靠、快速高效篩選多環(huán)芳烴降解菌的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種快速篩選具有吸附特性的多環(huán)芳烴降解菌的方法，結(jié)合多環(huán)芳烴水溶性很低、極易吸附在顆粒物上的特性，利用吸附性載體富集多環(huán)芳烴降解菌，采用雙層平板法進行初篩，并用高效液相色譜技術(shù)測定其對多環(huán)芳烴的降解效率，最終篩選到高效降解菌。
1、污染土壤樣品的采取和預(yù)處理采取0-20cm深度土壤樣品，過1mm篩，4℃保存。
2、利用吸附性載體富集及分離降解菌在三角瓶內(nèi)添加吸附性載體，其加入量以遮蓋住三角瓶底部為宜(10-20g)，用紗布包好，于121℃，濕熱滅菌20分鐘。將1mg/mL的多環(huán)芳烴丙酮溶液50uL噴灑在載體上，靜置2h，使丙酮自然揮發(fā)，最后加入40mL無機鹽培養(yǎng)基和10mL土壤懸液，30℃避光搖床培養(yǎng)。每10天取3～4g載體轉(zhuǎn)接到新鮮配制的含載體的無機鹽液體培養(yǎng)基中。30天后將載體取出，用無菌水沖洗掉土壤顆粒和非吸附的菌體，置于以多環(huán)芳烴為唯一碳源的含制霉菌素的無機鹽固體培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)4～6天。將載體周圍菌苔刮下，在上述平板上劃線分離單菌落，斜面保存。其中，吸附性載體可以為改善土壤質(zhì)地常用的珍珠巖、稻殼等。
土壤懸液的制備如下稱土樣0.5g，迅速倒入帶玻璃珠的49.5mL無菌水瓶中(玻璃珠的用量以充滿瓶底為最好)，振蕩5～10分鐘，使土樣充分打散，即成為10-2的土壤懸液。
無機鹽液體培養(yǎng)基的組成如下K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O 4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O 1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸餾水中；pH 7.0±0.2；含載體的無機鹽液體培養(yǎng)基的具體組成如下在三角瓶內(nèi)先添加吸附性載體，其加入量以遮蓋住三角瓶底部為宜(10-20g)，用紗布包好121℃濕熱滅菌20分鐘；待其冷卻后，將1mg/mL的多環(huán)芳烴丙酮溶液50uL噴灑在載體上，靜置2h，使丙酮自然揮發(fā)，然后加入50mL無機鹽液體培養(yǎng)基。
以多環(huán)芳烴為唯一碳源的含制霉菌素的無機鹽固體培養(yǎng)基平板的組成如下K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O 0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O 1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸餾水中，加入20g瓊脂；pH 7.0±0.2。分裝在4個500mL的三角瓶中，每個三角瓶裝250mL培養(yǎng)基于121℃濕熱滅菌20分鐘。倒平板時，每個三角瓶中加入12.5mg的制霉菌素，0.25mg多環(huán)芳烴并搖勻。
所用的多環(huán)芳烴可以為菲，芘，熒蒽，苯并芘等。
3、降解菌的初篩采用雙層平板法進行降解菌的初篩。雙層板下層為無機鹽固體培養(yǎng)基，上層為多環(huán)芳烴唯一碳源無機鹽固體培養(yǎng)基。接菌于雙層板上，30℃培養(yǎng)6-10天，在紫外燈下觀察，若多環(huán)芳烴被降解，則該菌落周圍培養(yǎng)基在紫外光下的吸收減弱，表現(xiàn)為菌體周圍產(chǎn)生有非曝亮的暗圈。其中，無機鹽固體培養(yǎng)基的組成為K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O 4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O 1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸餾水中，加入20g瓊脂；pH 7.0±0.2。
多環(huán)芳烴唯一碳源無機鹽固體培養(yǎng)基的組成如下K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O 0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O 4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O 1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸餾水中，加入20g瓊脂；pH 7.0±0.2。分裝在4個500mL的三角瓶中，每個三角瓶裝250mL培養(yǎng)基于121℃濕熱滅菌20分鐘。倒平板時，每個三角瓶中加入12.5mg的制霉菌素，0.25mg多環(huán)芳烴并搖勻。
4、降解菌的復篩將初篩降解菌株接入以多環(huán)芳烴為唯一碳源的無機鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天，過濾收集菌體，用無菌水洗滌菌體2次，用新鮮配制的無機鹽液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌體濃度為OD660＝0.3，取1mL菌懸液接入裝有9mL無機鹽液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶預(yù)先加入1mg·mL-1的多環(huán)芳烴丙酮溶液10uL，如菲、芘、苯并芘等，并將丙酮揮發(fā)掉，培養(yǎng)基中多環(huán)芳烴的最終濃度為1mg·L-1。30℃避光搖床培養(yǎng)10天，培養(yǎng)基中剩余的多環(huán)芳烴采用高效液相色譜(HPLC)方法測定。最終選取降解率高的菌株作為高效降解菌。其中，多環(huán)芳烴唯一碳源的液體無機鹽培養(yǎng)基的組成為K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O 0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O 4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O 1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸餾水中，加入20g瓊脂；pH 7.0±0.2。分裝在4個500mL的三角瓶中，每個三角瓶裝250mL培養(yǎng)基于121℃濕熱滅菌20分鐘。倒平板時，每個三角瓶中加入12.5mg的制霉菌素，0.25mg多環(huán)芳烴并搖勻。
