專利名稱：歸一化樣品中生物分子含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及歸一化樣品中生物分子含量的方法、應(yīng)用和設(shè)備。所述方法、應(yīng)用和設(shè)備適合應(yīng)用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、微生物學(xué)、分子診斷和/或分子法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
歸一化樣品中生物分子含量在樣品分析，例如分子診斷、基因表達分析、基于有效物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄水平分析、分子法醫(yī)學(xué)、測序或基因分型中起到重要作用。之所以進行歸一化的原因是，在一些情況下待測生物分子，特別是核酸和/或蛋白質(zhì)在樣品中的含量不同。此外，制備樣品的加工步驟，例如裂解、細(xì)胞變性、分離步驟或逆轉(zhuǎn)錄可能以不同效率水平提供待研究的生物分子。在這兩種情況下，意味著由于上述不確定因素樣品中生物分子含量未知會影響進一步制備和分析步驟的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，或者導(dǎo)致需要額外的定量步驟。對于包含隨后準(zhǔn)備采用已知方法(聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄、免疫-PCR)檢測的核酸的樣品的制備而言，這尤其重要。在這種情況下，協(xié)調(diào)工藝參數(shù)，特別是樣品中的生物分子含量非常重要，以便達到所需的循環(huán)數(shù)。在過去幾十年中聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)已經(jīng)被建立為體外DNA擴增的體系。同時， 由于該技術(shù)不僅是用于定性分析的擴增技術(shù)，還發(fā)展成用于定量分析的"實時"PCR，所以 PCR已成為廣泛使用的分析和測定工具。目前，檢測所謂的信使RNA(mRNA)，即某些基因片段的RNA轉(zhuǎn)錄物是一項標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用。在這方面，用引物(常常是多聚dT)和酶(逆轉(zhuǎn)錄酶) 將樣品中所有mRNA均轉(zhuǎn)錄成DNA (cDNA)，通過PCR試驗檢測如此形成的cDNA。因此，可能以一步或兩步方式進行這些試驗。在一步方式中，逆轉(zhuǎn)錄(RT)以及PCR試驗本身在PCR儀中進行，而在兩步方式中，逆轉(zhuǎn)錄單獨進行后，將一份反應(yīng)物加入PCR主混物中。然而，不同樣品的mRNA水平可能差異很大，此外，RT的效率也會導(dǎo)致一些波動。這有時導(dǎo)致引入PCR 反應(yīng)的cDNA量差異很大。在現(xiàn)有技術(shù)中，通常在開始逆轉(zhuǎn)錄之前測定樣品的RNA含量，例如借助OD檢測法或熒光檢測法進行測定。通常不在cDNA水平上進行定量測定，因為逆轉(zhuǎn)錄完成后核苷酸、 核糖體RNA和其它組分的存在會使cDNA的定量分析復(fù)雜化。這種定量分析特別適合在所謂的兩步法中應(yīng)用，在兩步法中樣品制備(例如通過裂解、細(xì)胞變性、分離步驟或逆轉(zhuǎn)錄)和進一步樣品加工(例如通過PCR)在不同步驟中和/ 或在不同容器中進行，因此可能在兩個步驟之間進行吸移步驟。這一步驟也適合將已經(jīng)制備的樣品直接進行PCR分析的方法中應(yīng)用。就現(xiàn)有技術(shù)的兩步PCR的情況來看，在單獨容器中進行逆轉(zhuǎn)錄，然后將其吸移到 PCR主混物中。