本發(fā)明涉及土壤修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是針對農(nóng)田土壤重金屬低濃度污染處理的修復(fù)劑制備方法。
背景技術(shù)：
據(jù)不完全統(tǒng)計，中國受重金屬污染耕地面積約2.0×107 hm2，占耕地總面積的20%左右，以中輕度污染為主。土壤中的重金屬來源主要為酸性礦山釋放、采礦冶煉業(yè)的廢水廢渣排放，其他來源有污灌和污泥濫用、農(nóng)藥和化肥的過度施用以及化石類燃料的不完全燃燒等。重金屬在土壤中的形態(tài)影響其活性、生物有效性和遷移特性，重金屬的有些形態(tài)可以被植物吸收，經(jīng)過食物鏈最終進(jìn)入人體，進(jìn)而危及人類健康。
目前，修復(fù)土壤重金屬污染主要有兩種方式：
一種是采用改變土壤中重金屬的存在狀態(tài)，降低重金屬在其土壤環(huán)境中的可遷移性以及可被生物吸收利用的能力。這種方式采取的修復(fù)技術(shù)有固定化/穩(wěn)定化技術(shù)和玻璃化技術(shù)；
另一種則是利用生物或工程技術(shù)方法去除土壤環(huán)境中的重金屬，主要修復(fù)技術(shù)有土壤淋洗/萃取技術(shù)、電動修復(fù)技術(shù)、熱解吸技術(shù)以及植物修復(fù)技術(shù)等。
工業(yè)場地因為重金屬污染的范圍廣并且其工業(yè)用途等特性，多采用大規(guī)模工程技術(shù)方法進(jìn)行修復(fù)，投入資金多，工程規(guī)模大。
相比較而言，農(nóng)田土壤因考慮其用途和實際收支平衡關(guān)系，較少采用大規(guī)模工程投入進(jìn)行重金屬修復(fù)，多采用原位鈍化（固定化或穩(wěn)定化）、植物修復(fù)或農(nóng)業(yè)生態(tài)修復(fù)技術(shù)等方式進(jìn)行修復(fù)。由于處理成本低廉、效果快速、操作簡單和不影響農(nóng)作物生產(chǎn)等優(yōu)點。
蛭石（Vermiculite）是一種天然、無毒的礦物質(zhì)。四面體中一般有1/3-1/2的Si4+被Al3+置換，而帶負(fù)電荷。另外，蛭石顆粒含有大量的硅（鋁）羥基集團，有利于絡(luò)合吸附重金屬離子。因此，蛭石是良好的填好土壤修復(fù)劑。
土壤中含有豐富的微生物，可有效增加土壤微生物種群的數(shù)量和改善土壤微生物種群的結(jié)構(gòu)。利用生物體系制備的生物重金屬修復(fù)劑具有高效、價廉的特點，與傳統(tǒng)的處理方法相比，微生物菌劑具有成本低，處理痕量離子時效果好，且易再生等優(yōu)點化學(xué)藥劑用量?。榛瘜W(xué)法的1/2~1/10）；對污染環(huán)境適應(yīng)性強，穩(wěn)定性好；最大的優(yōu)點是在修復(fù)過程中，微生物能不斷增殖，生物質(zhì)去除金屬離子的量隨生物質(zhì)的量的增加而增加。這些微生物的生命代謝活動能降低環(huán)境中重金屬元素的濃度或使其完全無害。這是因為，微生物可以通過改變土壤中重金屬的化學(xué)或物理特性，來影響重金屬在土壤中的遷移與轉(zhuǎn)化，進(jìn)而降低重金屬危害。微生物可以對土壤中重金屬進(jìn)行固定、移動或轉(zhuǎn)化降解，改變它們在土壤中的環(huán)境化學(xué)行為，可促進(jìn)有毒、有害物質(zhì)解毒或降低毒性，從而達(dá)到生物修復(fù)的目的。比起常規(guī)的物理和化學(xué)修復(fù)方法，其最大優(yōu)點是經(jīng)濟高效且不會形成二次污染，可謂是潛在環(huán)境“天然排毒”。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種重金屬污染土壤修復(fù)劑制備方法，該修復(fù)劑能廣泛用于治理重金屬污染農(nóng)田土壤。