無機鹽液體培養(yǎng)基的組成為K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O 4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O 1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸餾水中。
本發(fā)明的根據(jù)是多環(huán)芳烴的特性四環(huán)或四環(huán)以上的大分子多環(huán)芳烴水溶性很低，極易吸附在固體顆粒物上，而在這些顆粒物表面的微環(huán)境中可能含有利用多環(huán)芳烴的降解菌。影響土壤環(huán)境中多環(huán)芳烴降解的主要原因是這些化合物水溶性很低，極易吸附在土壤顆粒上，導致這些化合物的生物可利用性很低。但由于這些化合物與載體上吸附的細菌同處于一個與液體環(huán)境十分不同的微環(huán)境中，因此比較容易被載體上吸附的細菌利用。吸附性載體篩菌法是一種高效率的多環(huán)芳烴降解菌的篩選方法。本發(fā)明所述方法的要點是在三角瓶內(nèi)添加吸附性載體及多環(huán)芳烴，并使其吸附，然后添加無機鹽培養(yǎng)液，并接種污染土壤，搖床培養(yǎng)；富集分離后的菌株再利用雙層平板法初篩和測定其多環(huán)芳烴實際降解效率復篩來確定其是否為我們需要的菌株。
本發(fā)明的有益效果是1、本發(fā)明利用吸附性載體培養(yǎng)分離降解菌，利用雙層平板技術(shù)進行初篩，最終根據(jù)降解效率篩選降解菌株。初篩和復篩相結(jié)合，大大提高了篩選效率。
2、本發(fā)明將多環(huán)芳烴降解菌的吸附特性與多環(huán)芳烴的吸附性結(jié)合起來，使篩選降解菌的實際利用價值提高。
3、本發(fā)明選用的吸附性載體篩菌法，為以后的菌劑的制備提供了便利條件，非常適合投入實際應(yīng)用中。
具體實施例方式
本發(fā)明以石油污染土壤為研究對象，四環(huán)結(jié)構(gòu)的芘作為代表性多環(huán)芳烴，具體操作步驟如下1、土壤樣品的采集和處理采取石油污染土壤的0-20cm土層，1mm篩，4℃保存。
2、利用吸附性載體富集及分離降解菌將吸附性載體15g用紗布包好，置于三角瓶中滅菌(121℃濕熱滅菌20min)，然后將1mg/mL芘丙酮溶液50uL噴灑在載體上，靜置2h，使丙酮自然揮發(fā)，最后加入40mL無機鹽液體培養(yǎng)基和10mL土壤懸液，30℃避光搖床培養(yǎng)。每10天取3-4g載體轉(zhuǎn)接到新鮮配制的含載體的無機鹽液體培養(yǎng)基中。30天后將載體取出，用無菌水沖洗土壤顆粒和非吸附的菌體，置于以芘為唯一碳源的含制霉菌素的無機鹽固體培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)4～6天。將載體周圍菌苔刮下，在上述平板上劃線分離單菌落，斜面保存。其中，吸附性載體可以為改善土壤質(zhì)地常用的珍珠巖、稻殼等。
土壤懸液的制備如下稱土樣0.5g，迅速倒入帶玻璃珠的49.5mL無菌水瓶中(玻璃珠的用量以充滿瓶底為最好)，振蕩5～10分鐘，使土樣充分打散，即成為10-2的土壤懸液。
無機鹽液體培養(yǎng)基的組成如下K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O 4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O 1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸餾水中；pH 7.0±0.2；含載體的無機鹽液體培養(yǎng)基的組成在三角瓶內(nèi)先添加吸附性載體，其加入量以遮蓋住三角瓶底部為宜(15g)，用紗布包好，121℃濕熱滅菌20min；待其冷卻后，將1mg/mL的芘丙酮溶液50uL噴灑在載體上，靜置2h，使丙酮自然揮發(fā)，然后加入50mL無機鹽液體培養(yǎng)基。
以芘為唯一碳源的含制霉菌素的無機鹽固體培養(yǎng)基的組成為K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O 0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O 4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O 1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸餾水中，加入20g瓊脂；pH 7.0±0.2。分裝在4個500mL的三角瓶中，每個三角瓶裝250mL培養(yǎng)基于121℃濕熱滅菌20min。倒平板時，每個三角瓶中加入12.5mg的制霉菌素，0.25mg芘并搖勻。