此時，可在逆轉(zhuǎn)錄后通過分光光度法測定cDNA含量一次。然而，因為需要付出額外勞動通常省去這一步，并且只有一份RT反應(yīng)物用于qPCR。為了防止PCR主混物的過度稀釋，最多只將10%的主混物量作為一等份加入其中。這意味著在使用2. 5μ L的25-μ L PCR中，只將略多于10%的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于PCR反應(yīng)，或者再一次重申必須避免使用較大體積。同時，額外的吸移步驟進一步導(dǎo)致不精確，正如任何手工操作那樣。還存在交叉污染的額外風(fēng)險。在本發(fā)明方法中，不需要考慮PCR反應(yīng)試驗中的額外體積，因為cDNA可逆地結(jié)合于反應(yīng)容器中的限定表面。以前的方法不適用于在同一容器中制備樣品(例如，通過裂解和/或逆轉(zhuǎn)錄)和進一步樣品加工(例如通過PCR)，如果可能的話使該容器保持封閉的方法(所謂的一步法)。在現(xiàn)有技術(shù)的一步法中，使用任選經(jīng)分光光度法定量測定的一定量的生物分子 (如mRNA)。在同一反應(yīng)容器中進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR法本身。因此，由于在過程中如果可能的話不打開反應(yīng)容器，能夠?qū)⑷磕孓D(zhuǎn)錄體系都轉(zhuǎn)移到PCR反應(yīng)中。然而對所用樣品而言， 生物分子(例如mRNA)含量可能差異很大，并且樣品制備步驟(例如逆轉(zhuǎn)錄)的效率也引起波動，有時進而導(dǎo)致樣品制備步驟完成后產(chǎn)物(如cDNA)量差異很大，然后引入后續(xù)反應(yīng) (如PCR)，導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)果不具重復(fù)性。此外，由于額外反應(yīng)體積通常為20 μ L，所以不可能用 PCR的慣用體積25 μ L進行操作。通常在50- μ L或100- μ L體系中進行一步法RT-PCR。在本發(fā)明方法和本發(fā)明設(shè)備中，利用本發(fā)明產(chǎn)生的結(jié)合表面，而不是用OD測量法或熒光測量法，在設(shè)備中歸一化(例如)核酸的絕對量。相對而言，所謂的“持家方法”代表內(nèi)參或內(nèi)標(biāo)，也可用于指示生物系統(tǒng)的狀態(tài)。可利用持家基因評估該試驗的質(zhì)量，因為就某些持家基因而言，其在某些細(xì)胞類型中的表達水平存在標(biāo)準(zhǔn)值。然而，必須注意到在該方法中，歸一化的精確度受到可能的不確定性的很大限制。 因此，沒有理想的持家基因；即在任何情況下均可觀察到基因表達的物種、類型、階段或狀態(tài)特異性變化，即使使用多個持家基因也無法完全消除這種變化。此外，US 20070231892披露了一種擴增核酸的方法，其中在容器中使生物樣品裂解物與所謂的“電荷開關(guān)”表面相接觸，以結(jié)合裂解物中所含的核酸。然后去除未結(jié)合的裂解物，擴增結(jié)合的核酸。就所述“電荷開關(guān)”材料而言，PH改變時表面電荷發(fā)生變化。這種弱離子交換劑的特性出現(xiàn)在，例如，PH低于表面基團的ρΚ值時，因此這些表面基團具有正表面電荷。然后，可結(jié)合帶負(fù)電的生物分子，具體是核酸。另一方面，當(dāng)PH高于表面基團的PK值時，電荷從正電荷改變?yōu)橹行曰蜇?fù)電荷，以便再次釋放帶負(fù)電的生物分子，具體是核酸。因此，通過使用具有不同PH值和低鹽濃度的合適緩沖液("低鹽緩沖液")，可通過 PH控制結(jié)合和釋放過程。具體說，所述“電荷開關(guān)”材料具有陰離子交換劑特性。