一種生物破膠劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及油田增產(chǎn)劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生物破膠劑劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 傳統(tǒng)破膠劑主要有以下幾種：1、氧化破膠劑：常用的氧化破膠劑有過硫酸鉀、過 硫酸銨等。由于氧化劑的活性和溫度有關(guān)，一般當?shù)貙訙囟鹊陀?9°C時，反應(yīng)的速度就很 慢，需要加入活化劑。氧化破膠劑有很多的缺陷如：①在高溫下與壓裂液反應(yīng)迅速，使壓裂 液提前降解而失去輸送支撐劑的能力，甚至導(dǎo)致壓裂施工失??；②它屬于非特殊性反應(yīng)物， 能和遇到的任何反應(yīng)物如管材、地層基質(zhì)和烴類等發(fā)生反應(yīng)，生成與地層不配伍的污染物， 造成地層傷害；③氧化破膠劑很可能在到達目的裂縫前就消耗盡了，因而達不到破膠的目 的。2、膠囊氧化破膠劑：膠囊氧化破膠劑是把過氧化物單獨裝在合成外殼內(nèi)。膠囊氧化破 膠劑的核心材料為破膠劑，可采用與水接觸即可溶解變?yōu)楦呋钚缘墓腆w強氧化劑。膠囊氧 化破膠劑的優(yōu)點在于減少了破膠劑對壓裂液流變性能的影響；增大破膠劑用量，改善了支 撐裂縫的導(dǎo)流能力。3、常規(guī)酶破膠劑：酶是具有高催化能力和很好的活性的生物蛋白，它在 催化反應(yīng)時自身的形態(tài)和結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變，因此可再催化另一個反應(yīng)。常規(guī)酶破膠劑是半 纖維素酶、纖維素酶、淀粉酶和果膠酶的混合物，它無法降解特定的聚合物，達不到理想的 破膠效果。另外，常規(guī)酶破膠劑雖然在低溫下是一種較好的壓裂液破膠劑，但它要求較低 的pH值。一般酶在pH=6時活性最大，高溫、高pH值會使酶失去活性。4、特異性酶破膠劑： 針對于此，新型特異性生物酶破膠體系在其使用溫度范圍、PH范圍等深入研究，主要針對多 糖聚合物糖的甙鍵篩選特異性水解酶（LSE)，它們只分解多糖聚合物結(jié)構(gòu)中特定的糖甙鍵， 可將聚合物降解為非還原性的單糖和二糖。這些特異性破膠酶主要有纖維素糖甙鍵特異性 酶、淀粉糖甙鍵特異性酶、胍膠糖甙鍵特異性酶等等。
[0003] 傳統(tǒng)破膠技術(shù)存在的問題：1、速度慢，反應(yīng)時間及其活性主要依賴于溫度，溫度低 于50°C，反應(yīng)很慢；2、不環(huán)保，它屬于非特殊性反應(yīng)物，能和遇到的任何反應(yīng)物如管材、地 層基質(zhì)和烴類等發(fā)生反應(yīng)，生成與地層不配伍的污染物，造成地層傷害；3、破膠持續(xù)時間 短，氧化破膠劑很可能在到達目的裂縫前就消耗盡了，因而達不到破膠的目的；4、殘渣多， 氧化破膠具有隨機性，造成胍膠鏈不能完全降解，約20%的分子量大于2. OX IO6聚合物基 本上未降解。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為克服傳統(tǒng)破膠劑的技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供了一種新型生物破膠劑XYPJ-2破膠 齊IJ，該破膠劑為穩(wěn)定化的生物制劑，是天然酶和分子改造酶的混合物，由特異水解生物膠 XYSW-I的多糖構(gòu)成，可根據(jù)壓裂的實際需要調(diào)整二者的比例，改造后破膠劑在常溫條件下 的性能比較穩(wěn)定。由于與之配套使用的生物清潔可回收壓裂液稠化劑形成的膠體遇油水部 分破膠，所以該破膠劑在壓裂后期加入，破膠效果好，返排徹底、無殘渣。
[0005] 為了達到如上目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：
[0006] -種生物破膠劑，由天然酶和分子改造酶混合制成，其特征在于：按質(zhì)量份數(shù)計所 述天然酶60-75份、所述分子改造酶25-40份。
[0007] 進一步優(yōu)選地，按質(zhì)量份數(shù)計所述天然酶65-70份、所述分子改造酶30-35份。
[0008] 進一步優(yōu)選地，按質(zhì)量份數(shù)計所述天然酶68份、所述分子改造酶32份。
[0009] 進一步地，所述天然酶為纖維素酶。
[0010] 進一步地，所述分子改造酶的制備包括如下步驟：
[0011] 1)引物設(shè)計與目的基因的擴增
[0012] 根據(jù)破膠制劑OA的基因序列設(shè)計并合成引物，密碼子優(yōu)化后的破膠制劑OA重組 質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為25μ 1，反應(yīng)參數(shù)為：95°C預(yù)變性2min ;95°C 15s， 50°C 30s，72°C 3min，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10min，16°C保存；取9μ 1反應(yīng)產(chǎn)物用于 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定；