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種重金屬污染土壤修復(fù)劑制備方法，該修復(fù)劑為微生物和膨脹蛭石的組合，膨脹蛭石經(jīng)無菌處理后，將膨脹蛭石與菌懸液以質(zhì)量比1:2~1:4的比例混合在一起，避光進(jìn)行吸附培養(yǎng)，1~3小時后吸附平衡按成微生物的固定化；所述菌懸液是根據(jù)微生物對營養(yǎng)、酸堿度、氧等條件不同，而供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入抑制劑造成只利于此微生物生長，抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰其他不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或平板劃線法分離、純化微生物，直到得到純菌株，將該純化的菌株接種至培養(yǎng)液中培養(yǎng)1~3天即可，菌懸液存放于4℃冰箱中。
上述方案中，所述微生物采用綜合廢水生化處理活性污泥所培養(yǎng)的細(xì)菌，經(jīng)轉(zhuǎn)接斜面和液體培養(yǎng)基中活化后，放在冰箱中4℃保存。
上述方案中，所述微生物的馴化、分離和純化包括如下步驟：
（1）土懸液制備：
取泥樣10g于裝有90mL無菌水的錐形瓶中，用振蕩器振蕩，搖勻后將土懸液一次稀釋到10-3、10-4、10-5備用；
（2）水樣稀釋：
取待修復(fù)的土壤反復(fù)淋洗三遍，將淋洗所得的污水1mL裝入49mL無菌水的三角瓶中，混勻后將水樣依次稀釋到10-3、10-4、10-5備用；
（3）分離培養(yǎng)基：
牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入不同濃度的鎘、銅作為篩選耐鎘、銅細(xì)菌培養(yǎng)基；
（4）分離純化
在培養(yǎng)皿中倒入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，冷卻凝固，去0.1mL的10-3、10-4、10-5濃度的土樣懸液及水樣稀釋液用涂布法涂勻在平板上，30℃培養(yǎng)5~7天，然后挑選出培養(yǎng)皿上生長的單個菌落，在永陽的培養(yǎng)基上劃線，反復(fù)純化多次，將純化的菌種放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>
（5）細(xì)菌的馴化
在固體培養(yǎng)基中加入鎘、銅標(biāo)準(zhǔn)溶液，使培養(yǎng)基鎳離子的含量為10mg/L，并將所篩選出的菌株接種到鎘、銅離子的含量分別為20mg/L的培養(yǎng)基中，再次培養(yǎng)馴化，將馴化出的菌株一次接種到濃度為30、40、50、60、70、80、90、100mg/L的篩選培養(yǎng)基中，觀察期生長情況，逐步淘汰耐鎘、銅能力差的菌株，并記錄不同細(xì)菌的最高耐受濃度，篩選出耐受力最高的菌株。
上述方案中，所述液體培養(yǎng)基由牛肉膏2~4g，蛋白胨4.5~5.5g，NaCl 2~3g，蒸餾水1000mL混合制成。
上述方案中，所述固體培養(yǎng)基由牛肉膏2~4g，蛋白胨4.5~5.5g ，NaCl 2~3g，瓊脂10~20g，蒸餾水10~20g混合制成；而篩選培養(yǎng)基由牛肉膏2~4g，蛋白胨4.5~5.5g，NaCl2~3g，蒸餾水1000mL，加入一定濃度含鎘、銅溶液混合制成。
上述方案中，所述微生物是電鍍廢水生化處理活性污泥中篩選培養(yǎng)的芽孢桿菌。
本發(fā)明的制備方法簡單，投資成本低，所得的重金屬污染土壤修復(fù)劑利用了膨脹蛭石的較大比表面積，又利用微生物分泌堿性物質(zhì)提高土壤pH固定鈍化吸附在蛭石表面的重金屬，同時又利用膨脹蛭石的固定包埋保護作用，有效屏蔽土著菌、噬菌體和毒性物質(zhì)對修復(fù)菌的惡性競爭、吞噬和毒害，有效提高微生物對重金屬的固定化作用。具有操作維護簡便、修復(fù)效率高、投資和運行費用低等優(yōu)點，尤其適用于低濃度重金屬污染的農(nóng)田土壤修復(fù)。
具體實施方式：