此種方法的一個缺點是無法將合適材料永久性地共價連接到，例如聚丙烯制成的微反應(yīng)容器表面上。所述材料通常通過簡單堆積固定在表面上。然而無法保證永久性粘附于表面，這使得這些方法的重復(fù)性備受質(zhì)疑，也使得相應(yīng)包被容器不可能用于多種應(yīng)用。此外，由于廣泛存在的RNA酶，使用"電荷開關(guān)"材料、通常使用陰離子交換劑在所述條件下從生物樣品中分離RNA也困難重重。在普遍使用的低鹽條件下依然如此，因此 RNA在數(shù)秒內(nèi)嚴(yán)重降解，難以甚至不可能對其進行檢測。定義具體說，在本發(fā)明含義內(nèi)，術(shù)語“核酸”指(但不限于)天然的，優(yōu)選線性、分支或環(huán)狀的核酸，如RNA，具體是mRNA、單鏈和雙鏈病毒RNA、siRNA、miRNA, snRNA、tRNA、hnRNA 或核酶，基因組、細(xì)菌或病毒DNA(單鏈和雙鏈)，染色體和附加體DNA，游離循環(huán)的核酸等， 合成或修飾的核酸，如質(zhì)?；蚬押塑账?，具體是引物、探針或用于PCR的標(biāo)準(zhǔn)品，用地高辛、 生物素或熒光染料標(biāo)記的核酸，或者所謂的“肽核酸”(PNA)。術(shù)語“歸一化樣品中生物分子含量”應(yīng)指保證樣品中的生物分子含量不超過特定程度的步驟(根據(jù)本發(fā)明，依據(jù)容器表面(優(yōu)選容器內(nèi))的至少一部分的大小和結(jié)合特性)。這是一種將生物分子含量確定到某特定值的方法。這包括隨后丟棄超過所述程度的生物分子，也意味著如果樣品含有少于上述特定程度的生物分子，則無法成功進行歸一化。具體說，在本發(fā)明含義內(nèi)，術(shù)語“固定”指(但不限于)可逆地固定在合適的固相上。具體說，術(shù)語“膜”指(但不限于)能夠可逆地結(jié)合生物分子的固相。具體說，術(shù)語“高鹽緩沖液”指(但不限于)高鹽濃度(優(yōu)選離液物質(zhì))緩沖液， 優(yōu)選彡IOOmM,更優(yōu)選彡500mM，更優(yōu)選彡1M。術(shù)語“高鹽條件”指(但不限于)使用高鹽緩沖液，優(yōu)選含有離液鹽的高鹽緩沖液的環(huán)境。使用高鹽[緩沖液]，優(yōu)選含有離液鹽的高鹽緩沖液降低核酸在水中的溶解度。原因是氫橋的降解，以及相關(guān)聯(lián)的核酸在水中的二級和三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低。如果隨后提供極性表面作為氫橋供體，則核酸結(jié)合于該表面，因為它們在該位置上比在水中更穩(wěn)定。如果鹽濃度降低，水再一次變成優(yōu)于極性表面的氫橋供體，因而核酸從表面上解離。具體說，術(shù)語“離液物質(zhì)”或“離液鹽”指(但不限于)能改變蛋白質(zhì)和/或核酸的二級、三級和/或四級結(jié)構(gòu)，但至少不改變其一級結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，它能降低極性物質(zhì)在水中的溶解度和/或加強疏水性相互作用。優(yōu)選的離液物質(zhì)是鹽酸胍、(異)硫氰酸胍、碘化鈉、 高氯酸鈉、碘化鉀、(異)硫氰酸鈉和/或脲。具體說，術(shù)語“硅烷醇基團”指(但不限于)氧化硅(無定形、結(jié)晶)或組成為 SiO2x(OH)a(OEt)0的聚硅酸(其中化學(xué)劑量因子α是χ和β的函數(shù)，即α =4(1-χ)-β)。 二氧化硅或聚硅酸可含有一個或多個下述替代物，或者也可被下述氧化物完全替代。B2O3 (0-30% ),Al2O3 (0-100% ),TiO2 (0-100% ),ZrO2 (0-100% ).所述材料可能也是表面官能化的。例如，可用硅烷進行硅烷化，以處理硅烷醇基團。