一種基于ssr標(biāo)記的京紅4號蘿卜雜交種純度鑒定的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種京紅4號蘿卜雜交種純度鑒定的引物序列及檢測方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘿卜在中國栽培歷史悠久，分布廣泛，品種類型十分豐富，在我國蔬菜生產(chǎn)供應(yīng)中 占有重要地位。但是，目前蘿卜種子經(jīng)營單位越來越多，種子質(zhì)量參差不齊，嚴(yán)重干擾了蘿 卜種業(yè)的健康發(fā)展。在蘿卜Fl代雜交種制種過程中由于生物學(xué)混雜和機械混雜等原因造 成雜交種純度降低現(xiàn)象時有發(fā)生，給種子生產(chǎn)者和經(jīng)營者造成巨大經(jīng)濟損失。傳統(tǒng)的種子 純度鑒定方法都是在田間進行，觀察主要發(fā)育階段品種的特征特性及一致性，存在周期長、 工作量大等缺陷。此外由于田間純度檢測周期長，造成當(dāng)年生產(chǎn)的雜交種往往要等到次年 才能銷售，不但會造成庫存壓力，還會錯失商機。
[0003] 近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記正逐漸成為分析生物 遺傳多樣性的有力工具，因其具有不受環(huán)境影響、測試周期短、供選擇的標(biāo)記數(shù)量多、可以 進行高通量測試分析的優(yōu)勢，已經(jīng)大規(guī)模用于種子純度鑒定及品種真?zhèn)涡缘臋z測。尤其是 微衛(wèi)星（SSR)標(biāo)記技術(shù)具有共顯性、多態(tài)性好、重復(fù)性好、實驗操作簡單等優(yōu)點被廣泛應(yīng) 用。
[0004] "京紅4號"是北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研宄中心育成的紅皮系列蘿卜品種之一， 具有肉質(zhì)根皮色粉紅、根形圓正、抗病性強、熟食品質(zhì)佳等優(yōu)點，適于華北、東北地區(qū)秋季種 植。該品種種植面積不斷擴大，種子需求量和制種面積也相應(yīng)增加，快速鑒定雜交種純度將 有利于該品種的進一步推廣應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測京紅4號蘿卜雜交種純度的引物序列。
[0006] 本發(fā)明的再一目的在于提供一種利用上述引物進行京紅4號蘿卜雜交種純度鑒 定的方法。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] -對用于檢測京紅4號蘿卜雜交種純度的引物序列，包括核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No. 1?2所示序列。
[0009] 利用上述引物進行京紅4號蘿卜雜交種純度鑒定，方法包括如下步驟：
[0010] (1)提取待測樣品京紅4號雜交種基因組DNA ;
[0011] (2)采用序列表SEQ ID No. 1?2所示引物進行PCR擴增；
[0012] (3)將步驟（2)中的擴增產(chǎn)物經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染法染色，照相 并統(tǒng)計結(jié)果；
[0013] (4)利用步驟（3)的統(tǒng)計結(jié)果計算京紅4號蘿卜雜交種的純度。
[0014] 所述步驟（1)是采用堿裂解法快速提取待測京紅4號蘿卜雜交種基因組DNA :取 種子下胚軸（發(fā)芽72小時）置于2. OmL離心管中；加入0· 4mol T1NaOH溶液100 μ 1，鋼珠 2個；在48孔研磨器上研磨Imin ;輕甩離心后，放于沸水中溫浴Imin ; IOOOOrmp離心Imin ; 取上清液10 μ 1放入96孔PCR板中，加200 μ I Tris緩沖液（PH = 8. 0)，混勻備用。
[0015] 所述步驟（2)為PCR擴增：采用如序列表SEQ ID No. 1?2所示引物，反應(yīng)體系為： Ιμ? 10 X Buffer (含 Mg2+)，0.8 μ? 2. 5mM dNTP，IU Taq DNA聚合酶，10 μ M SSR 上下游引 物各加0. 5 μ 1，模板DNA 2 μ 1，CldH2O補足10 μ I ;PCR反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min ;35個 擴增循環(huán)，94°C 30sec，60°C 30sec，72°C Imin ;72°C延伸 7min，4°C保存。
[0016] 所述步驟（3)擴增產(chǎn)物的檢測：在步驟⑵的擴增產(chǎn)物中加入2 μ I上樣緩沖 液，經(jīng)10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳緩沖液為1XTBE，每個點樣孔加2 μ 1樣 品，120V恒壓下電泳60分鐘。電泳結(jié)束后利用銀染法染色。先將凝膠放入固定液（450mL H20+50mL無水乙醇+2. 5mL冰醋酸），在搖床上輕搖12min，回收固定液待用；加入銀染液 (500ml H2CHlg硝酸銀），輕搖12min ;倒掉銀染液，用500ml蒸餾水洗30s，清洗兩次；清洗 后，倒掉蒸餾水加入顯色液（500ml H20+7. 5gNa0H+1500 μ 1甲醛），輕搖至DNA條帶顯出為 止；當(dāng)條帶清晰時，倒掉顯影液，加入固定液，固定2分鐘；倒掉固定液，用蒸餾水漂洗5分 鐘；照相并統(tǒng)計帶型。比較京紅4號雜交種及其雙親的特征譜帶，表現(xiàn)共顯性互補帶型的京 紅4號雜交種，只有親本帶型的為非雜交種，出現(xiàn)其他第三種帶型的為外來雜種；