本發(fā)明提供一種重金屬污染土壤修復(fù)劑制備方法，該修復(fù)劑為微生物和膨脹蛭石的組合，膨脹蛭石經(jīng)無菌處理后，將膨脹蛭石與菌懸液以質(zhì)量比1:2~1:4的比例混合在一起，避光進(jìn)行吸附培養(yǎng)，1~3小時后吸附平衡按成微生物的固定化。將該修復(fù)劑用于治理重金屬污染農(nóng)田土壤，利用膨脹蛭石的較大比表面積，又利用微生物分泌堿性物質(zhì)提高土壤pH固定鈍化吸附在蛭石表面的重金屬，同時又利用膨脹蛭石的固定包埋保護作用，有效屏蔽土著菌、噬菌體和毒性物質(zhì)對修復(fù)菌的惡性競爭、吞噬和毒害，有效提高微生物對重金屬的固定化作用；具有操作維護簡便、修復(fù)效率高、投資和運行費用低等優(yōu)點，尤其適用于低濃度重金屬污染的農(nóng)田土壤。
實施例：
1.菌種來源：
采用某電鍍工業(yè)園區(qū)綜合廢水生化處理活性污泥所培養(yǎng)的細(xì)菌，經(jīng)轉(zhuǎn)接斜面和液體培養(yǎng)基中活化后，放在冰箱中4℃保存。
2. 培養(yǎng)基：
（1）液體培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl 2.5g，蒸餾水1000mL。
（2）固體培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨5g ，NaCl 2.5g，瓊脂15g，蒸餾水15g。
（3）篩選培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl 2.5g，蒸餾水1000mL，加入一定濃度含鎘、銅溶液。
3. 菌種的馴化、分離和純化：
（1）土懸液制備：
取泥樣10g于裝有90mL無菌水的錐形瓶中，用振蕩器振蕩，搖勻后將土懸液一次稀釋到10-3、10-4、10-5備用。
（2）水樣稀釋：
取待修復(fù)的土壤反復(fù)淋洗三遍，將淋洗所得的污水1mL裝入49mL無菌水的三角瓶中，混勻后將水樣依次稀釋到10-3、10-4、10-5備用。
（3）分離培養(yǎng)基：
牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入不同濃度的鎘、銅作為篩選耐鎘、銅細(xì)菌培養(yǎng)基。
（4）分離純化：
在培養(yǎng)皿中倒入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，冷卻凝固，去0.1mL的10-3、10-4、10-5濃度的土樣懸液及水樣稀釋液用涂布法涂勻在平板上，30℃培養(yǎng)5~7天，然后挑選出培養(yǎng)皿上生長的單個菌落，在永陽的培養(yǎng)基上劃線，反復(fù)純化多次，將純化的菌種放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
（5）細(xì)菌的馴化：
在固體培養(yǎng)基中加入鎘、銅標(biāo)準(zhǔn)溶液，使培養(yǎng)基鎳離子的含量為10mg/L，并將所篩選出的菌株接種到鎘、銅離子的含量分別為20mg/L的培養(yǎng)基中，再次培養(yǎng)馴化，將馴化出的菌株一次接種到濃度為30、40、50、60、70、80、90、100mg/L的篩選培養(yǎng)基中，觀察期生長情況，逐步淘汰耐鎘、銅能力差的菌株，并記錄不同細(xì)菌的最高耐受濃度，篩選出耐受力最高的菌株。
3.菌液的配置：
根據(jù)微生物對營養(yǎng)、酸堿度、氧等條件不同，而供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某種抑制劑造成只利于此微生物生長，抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰其他不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或平板劃線法分離、純化微生物，直到得到純菌株。將該純化的菌株接種至培養(yǎng)液中培養(yǎng)1~3天，將其置于4℃冰箱備用，把此種培養(yǎng)液作為修復(fù)試驗的接種菌液。
4．微生物固定化：
膨脹蛭石經(jīng)無菌處理后，將其與菌懸液以質(zhì)量比1:3的比例混合在一起，避光進(jìn)行吸附培養(yǎng)，2小時后吸附平衡按成微生物的固定化。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比對，有益效果如下：