表面可能是疏水的，或者可能施加了陰離子基團和/或陽離子基團和/或螯合劑。例如，可施加三乙酸腈(NTA)部分，作為螯合劑基團。這能使吸附表面適合待結(jié)合的生物分子。另一種觀點是利用硅烷化過程將含鹵素的原子轉(zhuǎn)移自由基引發(fā)劑施加到硅烷醇基團上，以便利用硅烷醇基團上的“嫁接”過程產(chǎn)生聚合物鏈。這種方法也稱為接枝共聚， 需要鏈終止、歧化或再化合傾向輕微的聚合過程。必須將引發(fā)劑施加于硅烷醇基團，以進行接枝共聚。這可通過用含鹵素的硅烷處理PECVD硅酸鹽層實現(xiàn)。或者，將引發(fā)劑直接引入PECVD過程。在這方面，將揮發(fā)性的含鹵素化合物加入過程氣體(PECVD過程中的前體) 中。如果在這種含鹵化物表面上進行ATRP，則原位產(chǎn)生共價結(jié)合所述表面的聚合物(均聚
6物、共聚物、嵌段共聚物)。合適的單體是可自由基聚合(radically polymerizable)的化合物，如丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、苯乙烯和苯乙烯衍生物。原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)是原位自由基聚合的一種形式。有機鹵化物借助原子轉(zhuǎn)移過程通過Cu (I)/Cu (II)氧化還原平衡形成自由基。氧化還原平衡導(dǎo)致自由基濃度大大降低。因此，歧化或再化合引起的鏈終止反應(yīng)被大大抑制。術(shù)語“擴增反應(yīng)”指允許一種或多種分析物，優(yōu)選核酸的濃度至少翻倍的方法。在此處介紹等溫和熱循環(huán)擴增反應(yīng)的區(qū)別。在前者中，在整個過程中溫度保持恒定，而在后者中，運行熱循環(huán)，籍此控制反應(yīng)和擴增。下面是優(yōu)選的等溫擴增反應(yīng)的例子 環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增(LAMP)， 基于核酸序列的擴增(NASBA)， 滾環(huán)鏈反應(yīng)(RCCR)或滾環(huán)擴增(RCA)和/或 轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)。下面是優(yōu)選的熱循環(huán)擴增反應(yīng)的例子 連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，和/或 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。術(shù)語“聚合酶鏈反應(yīng)”(PCR)指體外擴增核酸的方法，如Bartlett和 Stirling(2003)所述。術(shù)語“連接酶鏈反應(yīng)”(LCR)指非常少量核酸的檢測方法，其功能類似于聚合酶鏈反應(yīng)，但使用不同的酶(連接酶，而非聚合酶)。每條DNA鏈?zhǔn)褂脙蓚€樣品，連接形成樣品。 一個循環(huán)得到的擴增產(chǎn)物常常只有30-50bp長，將其本身再用于后續(xù)循環(huán)，作為補充引物的起點。術(shù)語“環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增”(LAMP)指使用識別靶序列上特定區(qū)域并與其結(jié)合的六種不同引物的等溫擴增方法。LAMP使用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在大約65°C的恒定溫度下進行。在一個步驟中擴增和檢測靶序列。術(shù)語“基于核酸序列的擴增”(NASBA)指一種擴增RNA的方法(Compton，1991)。 將RNA基質(zhì)加入反應(yīng)混合物，第一引物結(jié)合該基質(zhì)3'末端區(qū)域中的互補序列。