3、降解菌株的初篩采用常規(guī)的雙層平板法進行降解菌的初篩。雙層板下層為無機鹽固體培養(yǎng)基，上層為芘唯一碳源無機鹽固體培養(yǎng)基。接菌于雙層板上，30℃培養(yǎng)6-10天，在紫外燈下觀察，若芘被降解，則該菌落周圍培養(yǎng)基在紫外光下的吸收減弱，表現(xiàn)為菌體周圍產(chǎn)生有非曝亮的暗圈。其中，無機鹽固體培養(yǎng)基的具體組成K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O 4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O 1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸餾水中，加入20g瓊脂；pH 7.0±0.2。
芘唯一碳源無機鹽固體培養(yǎng)基的具體組成為K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O 0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O 4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸餾水中，加入20g瓊脂；pH 7.0±0.2。分裝在4個500mL的三角瓶中，每個三角瓶裝250mL培養(yǎng)基于121℃濕熱滅菌20min。倒平板時，每個三角瓶中加入12.5mg的制霉菌素，0.25mg芘并搖勻。
4、根據(jù)降解率進行復篩將初篩中菌體周圍產(chǎn)生有非曝亮暗圈的菌株作為進入復篩依據(jù)。將初篩降解菌株接入以芘為唯一碳源的無機鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天，過濾收集菌體，用無菌水洗滌菌體2次，用新鮮配制的無機鹽液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌體濃度為OD660＝0.3，取1mL菌懸液接入裝有9mL無機鹽培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶預(yù)先加入1mg·mL-1的芘丙酮溶液10uL，并將丙酮揮發(fā)掉，培養(yǎng)基中芘的最終濃度為1mg·L-1。30℃避光搖床培養(yǎng)10天，剩余的芘采用HPLC方法測定菌株對芘的降解率。最終得到4株降解率高的菌株，降解率為別為56％，51％，30％，29％。其中，芘唯一碳源無機鹽液體培養(yǎng)基的具體組成為K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O 0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O 4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸餾水中，加入20g瓊脂；pH 7.0±0.2。分裝在4個500mL的三角瓶中，每個三角瓶裝250mL培養(yǎng)基于121℃濕熱滅菌20min。倒平板時，每個三角瓶中加入12.5mg的制霉菌素，0.25mg芘并混勻。
無機鹽液體培養(yǎng)基的具體組成為K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O 4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O 1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸餾水中，pH 7.0±0.2。
權(quán)利要求
1.一種快速篩選具有吸附特性的多環(huán)芳烴降解菌的方法，其特征在于結(jié)合多環(huán)芳烴水溶性很低、極易吸附在顆粒物上的特性，利用吸附性載體富集及分離多環(huán)芳烴降解菌，采用雙層平板法進行初篩，并用高效液相色譜技術(shù)測定其對多環(huán)芳烴的降解效率，最終從污染土壤中篩選到高效降解菌。
2.按照權(quán)利要求1所述的快速篩選具有吸附特性的多環(huán)芳烴降解菌的方法，其特征在于，土壤樣品的采集和處理，包括采取0～20cm深度的土壤樣品，過1mm篩，4℃保存。
3.按照權(quán)利要求1所述的快速篩選具有吸附特性的多環(huán)芳烴降解菌的方法，其特征在于，多環(huán)芳烴降解菌的富集及分離，包括在三角瓶內(nèi)添加吸附性載體，以載體遮蓋住三角瓶底部為宜，用紗布包好，并于121℃濕熱滅菌20min；將1mg/mL的多環(huán)芳烴丙酮溶液50uL噴灑在載體上，靜置2h，使丙酮自然揮發(fā)，最后加入40mL無機鹽液體培養(yǎng)基和10mL土壤懸液，30℃避光搖床培養(yǎng)；每10天取3g-4g載體轉(zhuǎn)接到新鮮配制的含載體無機鹽液體培養(yǎng)基中；30天后將載體取出，用無菌水沖洗土壤顆粒和非吸附的菌體，置于以多環(huán)芳烴為唯一碳源的含制霉菌素的無機鹽固體培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)4～6天；將載體周圍菌苔刮下，在上述平板上劃線分離單菌落，斜面保存；其中，無機鹽液體培養(yǎng)基的組成如下K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O 4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O 1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸餾水中；pH 7.0±0.2；含載體的無機鹽液體培養(yǎng)基的組成如下在三角瓶內(nèi)先添加吸附性載體，加入量以載體遮蓋住三角瓶底部為宜，用紗布包好121℃濕熱滅菌20min；待其冷卻后，將1mg/mL的多環(huán)芳烴丙酮溶液50uL噴灑在載體上，靜置2h，使丙酮自然揮發(fā)，然后加入50mL無機鹽液體培養(yǎng)基；以多環(huán)芳烴為唯一碳源的含制霉菌素的無機鹽固體培養(yǎng)基的組成如下K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O 0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O 1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸餾水中，加入20g瓊脂，pH 7.0±0.2；分裝在4個500mL的三角瓶中，每個三角瓶裝250mL培養(yǎng)基，121℃濕熱滅菌20分鐘；倒平板時，每個三角瓶中加入12.5mg的制霉菌素、0.25mg多環(huán)芳烴并混勻。
