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一種可高選擇性識(shí)別苯硫酚的熒光探針、制備方法和應(yīng)用與流程

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一種可高選擇性識(shí)別苯硫酚的熒光探針、制備方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明涉及化學(xué)分子探針技術(shù)領(lǐng)域。更具體地,涉及一種可高選擇性識(shí)別苯硫酚的熒光探針、制備方法和應(yīng)用。



背景技術(shù):

巰基化合物在生物體系和化學(xué)科學(xué)中是一類重要的分子。脂肪烴類巰基化合物如半胱氨酸,同型半胱氨酸和谷胱甘肽在生物體系中廣泛存在,它們參與著生命體系中多項(xiàng)生命活動(dòng)。然而,芳香烴類巰基化合物苯硫酚雖然廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥和醫(yī)藥各種中間體的制備,卻是一類高毒的污染物質(zhì),長(zhǎng)期接觸水或者土壤中的苯硫酚會(huì)對(duì)人體健康造成一系列嚴(yán)重危害,包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損,心率變快,肌肉萎縮,下肢癱瘓,昏迷甚至死亡。因此,對(duì)生物體系或環(huán)境樣品中的苯硫酚的檢測(cè)具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

傳統(tǒng)的檢測(cè)苯硫酚的方法包括:質(zhì)譜法,氣相色譜法,高效液相色譜法,電化學(xué)方法等。熒光探針檢測(cè)的方法,由于其具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單以及成本低廉等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于含巰基化合物的檢測(cè)中。此外,在這些已報(bào)道的苯硫酚探針中,有些表現(xiàn)出探針的不穩(wěn)定性,易受環(huán)境因素影響,比如,有些在實(shí)際檢測(cè)中需要使用過(guò)高的pH值環(huán)境,只有非常少的探針能夠在實(shí)際環(huán)境和生物樣本中檢測(cè)苯硫酚。

因此,針對(duì)以上問(wèn)題,需要提供一種能高效、快速的檢測(cè)生物體系或環(huán)境樣品中的苯硫酚的方法。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種可高選擇性識(shí)別苯硫酚的熒光探針,該熒光探針對(duì)苯硫酚的檢測(cè)靈敏度高,檢測(cè)限低,選擇性好,能將苯硫酚和脂肪型硫醇(如半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽等)區(qū)分開(kāi),且能快速的檢測(cè)出生物體系或環(huán)境樣品中的苯硫酚。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種可高選擇性識(shí)別苯硫酚的熒光探針的制備方法,該方法原料易得,合成方法簡(jiǎn)單,反應(yīng)條件容易控制,可實(shí)現(xiàn)對(duì)苯硫酚的比率式熒光檢測(cè)。

本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種可高選擇性識(shí)別苯硫酚的熒光探針的應(yīng)用。

為達(dá)到上述第一個(gè)目的,本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:

一種可高選擇性識(shí)別苯硫酚的熒光探針,它具有如下所示的結(jié)構(gòu)式:

為達(dá)到上述第二個(gè)目的,本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:

一種可高選擇性識(shí)別苯硫酚的熒光探針的制備方法,包括如下步驟:稱取BODIPY主體化合物溶于乙腈中,加入氨水,室溫下攪拌,再加入乙酰溴,再繼續(xù)攪拌,得到可高選擇性識(shí)別苯硫酚的熒光探針;

其中,所述BODIPY主體化合物的結(jié)構(gòu)式為:

優(yōu)選地,所述可高選擇性識(shí)別苯硫酚的熒光探針的制備方法,包括如下步驟:稱取1摩爾當(dāng)量的BODIPY主體化合物溶于乙腈中,加入1.5~2摩爾當(dāng)量的氨水,室溫下攪拌5~8小時(shí)后,加入3~5摩爾當(dāng)量乙酰溴,攪拌繼續(xù)反應(yīng)12小時(shí),加入飽和食鹽水,用二氯甲烷萃取2~3次,減壓蒸餾除去二氯甲烷,殘留物進(jìn)行柱層析得到可高選擇性識(shí)別苯硫酚的熒光探針。

優(yōu)選地,所述BODIPY主體化合物的合成可參考相關(guān)文獻(xiàn)。例如,其合成可包括如下步驟:

1)向1摩爾當(dāng)量對(duì)甲基苯甲醛和20~25摩爾當(dāng)量吡咯的混合溶液中緩慢滴加0.08~0.12摩爾當(dāng)量的三氟乙酸,室溫下攪拌10~15分鐘,得到B;

2)將1摩爾當(dāng)量B溶于四氫呋喃中,通N2,與2-2.5摩爾當(dāng)量N-氯代丁二酰亞胺在-78℃的條件下反應(yīng)2~3小時(shí),得到C;

3)將1摩爾當(dāng)量C溶于二氯甲烷中,通N2,接著將1~1.2摩爾當(dāng)量二氯二氰基對(duì)苯醌的二氯甲烷溶液逐滴加入其中,室溫下反應(yīng)1~1.5小時(shí),得到D;