然后，用逆轉(zhuǎn)錄酶將與基質(zhì)互補的DNA鏈多聚化。然后，用RNA酶H消化該RNA基質(zhì)(RNA酶H只消化 RNA-DNA雜交體中的RNA，而不消化單鏈RNA)。然后，使第二引物結(jié)合于DNA鏈的5 ‘端。這一引物被T7 RNA聚合酶用作合成與該DNA鏈互補的RNA分子的起點，然后該RNA分子可再次用作起點基質(zhì)。NASBA通常在41°C的恒定溫度下進行，在某些情況下能夠比PCR提供更快和更優(yōu)的結(jié)果。術(shù)語“轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增”(TMA)指美國基因探針公司(Gen-Probe)開發(fā)的等溫擴增方法，其類似于NASBA，同樣使用RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶(Hill，2001)。術(shù)語“滾環(huán)鏈反應(yīng)”(RCCR)或“滾環(huán)擴增”(RCA)指按照滾環(huán)原理仿效普通核酸復(fù)制的擴增方法，參見US 5，854，033等。術(shù)語“免疫-PCR” (IPCR)具體指檢測靶分子的方法，其中使用來自靶點特異性抗體和核酸分子的嵌合偶聯(lián)物。從性質(zhì)上看，所述靶分子主要包括蛋白質(zhì)和/或寡肽，因為最容易產(chǎn)生該類分子物質(zhì)的高度特異性抗體。然而，所述靶分子還可包括其他生物分子物質(zhì)，例如寡糖和多糖或脂質(zhì)，只要可產(chǎn)生抗此種生物分子物質(zhì)的高度特異性抗體以便用免疫-PCR檢測該抗體即可。核酸分子用作標(biāo)記或探針時，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增它以便產(chǎn)生信號。核酸擴增的非常高的效率和結(jié)合的高度特異性導(dǎo)致，與檢測靶分子的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如ELISA法) 相比靈敏度提高100至10，000倍。IPCR是1992年開發(fā)的(Sano ^ (1992))。術(shù)語“逆轉(zhuǎn)錄”指將mRNA轉(zhuǎn)錄成DNA (所謂〃 cDNA")的方法，其中通常使用逆轉(zhuǎn)錄酶(也稱為RNA依賴性DNA聚合酶)。后者首先通過RNA依賴性聚合酶活性由單鏈RNA 合成RNA-DNA雜交體鏈。該蛋白的獨立部分，即RNA酶H部分負(fù)責(zé)隨后降解RNA部分。再通過DNA依賴性DNA聚合酶活性從單鏈DNA鏈形成雙鏈DNA。然后，用PCR擴增和檢測以此方式產(chǎn)生的cDNA。與其他DNA聚合酶相同的是，逆轉(zhuǎn)錄酶也需要引物來啟動DNA合成。在這種情況下，常常使用所謂的寡d(T)引物，即多個胸腺嘧啶堿基，它與mRNA的3'末端的聚㈧尾互補。常常聯(lián)合使用逆轉(zhuǎn)錄和后續(xù)PCR(也稱為RT-PCR)來檢測樣品中一種或多種mRNA 的含量，例如用于基因表達分析、產(chǎn)生基因表達概況等。在所謂的“兩步RT-PCR”中，使用不同引物等進行逆轉(zhuǎn)錄和后續(xù)PCR，而在“一步RT-PCR”中，用于逆轉(zhuǎn)錄的基因特異性引物也可以用于后續(xù)PCR，以便在同一容器中連續(xù)進行這兩個反應(yīng)。根據(jù)所用逆轉(zhuǎn)錄酶(通常是病毒來源的)在較低溫度下具有變性作用，而正如眾所周知的那樣，所用DNA聚合酶(如Taq 聚合酶)只在相對較高的溫度下具有變性作用，因此進行逆轉(zhuǎn)錄的溫度低于后續(xù)PCR的溫度。優(yōu)選采用熱可逆性抑制的所謂的“熱啟動”DNA聚合酶。