4.按照權(quán)利要求1所述的快速篩選具有吸附特性的多環(huán)芳烴降解菌的方法，其特征在于，采用雙層平板法進行多環(huán)芳烴降解菌的初篩，包括雙層板下層為無機鹽固體培養(yǎng)基，上層為多環(huán)芳烴唯一碳源無機鹽固體培養(yǎng)基；接菌于雙層板上，30℃培養(yǎng)6-10天，在紫外燈下觀察，若多環(huán)芳烴被降解，則該菌落周圍培養(yǎng)基在紫外光下的吸收減弱，菌體周圍有非曝亮的暗圈；其中，無機鹽固體培養(yǎng)基的組成如下K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O 4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O 1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸餾水中，加入20g瓊脂；pH 7.0±0.2；多環(huán)芳烴唯一碳源無機鹽固體培養(yǎng)基的組成如下K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O 0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O 4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O 1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸餾水中，加入20g瓊脂，pH 7.0±0.2；分裝在4個500mL的三角瓶中，每個三角瓶裝250mL培養(yǎng)基，121℃濕熱滅菌20分鐘；倒平板前，添加多環(huán)芳烴0.25mg，并搖勻。
5.按照權(quán)利要求1所述的快速篩選具有吸附特性的多環(huán)芳烴降解菌的方法，其特征在于，根據(jù)菌株在以多環(huán)芳烴為唯一碳源的無機鹽液體培養(yǎng)基中的降解率作為復篩的依據(jù)，包括將初篩降解菌株接入以多環(huán)芳烴為唯一碳源的無機鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天，過濾收集菌體，用無菌水洗滌菌體2次，用新鮮配制的無機鹽液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌體濃度為OD660＝0.3，取1mL菌懸液接入裝有9mL無機鹽液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶預(yù)先加入1mg·mL-1的多環(huán)芳烴丙酮溶液10uL，并將丙酮揮發(fā)掉，培養(yǎng)基中多環(huán)芳烴的最終濃度為1mg·L-1，30℃避光搖床培養(yǎng)10天，剩余的多環(huán)芳烴采用高效液相色譜方法HPLC測定，最終選取降解率高的菌株作為高效降解菌；其中，以多環(huán)芳烴為唯一碳源的無機鹽液體培養(yǎng)基的組成如下K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O 0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O 4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O 1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸餾水中，加入20g瓊脂，pH 7.0±0.2；分裝在4個500mL的三角瓶中，每個三角瓶裝250mL培養(yǎng)基，于121℃濕熱滅菌20分鐘；倒平板前，添加多環(huán)芳烴0.25mg，并搖勻；無機鹽液體培養(yǎng)基的組成如下K2HPO41g；KH2PO41g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl215mg；FeSO4·7H2O 2mg；CuSO4·5H2O0.4mg；KI 1mg；MnSO4·H2O 4mg；H3BO35mg；CoCl2·6H2O 1mg；Na2MoO4·2H2O 2mg；NiCl2·6H2O 2mg，溶于1L蒸餾水中；pH 7.0±0.2。
6.按照權(quán)利要求3所述的快速篩選具有吸附特性的多環(huán)芳烴降解菌的方法，其特征在于載體是改善土壤質(zhì)地常用的珍珠巖、稻殼。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物修復的技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種利用吸附性載體篩選多環(huán)芳烴降解菌株的新方法。本發(fā)明的根據(jù)是多環(huán)芳烴的特性四環(huán)或四環(huán)以上的大分子多環(huán)芳烴水溶性很低，極易吸附在固體顆粒物上，而在這些顆粒物表面的微環(huán)境中可能含有利用多環(huán)芳烴的降解菌。本發(fā)明的目的是提供一種可以快速、高效篩選具有吸附特性的多環(huán)芳烴降解菌的方法。本發(fā)明利用吸附性載體培養(yǎng)分離降解菌，利用雙層平板技術(shù)進行初篩，最終根據(jù)降解效率篩選降解菌株。初篩和復篩相結(jié)合，大大提高了篩選效率。
文檔編號B09C1/10GK101050421SQ20071001080
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日
發(fā)明者張穎, 王榮, 任瑞霞, 徐慧, 李慧, 史榮久 申請人:中國科學院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所