經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)電鍍廢水生化處理活性污泥中篩選培養(yǎng)的微生物主要為芽孢桿菌。微生物對重金屬的作用可以總結(jié)為以下幾點：
1. 微生物對重金屬的生物積累和生物吸著：
由于微生物對重金屬具有很強的親合吸附性能，有毒金屬離子可以結(jié)合到胞外基質(zhì)上或被輕度螯合在生物的多聚物上或沉積在細(xì)胞的不同部位，來降低重金屬危害。
微生物對重金屬的生物積累和生物吸著主要表現(xiàn)為胞外絡(luò)合、沉淀以及胞內(nèi)積累等三種形式：如動膠菌、藍(lán)細(xì)菌、硫酸鹽還原菌以及某些藻類，能夠產(chǎn)生胞外聚合物如多糖、糖蛋白等具有大量的陰離子基團，與重金屬離子形成絡(luò)合物來吸著環(huán)境中的多種重金屬；芽孢桿菌對鎘(Cd)的富集可以達(dá)到其生物量(干重)的21.4%，對鉛(Pb)的富集可高達(dá)61%；檸檬酸細(xì)菌屬的細(xì)菌具有一種抗鈷(Co)的酸性磷酸酯酶，它的分解物質(zhì)2-磷酸甘油能夠與鈷形成沉淀；重金屬進(jìn)入微生物細(xì)胞后，可通過“區(qū)域化作用”，分配于細(xì)胞內(nèi)的不同部位，細(xì)胞通過合成金屬硫蛋白與金屬離子結(jié)合形成無毒或低毒絡(luò)合物。
2. 微生物對重金屬的生物轉(zhuǎn)化作用：
微生物對重金屬進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的作用機理主要包括，微生物對重金屬的生物氧化和還原以及重金屬的有機絡(luò)合配位降解，通過改變其毒性或穩(wěn)定性，達(dá)到降低重金屬危害的效果。
（1）多種微生物能夠利用鉻酸鹽的還原特性，對重金屬污染土壤進(jìn)行修復(fù)。如產(chǎn)堿菌屬、芽孢桿菌屬、棒桿菌屬、腸桿菌屬、假單胞菌屬和微球菌屬的微生物可以使鉻酸鹽和重鉻酸鹽還原，通過將高毒性的6價鉻(Cr6+)還原為低毒性的3價鉻(Cr3+)，來降低其危害。
（2）微生物也可通過改變重金屬的穩(wěn)定性，對重金屬污染土壤進(jìn)行修復(fù)。如硫鐵桿菌類細(xì)菌能氧化銅(Cu)、砷(As)、鉬(Mo)和鐵(Fe)等，假單孢桿菌屬能使砷(As)、鐵(Fe)和錳(Mn)等發(fā)生生物氧化，降低這些重金屬元素的活性；硫還原細(xì)菌可通過兩種途徑將硫酸鹽還原成硫化物，一是在呼吸過程中硫酸鹽作為電子受體被還原，二是在同化過程中利用硫酸鹽合成氨基酸，如胱氨酸和蛋氨酸，再通過脫硫作用使硫離子(S2-)分泌于體外，與重金屬鈷(Co)形成沉淀，這一過程在重金屬污染治理方面有重要的意義。
3、微生物對重金屬元素的溶解和沉淀作用：
土壤中的微生物能夠利用有效的營養(yǎng)和能源，在土壤濾瀝過程中通過分泌有機酸（如甲酸、乙酸、丙酸和丁酸等）絡(luò)合并溶解重金屬。金屬價態(tài)改變后，金屬的絡(luò)合能力也發(fā)生變化，一些微生物的分泌物與金屬離子發(fā)生絡(luò)合作用，從而降低重金屬毒性、溶解降解土壤重金屬。
膨脹蛭石既可固定穩(wěn)定環(huán)境中的污染物、吸附微生物代謝產(chǎn)生有毒物質(zhì)，又可通過表面交聯(lián)、配位、成鍵、插層等反應(yīng)實現(xiàn)對微生物的固定化。微生物經(jīng)過固定后，其穩(wěn)定性和活性、氧與底物傳質(zhì)速率等反應(yīng)特性均有較大的提高。此外。還具有一定的電子輸送能力，其特殊的晶體結(jié)構(gòu)可有效屏蔽土著菌、噬菌體和毒性物質(zhì)對降解菌的惡性競爭、吞噬和毒害，保護修復(fù)菌細(xì)胞，可有效提高固定化的微生物對重金屬的修復(fù)能力。同時利用膨脹蛭石較大的比表面積和較強的吸附鎖定能力，可以在其表面聚集更多的污染物，從而提高固定在蛭石上的微生物對重金屬的生物鈍化作用，縮短周期。土壤中的重金屬首先由膨脹蛭石捕獲，再在附著在蛭膨脹石表面微生物的作用下發(fā)生絡(luò)合、沉淀，從而被固定化在修復(fù)材料中。
以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換與比例調(diào)整，而不脫離本技術(shù)案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。