從逆轉(zhuǎn)錄的較低溫度水平到 PCR的較高溫度水平轉(zhuǎn)變時，一方面能變性逆轉(zhuǎn)錄酶，另一方面能通過消除熱可逆性抑制激活DNA聚合酶。所述熱可逆性抑制可通過，例如，采用結(jié)合DNA聚合酶活性中心的抗體實現(xiàn)， 或者也可通過，例如，用醛可逆性地共價或非共價化學(xué)修飾聚合酶實現(xiàn)(參見例如，本申請人的US6, 183，998)。綜述還可參見Birch等(1996)。術(shù)語“實時PCR”也指定量PCR或qPCR(避免與逆轉(zhuǎn)錄PCR相混淆)，它是基于已知聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的原理，也能定量測定擴增的DNA。在PCR循環(huán)期間記錄熒光測量值，從而進行定量測定(因此稱為“實時”)。熒光與PCR產(chǎn)物量成正比。在運行(由多個循環(huán)組成)結(jié)束時，在PCR指數(shù)期根據(jù)接受到的熒光信號進行定量測定。只有在PCR指數(shù)期(在運行中持續(xù)數(shù)個循環(huán))才可能正確定量，因為在此期間存在最優(yōu)反應(yīng)條件。因此，該方法不同于只能在PCR(如競爭性PCR)進行之后進行定量分析，且通常包括PCR片段的凝膠電泳分離的其它定量PCR方法。染料如溴化乙啶、STOR綠I和FRET探針或所謂的雙染料寡核苷酸(也稱為I1aqMan 探針)均適合于該檢測。術(shù)語“CT值”(閾值循環(huán)數(shù))指第一次可檢測到擴增產(chǎn)物的PCR循環(huán)數(shù)；通常測定熒光，表明第一次比背景熒光顯著提高的最近一個循環(huán)。在PCR反應(yīng)的前期，模板(即待擴增DNA)量仍然有限，然而在擴增后期，產(chǎn)物量增加時受到已有產(chǎn)物的抑制，產(chǎn)物片段互相雜交的比例升高，初始產(chǎn)物逐步被耗盡。只有在這兩個階段之間，擴增循環(huán)數(shù)和擴增產(chǎn)物量之間存在指數(shù)關(guān)系(“指數(shù)期”)。用所述Ct值確
8定指數(shù)期開始的時間點。而且，低Ct值表明少數(shù)PCR循環(huán)就足以使熒光第一次顯著增加到背景噪聲以上 (即存在相對大量模板)，而高Ct值相應(yīng)地表明需要大量PCR循環(huán)才能達到這一目的(即存在較少的模板)。術(shù)語“酶聯(lián)免疫吸附實驗”(ELISA)指基于酶促顏色反應(yīng)的免疫檢測方法。使用ELISA時，可能檢測樣品(血清、奶、尿液等)中的蛋白質(zhì)、病毒和低分子量化合物如激素、毒素和殺蟲劑。在這方面，利用特異性抗體結(jié)合待檢測物質(zhì)(抗原)的特性。 事先用酶標(biāo)記抗體或抗原。酶催化的反應(yīng)用作存在抗原的證據(jù)。酶轉(zhuǎn)化所謂的底物，通常通過顏色變化、熒光或化學(xué)發(fā)光檢測反應(yīng)產(chǎn)物。信號強度通常與抗原濃度相關(guān)，因此ELISA 也可用于定量檢測。下述術(shù)語“雜交捕獲試驗”(HCA)指將所研究的靶DNA與RNA樣品儀器孵育形成 RNA-DNA雜交體的方法。雜交體結(jié)合于表面，然后用酶標(biāo)記的抗體孵育。具體說，雜交捕獲試驗用于雙基因公司(Digene)的HPV試驗。下述術(shù)語“嵌套式PCR”指將已被擴增的DNA片段再次擴增的方法；該方法用第一次反應(yīng)所用的弓I物對內(nèi)側(cè)的第二個引物對進行。發(fā)明目的本發(fā)明的目的是至少基本克服現(xiàn)有技術(shù)中的所述缺點，并提供，特別是可廣泛應(yīng)用的歸一化樣品中生物分子含量的方法、應(yīng)用和/或設(shè)備。