4)將1摩爾當(dāng)量D溶于二氯甲烷中,加入8~10摩爾當(dāng)量三乙胺,室溫?cái)嚢?~1.5小時(shí),接著加入15~20摩爾當(dāng)量三氟化硼乙醚,在黑暗無(wú)光條件下反應(yīng)12~15小時(shí),得到A,為BODIPY主體化合物。

為達(dá)到上述第三個(gè)目的,本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:

本發(fā)明還保護(hù)上述可高選擇性識(shí)別苯硫酚的熒光探針的應(yīng)用,將所述熒光探針用來(lái)檢測(cè)苯硫酚。

優(yōu)選地,所述熒光探針可在細(xì)胞中檢測(cè)苯硫酚。

優(yōu)選地,所述熒光探針用來(lái)檢測(cè)苯硫酚的方法為:在HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)的緩沖溶液中,用所述熒光化學(xué)傳感器對(duì)含巰基化合物進(jìn)行檢測(cè),所述緩沖溶液的pH可為7.40。

本發(fā)明的有益效果如下:

本發(fā)明的可高選擇性識(shí)別苯硫酚的熒光探針對(duì)苯硫酚的檢測(cè)靈敏度高,選擇性好。

本發(fā)明的制備方法中,通過(guò)對(duì)原料的選擇,熒光探針結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì),提供了原料易得、合成方法簡(jiǎn)單,反應(yīng)條件易于控制的可高選擇性識(shí)別苯硫酚的熒光探針的制備方法,且產(chǎn)物分子量子產(chǎn)率高。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

圖1示出本發(fā)明熒光探針(濃度為10μmol/L)在HEPES(pH=7.40)緩沖溶液中對(duì)不同濃度的苯硫酚響應(yīng)的紫外光譜。

圖2示出本發(fā)明熒光探針在HEPES緩沖溶液中對(duì)不同濃度的苯硫酚響應(yīng)的熒光光譜。

圖3示出本發(fā)明熒光探針在HEPES緩沖溶液中對(duì)不同濃度的苯硫酚響應(yīng)熒光強(qiáng)度曲線圖。

圖4示出本發(fā)明熒光探針在HEPES緩沖溶液中對(duì)不同時(shí)間的苯硫酚響應(yīng)的紫外光譜。

圖5示出本發(fā)明熒光探針在HEPES緩沖溶液中對(duì)不同時(shí)間的苯硫酚響應(yīng)的熒光光譜。

圖6示出本發(fā)明熒光探針在HEPES緩沖溶液中對(duì)不同硫醇響應(yīng)的紫外光譜。

圖7示出本發(fā)明熒光探針在HEPES緩沖溶液中對(duì)不同硫醇響應(yīng)的熒光光譜。

圖8示出本發(fā)明熒光探針在活體細(xì)胞中的熒光成像。

具體實(shí)施方式

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明,下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解,下面所具體描述的內(nèi)容是說(shuō)明性的而非限制性的,不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等,如無(wú)特殊說(shuō)明,均可通過(guò)商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1

一種可高選擇性識(shí)別苯硫酚的熒光探針的制備方法,步驟如下:

1.BODIPY主體化合物的合成:

1)稱取8.33g(69.4mmol)對(duì)甲基苯甲醛加入到250mL單口燒瓶中,加入100mL(1446mmol)吡咯,然后向其中緩慢滴加三氟乙酸0.5mL(6.7mmol),室溫下攪拌10分鐘,減壓除去吡咯得到黑色粘稠液體,對(duì)殘余物進(jìn)行柱層析得到式(B)所示化合物:

2)將2.0g(8.5mmol)式B所示化合物溶于100mL四氫呋喃中,通N2,冷卻到-78℃,加入2.3g(17.2mmol)N-氯代丁二酰亞胺,在-78℃條件下攪拌2小時(shí),然后置于冰箱中冷藏18小時(shí),第二天,將冷藏液體進(jìn)行濃縮,殘留物用100mL二氯甲烷稀釋,然后用蒸餾水洗3次,最后進(jìn)行柱層析得到式(C)所示化合物:

3)稱取1.62g(5.3mmol)式C所示化合物加入到200mL單口燒瓶中,用50mL二氯甲烷溶解,通N2,然后稱取1.20g(5.3mmol)二氯二氰基對(duì)苯醌,用20mL二氯甲烷溶解得到的溶液逐滴加入到200mL單口燒瓶中,室溫下攪拌1小時(shí)。用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌2次,減壓除去二氯甲烷,殘留物進(jìn)行柱層析得到式(D)所示化合物:

4)稱取1.08g(3.6mmol)式D所示化合物溶于120mL二氯甲烷中,加入4.5mL(32.3mmol)三乙胺,室溫下攪拌1小時(shí),再加入7.5mL(59.4mmol)三氟化硼乙醚復(fù)合物,然后在黑暗無(wú)光條件下攪拌12小時(shí),用蒸餾水洗滌2次,減壓除去二氯甲烷,殘留物進(jìn)行柱層析,得到A,為BODIPY主體化合物:

2.可高選擇性識(shí)別苯硫酚的熒光探針的合成:

稱取前述1摩爾當(dāng)量的BODIPY主體化合物溶于乙腈中,加入2摩爾當(dāng)量的氨水,室溫下攪拌8小時(shí)后,加入3摩爾當(dāng)量乙酰溴,攪拌繼續(xù)反應(yīng)12小時(shí),加入飽和食鹽水,用二氯甲烷萃取3次,減壓蒸餾除去二氯甲烷,殘留物進(jìn)行柱層析得到式(I)所示的可高選擇性識(shí)別苯硫酚的熒光探針:

實(shí)施例2

測(cè)定實(shí)施例1所得可高選擇性識(shí)別苯硫酚的熒光探針與苯硫酚濃度的關(guān)系

使用HEPES(pH=7.40)緩沖溶液配制10μmol/L的實(shí)施例1中式(I)所示化合物溶液,用乙腈分別配制0、1、3、6、8、12、15、20、30、50、60、70、80、100、150μmol/L的苯硫酚溶液。取2mL上述式(I)所示化合物溶液于15個(gè)比色皿中,向比色皿中分別滴加不同濃度的苯硫酚溶液至平衡;檢測(cè)紫外光譜,如圖1所示;檢測(cè)熒光光譜,如圖2所示;用不同濃度的熒光強(qiáng)度I581nm/I540nm的比值作圖,得到隨苯硫酚濃度變化的曲線圖,如圖3所示。

從圖1和圖2中可看出,本發(fā)明的熒光探針可以實(shí)現(xiàn)對(duì)苯硫酚的比率式檢測(cè),本發(fā)明的熒光探針對(duì)于濃度低至1μmol/L的苯硫酚溶液依然具有靈敏的檢測(cè)度。

從圖3中可看出,在苯硫酚濃度較低的條件下,熒光強(qiáng)度I581nm/I540nm的值與苯硫酚濃度呈線性關(guān)系。

實(shí)施例3

測(cè)定實(shí)施例1所得可高選擇性識(shí)別苯硫酚的熒光探針與苯硫酚反應(yīng)隨時(shí)間變化的熒光強(qiáng)度變化關(guān)系

使用HEPES(pH=7.40)緩沖溶液配制10μmol/L的實(shí)施例1中式(I)所示化合物溶液,用乙腈分別配制100μmol/L的苯硫酚溶液,取述苯硫酚溶液2mL,加入上述探針溶液2μL后,開(kāi)始計(jì)時(shí)。分別檢測(cè)1、3、5、7、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120min的紫外光譜(如圖4所示)和熒光光譜(如圖5所示)。

從圖4和圖5中可知,本發(fā)明的熒光探針在很短的時(shí)間內(nèi)即可迅速的將苯硫酚檢測(cè)出來(lái)。

實(shí)施例4

測(cè)定實(shí)施例1所得可高選擇性識(shí)別苯硫酚的熒光探針對(duì)不同硫醇的選擇性

配制4種不同的硫醇:使用乙腈分別配制100μmol/L的半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GHS)、同型半胱氨酸(Hcy)、硫化氫(H2S)溶液。

實(shí)施例1中式(I)所示化合物對(duì)4種其他硫醇和苯硫酚的紫外、熒光光譜測(cè)試:取2mL上述式(I)所示化合物溶液于5個(gè)比色皿中,向比色皿中分別滴加4種其他硫醇和苯硫酚溶液至平衡;檢測(cè)紫外光譜,如圖6所示;檢測(cè)熒光光譜,如圖7所示。從圖6和圖7中可以看出,式(I)所示化合物對(duì)苯硫酚是選擇性響應(yīng)。

實(shí)施例5

測(cè)定實(shí)施例1所得可高選擇性識(shí)別苯硫酚的熒光探針對(duì)活體細(xì)胞中苯硫酚的成像檢測(cè)

人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)在含有10%胎牛血清,50unit/mL青霉素和50μg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中,37℃,5%CO2條件下生長(zhǎng)。

在細(xì)胞培養(yǎng)皿中在加入實(shí)施例1(I)所示的熒光探針100μM,孵育20分鐘(實(shí)驗(yàn)組1);另一組加入實(shí)施例1(I)所示的熒光探針100μM后孵育20分鐘,再加入苯硫酚10μM,再孵育20分鐘,用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗三遍(實(shí)驗(yàn)組2)。

在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞,通過(guò)熒光分布位置與強(qiáng)度來(lái)表現(xiàn)細(xì)胞中苯硫酚的含量,如圖8(a)~(h)所示。其中(a)~(d)為上述在HeLa細(xì)胞中加了(I)所示的熒光探針的成像照片;(e)~(h)為上述在HeLa細(xì)胞中加了(I)所示的熒光探針和苯硫酚的成像照片;(a)和(e)為綠色通道;(b)和(f)為紅色通道;(c)和(g)為明場(chǎng);(d)和(h)綠色通道和紅色通道的比值。從圖8中可知,本發(fā)明的熒光探針可以實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞中對(duì)苯硫酚的選擇性檢測(cè)。

顯然,本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例,而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定,對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō),在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng),這里無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉,凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。

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