[0013] 2)破膠制劑OA克隆載體的構(gòu)建
[0014] 分別對膠回收后的PCR產(chǎn)物和pET28a載體進行EcoRI和Sail雙酶切，膠回收后 用T4DNA連接酶于16°C過夜連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E. coli ToplO感受態(tài)細胞，涂布在含 有卡那霉素的LB平板上；提取質(zhì)粒進行EcoRI和Sail雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定， 將篩選得到的陽性克隆命名為pET28a-0A，并將其菌液送往生物技術(shù)公司測序；
[0015] 3)誘導(dǎo)目的蛋白表達
[0016] 將空質(zhì)粒pET28a和克隆載體pET28a_0A化學法分別轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞E. Co I i BL21star (DE3)中，在含有卡納霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上37°C過夜培養(yǎng)，次日挑選單個 菌落分別接種于5ml含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37°C振蕩培養(yǎng)至0D600=0. 4?0. 6時， 取出Iml未誘導(dǎo)的菌液作為誘導(dǎo)前對照，在剩余培養(yǎng)物中加入終濃度為lmmol/L的IPTG，繼 續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，6h后取出細菌培養(yǎng)液離心去上清后進行SDS-PAGE分析；
[0017] 4)重組蛋白表達形式的分析
[0018] 將過夜菌按1 :1〇〇接種于20ml LB液體培養(yǎng)基中，置于37°C培養(yǎng)至菌濃度 0D600=0. 4?0· 6時，加入IPTG至終濃度為I. Ommol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)6h，lOOOOrpm，離心IOmin 收集菌體，加入1/10體積的超聲裂解液（pH8. 0,50mM Tris-HCl，50mM NaCl)于冰浴中超聲 波破碎l〇min，離心后分別對上清和沉淀進行SDS-PAGE分析；
[0019] 5)誘導(dǎo)表達時間的優(yōu)化
[0020] 在IPTG誘導(dǎo)終濃度統(tǒng)一為I. Ommol/L的基礎(chǔ)上，改變誘導(dǎo)時間，將擴大培養(yǎng)的菌 液按1 :100接種于LB液體培養(yǎng)基中，當0D600=0. 4?0. 6時，分別在誘導(dǎo)0h、2h、4h、6h、8h、 IOh時取ImL菌液離心去上清進行SDS-PAGE電泳，確定最適誘導(dǎo)時間為6-7h ;
[0021] 6) IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化
[0022] 將過夜菌按1:100接種于LB液體培養(yǎng)基中，當其0D600=0. 4?0. 6時，按終濃度 為0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0、I. 2mmol/L加入IPTG，37°C誘導(dǎo)6h，取菌液ImL離心去上清進行 SDS-PAGE電泳，確定IPTG最佳誘導(dǎo)濃度為0. 8-0. 9mmol/L ;
[0023] 7 )誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化
[0024] 將過夜菌按1:100接種于LB液體培養(yǎng)基中，分別置于25°C、28°C、37°C培養(yǎng)，至菌 濃度為〇D600=0. 4?0. 6時，分別加入IPTG至終濃度為I. 0mm〇l/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)6h，取菌液離 心去上清進行SDS-PAGE電泳，確定最佳誘導(dǎo)溫度為37°C ;
[0025] 8)重組蛋白的純化
[0026] 將過夜菌按1:100接種于150mL培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至菌濃度0D600值為0. 4? 〇· 6時，加入IPTG至終濃度為I. Ommol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)IOh后，IOOOOrpm,離心15min沉淀菌 體，并將收集到的菌體放置于_2〇°C過夜后備用。收集誘導(dǎo)菌體后加入1/10體積的超聲 裂解液，冰浴超聲波破碎5次；離心收集上清，上樣于經(jīng)平衡緩沖液（IXPBS)平衡好的 5ml Talon resin柱上，經(jīng)緩慢流速上樣后，用6倍柱體積平衡緩沖液洗去