本發(fā)明的一個具體目的是提供更適合歸一化樣品中的生物分子，并適合與上述一步法和兩步法一起使用的方法、應(yīng)用和/或設(shè)備。另一目的是提供可廣泛應(yīng)用的歸一化樣品中核酸含量的方法、應(yīng)用和設(shè)備。另一目的是提供可廣泛應(yīng)用的歸一化逆轉(zhuǎn)錄RNA，優(yōu)選mRNA產(chǎn)生的cDNA的含量的方法、應(yīng)用和設(shè)備。另一目的是提供可廣泛應(yīng)用的歸一化樣品中核酸，具體是RNA含量的方法、應(yīng)用和設(shè)備。具體說，本發(fā)明的一個目的是提供歸一化樣品中生物分子的方法、應(yīng)用和設(shè)備，其特征是準(zhǔn)確度和重復(fù)性高。另一目的是提供歸一化樣品中核酸含量的方法、應(yīng)用和設(shè)備，其允許多次使用反應(yīng)容器。通過本發(fā)明的獨立方法權(quán)利要求所述的方法實現(xiàn)這些目的。因此，提供一種用于歸一化樣品中生物分子含量的方法，其包括以下步驟a)提供反應(yīng)容器，該容器的容器表面至少部分官能化，優(yōu)選在容器內(nèi)部官能化，以使該容器表面能夠在高鹽條件下可逆地結(jié)合生物分子，b)進行至少一個樣品制備步驟，c)在高鹽條件下使所制備樣品中的生物分子結(jié)合于容器表面(“結(jié)合和歸一化步驟”)，d)任選洗滌(“洗滌步驟”)，和e)進行至少一個后續(xù)反應(yīng)。與現(xiàn)有技術(shù)的已知方法不同，在本發(fā)明中反應(yīng)容器的表面第一次用作在高鹽條件下可逆地結(jié)合確定量生物分子的吸附表面，因此用作歸一化樣品中生物分子含量的裝置。 因此，將該反應(yīng)容器的表面官能化以使其能夠在高鹽條件下可逆地結(jié)合生物分子。官能化的類型也具體取決于結(jié)合的生物分子類型。這將在下文中進一步討論。通過表面大小、樣品接觸的表面、該表面的化學(xué)官能化類型、生物分子與表面的孵育時間和所用結(jié)合緩沖液的嚴(yán)格性來調(diào)整該表面可結(jié)合的生物分子的量。而且，所述高鹽條件(定義如上)有助于使存在的任何RNA酶失活。不像電荷開關(guān)物質(zhì)和陰離子交換劑中存在低鹽條件那樣，這能保證樣品中所含RNA可以基本完全和完整地分離，并供給檢測步驟。在現(xiàn)有技術(shù)中如前所述的所謂的“兩步法”中，需要至少一個額外的吸移步驟，以便將分離的生物分子轉(zhuǎn)移到新反應(yīng)容器中，然后進行后續(xù)反應(yīng)(如果需要)。該步驟也視作在cDNA水平歸一化的機會。以此方式可補償細(xì)胞輸入、RNA質(zhì)量和數(shù)量以及RT效率的差異，因此可比較和解釋該結(jié)果。在一步法RT-PCR中，使用本文提及的方法在RNA輸入水平進行歸一化，因為cDNA 原位合成且與聚合酶直接反應(yīng)。以此方式可補償細(xì)胞輸入以及RNA質(zhì)量和數(shù)量的差異。前述與這些步驟相關(guān)聯(lián)的缺點在本發(fā)明方法中不復(fù)存在。生物分子可逆地結(jié)合本發(fā)明反應(yīng)容器的表面，直到本發(fā)明表面被飽和，從而歸一化生物分子的量。因此，在本發(fā)明方法中不再需要單獨對分離的生物分子進行定量的步驟。而且，后續(xù)反應(yīng)可直接在本發(fā)明容器中進行，無需額外的吸移步驟。這種歸一化還有根據(jù)各種樣品的細(xì)胞輸入、RNA質(zhì)量/數(shù)量和逆轉(zhuǎn)錄效率的不同校正表達數(shù)據(jù)的優(yōu)點(后一原理僅適用于兩步法RT-PCR)。優(yōu)選將所述后續(xù)反應(yīng)與樣品制備步驟在同一容器中進行。然而，這不是絕對必需的。例如，結(jié)合和歸一化步驟后，可從反應(yīng)容器中取出一個或多個等份并轉(zhuǎn)移到一個或多個新反應(yīng)容器中，以便在其它反應(yīng)容器中進行至少一個后續(xù)反應(yīng)。