一種檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒IgM抗體的ELISA試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒IgM抗體的ELISA試劑盒。該試劑盒包括：包被東部馬腦脊髓炎病毒抗原的酶標(biāo)反應(yīng)板、洗滌液、樣品稀釋液、辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗馬IgM二抗、底物溶液和終止液，其中所述東部馬腦脊髓炎病毒抗原為東部馬腦脊髓炎病毒的E2重組蛋白。本發(fā)明所述的試劑盒可快速檢測(cè)馬科動(dòng)物的東部馬腦脊髓炎病毒IgM抗體，使用安全。
【專利說明】—種檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒IgM抗體的ELISA試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及采用ELISA方法檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒抗體的試劑盒，尤指一種間接ELISA檢測(cè)IgM抗體的試劑盒，適用于對(duì)馬科動(dòng)物血清中的東部馬腦脊髓炎病毒IgM抗體進(jìn)行檢測(cè)，屬于動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]東部馬腦脊髓炎病毒(Easternequine encephalomyelitis virus, EEEV)是一種經(jīng)節(jié)肢動(dòng)物傳播的病毒，屬于披膜病毒科甲病毒屬。病毒可感染馬、鳥以及人類，可經(jīng)Aedes, Coquillettidia和Culiseta屬的蚊蟲盯咬傳播。該病毒在蚊蟲和鳥類之間循環(huán)傳播。馬匹感染之后致死率可達(dá)到90%。本病的診斷方法包括臨床檢查，病理學(xué)檢查，病毒分離和血清學(xué)檢測(cè)。但對(duì)于實(shí)驗(yàn)室而言，往往并不能得到有關(guān)臨床方面的信息，僅僅是接到獨(dú)立的血清，有時(shí)僅憑抗體效價(jià)很難確定其感染情況。
[0003]血凝抑制試驗(yàn)(HI)和病毒中和實(shí)驗(yàn)(VN)是診斷疑似病例的標(biāo)準(zhǔn)方法，但在本病的地方流行地區(qū)，馬匹往往接種過相關(guān)疫苗，使得實(shí)驗(yàn)室的血清學(xué)檢測(cè)工作復(fù)雜化。
[0004]研究表明，對(duì)于馬而言，感染本病后3天就可檢出IgM抗體，但中和抗體7天后才能檢出。而且IgM抗體可以持續(xù)30天左右。但I(xiàn)gG抗體可持續(xù)90天以上。因此檢測(cè)IgM抗體對(duì)于馬匹早期感染以及鑒別免疫接種抗體有一定意義。研究表明，E2蛋白暴露在病毒的表面，是決定病毒抗原性的主要成份，能夠誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生中和抗體。
[0005]由于E2可誘生中和抗體，因此成為疫苗、診斷制劑研究的重點(diǎn)。本研究利用E2蛋白富含抗原表位，具有種特異性這一特點(diǎn)，運(yùn)用原核高效表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行E2結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)，以期獲得大量純化的E2重組蛋白，建立EEEV特異性IgM間接ELISA診斷方法，可應(yīng)用到國內(nèi)疫情監(jiān)測(cè)和進(jìn)出口馬屬動(dòng)物的檢測(cè)，為我國EEEV檢測(cè)提供新的檢測(cè)方法，同時(shí)為開發(fā)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國產(chǎn)EEEV診斷試劑奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒IgM抗體的ELISA試劑盒，該試劑盒采用東部馬腦脊髓炎病毒的E2重組蛋白作為包被抗原，可快速、準(zhǔn)確地對(duì)馬科動(dòng)物的東部馬腦脊髓炎病毒IgM抗體作出評(píng)價(jià)。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0008]一種檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒IgM抗體的ELISA試劑盒，其包括:包被東部馬腦脊髓炎病毒抗原的酶標(biāo)反應(yīng)板、洗滌液、樣品稀釋液、辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗馬IgM 二抗、底物溶液和終止液，其中所述東部馬腦脊髓炎病毒抗原為東部馬腦脊髓炎病毒的E2重組蛋白。該E2重組蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
[0009]進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。其中，陽性對(duì)照為東部馬腦脊髓炎病毒IgM陽性血清；陰性對(duì)照為東部馬腦脊髓炎病毒抗體呈陰性的馬血清。[0010]進(jìn)一步地，上述試劑盒中，所述洗滌液為PBST洗滌液(含0.5%Tween-20的
0.01mol/L、ρΗ7.4 的 PBS 溶液)。
[0011]所述樣品稀釋液為1%卵清蛋白溶液，取卵清蛋白lg，溶于IOOmLlXPBST緩沖液中。
[0012]所述終止液為2mol/L H2SO4溶液。
[0013]所述底物溶液由5.0mL的TMB (lmg/mL)，42.5mL的檸檬酸-醋酸緩沖液(0.1mol/L, pH5.0),和2.5mL尿素過氧化氫(3mg/mL)混合而成。
[0014]本發(fā)明還提供了上述檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒IgM抗體的ELISA試劑盒的制備方法，該方法包括以下步驟:
[0015](I)東部馬腦脊髓炎病毒抗原的制備:從東部馬腦脊髓炎病毒總RNA中擴(kuò)增獲得了 E2基因片段，構(gòu)建原核表達(dá)載體，在基因工程菌中高效表達(dá)，并將表達(dá)的E2重組蛋白純化；
[0016](2)將步驟(I)得到的東部馬腦脊髓炎病毒的E2重組蛋白包被于酶標(biāo)反應(yīng)板；
[0017](3)試劑盒組裝:將步驟(2)制備的包被東部馬腦脊髓炎病毒的E2重組蛋白的酶標(biāo)反應(yīng)板與洗滌液、樣品稀釋液、辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗馬IgM 二抗、底物溶液和終止液組裝成試劑盒。
[0018]上述步驟中，E2重組蛋白包被于酶標(biāo)反應(yīng)板的具有方法為:將純化的E2重組蛋白用包被液(PH9.6的碳酸鹽緩沖液)稀釋為0.20 μ g/mL, 100 μ L/孔加入酶標(biāo)反應(yīng)板，包被條件為37°C lh，然后于4°C條件下過夜，然后棄去孔內(nèi)液體，然后用洗滌液洗滌，拍干反應(yīng)板，加入I %卵清蛋白，100 μ L/孔，37 °C封閉2h，棄去孔內(nèi)液體，然后用洗滌液洗滌，拍干反應(yīng)板，然后真空包裝，存于4°C備用。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:本發(fā)明選擇東部馬腦脊髓炎病毒保守的E2糖蛋白作為目標(biāo)，經(jīng)重組表達(dá)獲得了 E2蛋白，以重組蛋白作為抗原建立了間接ELISA檢測(cè)方法并研制出試劑盒，取得了優(yōu)異的技術(shù)效果:
[0020]I)簡便快速:可快速的對(duì)馬科動(dòng)物的東部馬腦脊髓炎病毒IgM抗體作出評(píng)價(jià)。
[0021]2)特異:與西部馬腦脊髓炎病毒IgM陽性血清及委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒IgM陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。
[0022]3)穩(wěn)定:重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示所建立方法的穩(wěn)定性良好。
[0023]4)安全:不接觸病毒，不具有生物安全問題。
[0024]下面結(jié)合說明書附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為EEEV-E2基因片段RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果，M，DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，陰性對(duì)照；2，EEEV-E2基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0026]圖2為pET32a-EEEV-E2菌液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，M，DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；I?2，菌液PCR陽性結(jié)果；3，菌液PCR陰性結(jié)果。
[0027]圖3為重組蛋白EEEV-E2的SDS-PAGE分析，M，蛋白質(zhì)分子量；1，重組菌未誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物；2，重組菌誘導(dǎo)表達(dá)菌液上清；3，重組菌誘導(dǎo)表達(dá)4h產(chǎn)物；4，重組菌誘導(dǎo)表達(dá)6h產(chǎn)物。[0028]圖4為重組蛋白EEEV-E2純化前后的SDS-PAGE分析，M，蛋白質(zhì)分子量；1、2，His.Bind Kits純化前蛋白；3，純化的重組蛋白。
[0029]圖5為EEEV E2重組蛋白的western blotting鑒定。Μ,蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，pET32a空載體表達(dá)菌；2，重組表達(dá)菌未誘導(dǎo)產(chǎn)物；3，重組表達(dá)菌誘導(dǎo)6h表達(dá)產(chǎn)物。
【具體實(shí)施方式】
[0030]實(shí)驗(yàn)材料
[0031]TRIZ0L,購自 Invitrogen 公司；
[0032]限制性內(nèi)切酶EcoR 1、Hind III，購自TaKaRa公司；
[0033]One-step RNA RT-PCR 試劑盒，購自 TaKaRa 公司；
[0034]胰蛋白胨及酵母粉:購自O(shè)xiod公司；
[0035]IPTG, X-Gal 等:購自 TaKaRa 公司；
[0036]T4DNA連接酶:購自TaKara公司；
[0037]DNA快速純化回收試劑盒，Min1-BEST質(zhì)粒提取試劑盒，DL2000Maker，Ex HS Taq,
6X loading buffer,均購自 TaKaRa 公司；
[0038]三羥甲基氨基甲烷(Tris-堿)、甘氨酸:購自上海生物工程公司；
[0039]N’ N’ 一二甲基甲叉雙丙稀酰胺、丙烯酰胺:購自華美生物工程公司；
[0040]BugBuster Protein Extraction Reagent,購自 Novagen 公司；
[0041]HIS.BIND蛋白純化試劑盒,購自Novagen公司；
[0042]山羊抗馬IgM 二抗辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記，KPL公司產(chǎn)品。
[0043]底物TMB (Sigma)、BSA (MP Biomedicals)、明膠(MP Biomedicals)、脫脂奶(BD),購自中科科奧生物科技有限公司。
[0044]96孔平底聚苯乙烯酶標(biāo)板,美國corning公司產(chǎn)品。
[0045]實(shí)施例1包被抗原E2重組蛋白的獲得
[0046]1、方法