[0017] (4)利用步驟（3)的統(tǒng)計結(jié)果計算供試京紅4號蘿卜雜交種純度：送檢測京紅4 號雜交種純度（％) =(總檢測種子粒數(shù)-非雜交種數(shù)-外來雜交種數(shù)）/總檢測種子粒 數(shù) Χ100%〇
[0018] 本發(fā)明的有益效果：
[0019] 本發(fā)明篩選獲得了一對能夠用于京紅4號蘿卜雜交種純度鑒定的引物，并提供了 京紅4號雜交種純度鑒定的方法。該檢測方法快捷、簡便、穩(wěn)定、可靠、成本低，可在3-4h之 內(nèi)完成京紅4號種子純度鑒定工作，有利于京紅4號種子高效準(zhǔn)確的質(zhì)量控制。
【附圖說明】
[0020] 圖1、SSR2202在京紅4號雜交種及其雙親中的擴增圖。
[0021] 圖2、SSR2202在京紅4號雜交種中的擴增圖（1?36個單株）。
【具體實施方式】
[0022] 下面結(jié)合附圖及最佳實施方式對本發(fā)明做進一步說明，以使公眾對
【發(fā)明內(nèi)容】
有整 體和充分的了解，而并非對本發(fā)明保護范圍的限定?！揪唧w實施方式】如下：
[0023] -、材料和方法
[0024] I. 1 材料
[0025] 引物篩選所用材料包括京紅4號雜交種、母本、父本各8個單株。
[0026] 京紅4號雜交種純度鑒定所用材料為，制種基地10家農(nóng)戶生產(chǎn)的京紅4號蘿卜雜 交種，每戶隨機取100粒種子。
[0027] L 2研宄方法
[0028] L 2. 1基因組DNA的提取
[0029] 種子發(fā)芽72小時后，取下胚軸置于2. OmL離心管中；加入0. 4mol T1NaOH溶 液100 μ 1，鋼珠2個；在48孔研磨器上研磨Imin ;輕甩離心后，放于沸水中溫浴Imin ; IOOOOrmp離心Imin ;取上清液10 μ 1放入96孔PCR板中，加200 μ I Tris緩沖液（PH = 8.0)，混勻備用。
[0030] L 2. 2 PCR擴增與檢測
[0031] 篩選獲得一對能夠用于京紅4號雜交種純度鑒定的特異引物。
[0032] 表1可用于京紅4號雜交種純度檢測的引物序列
[0033]
【主權(quán)項】
1. 一種用于京紅4號蘿卜雜交種純度鑒定的引物序列，其特征在于，所述引物核苷酸 序列如序列表SEQ ID No. 1?2所示引物。
2. 利用權(quán)利要求1中所述引物，檢測京紅4號蘿卜雜交種純度的方法，其特征包括以下 步驟： ⑴快速提取京紅4號蘿卜雜交種基因組DNA :取種子下胚軸（種子發(fā)芽72小時）置于 2. OmL離心管中；加入0. 4mol L4NaOH溶液100 μ 1，鋼珠2個；在48孔研磨器上研磨Imin ; 輕甩離心后，放于沸水中溫浴Imin ; IOOOOrmp離心Imin ;取上清液10 μ 1放入96孔PCR板 中，加200 μ I Tris緩沖液（PH = 8. 0)，混勻備用。 (2) 采用如序列表SEQ ID No. 1?2所示引物進行PCR擴增：反應(yīng)體系為：1 μ 1 10父81^€61'(含]\%2+)，0.84 12.51111(1階13，川了39〇嫩聚合酶，1(^]\1551?上下游引物各加 〇. 5 μ 1，模板DNA 2 μ 1，CldH2O補足至10 μ I ;PCR反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min ;35個擴增 循環(huán)，94°C 30sec，6(TC 30sec，72°C Imin ;72°C延伸 7min，4°C保存； (3) 將步驟（2)的擴增產(chǎn)物經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染法染色，照相并統(tǒng) 計結(jié)果，比較京紅4號雜交種及其雙親的特征譜帶，表現(xiàn)共顯性互補帶型的為京紅4號雜交 種，只有親本之一帶型的為非雜交種，出現(xiàn)其他第三種帶型的為外來雜種； (4) 利用步驟（3)的統(tǒng)計結(jié)果計算供試京紅4號蘿卜雜交種純度：送檢測京紅4號雜交 種純度（％) =(總檢測種子粒數(shù)-非雜交種數(shù)-外來雜種數(shù)）/總檢測種子粒數(shù)X 100%。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測京紅4號蘿卜雜交種純度的引物序列及方法。該引物序列是序列表SEQ？ID1～2所述的核苷酸序列，該引物在雜交種中的擴增帶型為雙親的互補帶型，經(jīng)過對制種基地10家農(nóng)戶隨機抽樣檢測發(fā)現(xiàn)，SSR標(biāo)記檢測與田間結(jié)果相吻合。本發(fā)明具有快捷、簡便、穩(wěn)定、可靠、成本低等優(yōu)點，可在3-4h之內(nèi)可完成對京紅4號蘿卜雜交種純度鑒定工作，有很大的應(yīng)用價值。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104561319
【申請?zhí)枴緾N201510012415
【發(fā)明人】張麗, 王慶彪
【申請人】北京市農(nóng)林科學(xué)院
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月4日