[0047]I) EEEV E2編碼基因的序列分析
[0048]運(yùn)用DNAMAN6.0，DNASTAR7.0，VECT0R NTI Advancel0.0軟件包對(duì)東部馬腦脊髓炎病毒E2蛋白的基本特性(包括分子量，等電點(diǎn)及潛在糖基化位點(diǎn))進(jìn)行預(yù)測(cè)。
[0049]2)EEEV E2基因特異性引物的設(shè)計(jì)與合成
[0050]分析GenBank 數(shù)據(jù)庫中的 EEEV ssp.North American variant 株結(jié)構(gòu)蛋白基因E2，通過序列比對(duì)，采用01igo6.0軟件，設(shè)計(jì)了 I對(duì)包含E2完整基因的引物，命名為EEEV-E21和EEEV-E22，并在引物中引入酶切位點(diǎn)，旨在將E2基因克隆入表達(dá)載體pET32a，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-EEEV-E2。
[0051]引物編號(hào)、長度等見表1，其中斜體下劃線表示引入的酶切位點(diǎn)。
[0052]表IEEEV結(jié)構(gòu)蛋白基因E2引物編號(hào)、序列、目的片段長度及引入的內(nèi)切酶
[0053]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒IgM抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:包被東部馬腦脊髓炎病毒抗原的酶標(biāo)反應(yīng)板、洗滌液、樣品稀釋液、辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗馬IgM 二抗、底物溶液和終止液，其中所述東部馬腦脊髓炎病毒抗原為東部馬腦脊髓炎病毒的E2重組蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒IgM抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，E2重組蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒IgM抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒IgM抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述洗滌液為PBST洗滌液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒IgM抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述樣品稀釋液為I %卵清蛋白溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒IgM抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述終止液為2mol/L H2SO4溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒IgM抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述底物溶液為由5.0mL的濃度為lmg/mL TMB, 42.5mL的濃度為0.lmol/L,pH5.0朽1檬酸-醋酸緩沖液，和2.5mL的濃度為3mg/mL尿素過氧化氫組成的混合溶液。
8.—種檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒IgM抗體的ELISA試劑盒的制備方法，其特征在于，該制備方法包括以下步驟: (O東部馬腦脊髓炎病毒抗原的制備:從東部馬腦脊髓炎病毒總RNA中擴(kuò)增獲得了 E2基因片段，構(gòu)建原核表達(dá)載體，在基因工程菌中高效表達(dá)，并將表達(dá)的E2重組蛋白純化，該E2重組蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:2所示； (2)將步驟(I)得到的東部馬腦脊髓炎病毒的E2重組蛋白包被于酶標(biāo)反應(yīng)板； (3)試劑盒組裝:將步驟(2)制備的包被東部馬腦脊髓炎病毒E2重組蛋白的酶標(biāo)反應(yīng)板與洗滌液、樣品稀釋液、辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗馬IgM 二抗、底物溶液和終止液組裝成試劑盒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒IgM抗體的ELISA試劑盒的制備方法，其特征在于，E2重組蛋白包被于酶標(biāo)反應(yīng)板的具體方法為:將純化的E2重組蛋白用包被液稀釋為0.20 μ g/mL, 100 μ L/孔加入酶標(biāo)反應(yīng)板,包被條件為37°C Ih,然后于4°C條件下過夜，然后棄去孔內(nèi)液體，然后用洗滌液洗滌，拍干反應(yīng)板，加入I %卵清蛋白，100 μ L/孔，37°C封閉2h，棄去孔內(nèi)液體，然后用洗滌液洗滌，拍干反應(yīng)板，然后真空包裝，存于4°C備用，其中，所述包被液為PH9.6的碳酸鹽緩沖液。
10.權(quán)利要求1-7任一所述的檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒IgM抗體的ELISA試劑盒在檢測(cè)東部馬腦脊髓炎病毒IgM抗體中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103575909SQ201310541091
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日
【發(fā)明者】谷強(qiáng), 高志強(qiáng), 劉環(huán), 張鶴曉, 于軍超, 張偉, 蒲靜, 喬彩霞, 張利峰, 周琦, 汪琳, 吳丹 申請(qǐng)人:北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心