特別優(yōu)選的是，所述生物分子是核酸。具體說，可以利用常規(guī)擴增方法，例如PCR檢測核酸。然而，所述生物分子通常也可以是可用抗體檢測的任何生物分子。具體考慮的是可用寡核苷酸-標(biāo)記的抗體(“免疫-PCR”)或用ELISA(見下)檢測的蛋白質(zhì)。所述至少一個樣品制備步驟也優(yōu)選選自下組 細(xì)胞裂解， 細(xì)胞變性， 分離生物分子， 純化生物分子， 從RNA到DNA的逆轉(zhuǎn)錄(RT)，和/或 酶促反應(yīng)和/或樣品加工。所述的酶促反應(yīng)和/或樣品加工可能優(yōu)選包括用RNA酶、DNA酶和/或蛋白酶消化樣品。所述至少一個后續(xù)步驟也優(yōu)選選自下組 擴增反應(yīng)， 酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)，和/或
雜交捕獲試驗。特別優(yōu)選的是，所述擴增反應(yīng)是選自下組的反應(yīng) 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)， 嵌套式 PCR， 逆轉(zhuǎn)錄(RT)， 免疫-PCR。然而，通?？商峁┧鲋辽僖环N生物分子的任何其它可能的檢測反應(yīng)。本發(fā)明方法的一個特別合適的例子是包括以下步驟的方法從mRNA至cDNA的逆轉(zhuǎn)錄(樣品制備步驟)，通過結(jié)合于容器表面歸一化形成的cDNA (結(jié)合和歸一化步驟)和隨后通過實時PCR檢測cDNA的擴增(后續(xù)反應(yīng))。該方法在表1中稱為“工作流程1”。在這種方法中，在本發(fā)明容器中直接進行逆轉(zhuǎn)錄，孵育后產(chǎn)生的cDNA可逆地結(jié)合于本發(fā)明表面。因而表面被飽和，以此方式可能結(jié)合確定量的cDNA。在后續(xù)洗滌步驟中去除過量的cDNA。洗滌步驟后，可在同一反應(yīng)容器中對cDNA進行實時PCR。與現(xiàn)有技術(shù)的方法相比，本發(fā)明此種方法的優(yōu)點是在逆轉(zhuǎn)錄后既不需要對所得 cDNA進行定量測定的步驟也不需要額外的吸移到新反應(yīng)容器的步驟。這導(dǎo)致方法簡化或縮短，因而顯著降低了勞動量和/或操作成本，并降低了額外吸移步驟引起的交叉污染和/或不準(zhǔn)確的風(fēng)險。與現(xiàn)有技術(shù)的方法相比，本發(fā)明此種方法的另一個優(yōu)點是，盡管不用對所得的 cDNA進行定量測定，但不管最初使用的RNA用量是多少都將有歸一化量的cDNA用于PCR。 此外，可以在25 μ L體積中進行操作，這是PCR中的慣用體積，因此會顯著節(jié)約成本。逆轉(zhuǎn)錄以及后續(xù)PCR優(yōu)選在同一容器中進行，如上所述。然而，也可以在結(jié)合和歸一化步驟后，從反應(yīng)容器中取出一個或多個等份并轉(zhuǎn)移到一個或多個新反應(yīng)容器中，以便在其它反應(yīng)容器中進行PCR。本發(fā)明方法的另一合適例子是能夠裂解樣品且隨后收獲mRNA，例如使用恰根 (QIAGEN)產(chǎn)品RNA輕便試劑盒(RNeasy)，或者分離mRNA，例如使用恰根產(chǎn)品OT試劑盒 (Oligotex)和/或TC試劑盒(TurboCapture)(樣品制備步驟)；通過結(jié)合于容器表面歸一化釋放或分離的mRNA(結(jié)合和歸一化步驟)；隨后從mRNA至cDNA的逆轉(zhuǎn)錄(后續(xù)反應(yīng)) 的方法。任選地，逆轉(zhuǎn)錄可后接額外的結(jié)合和歸一化步驟和額外的后續(xù)反應(yīng)，例如對所產(chǎn)生 cDNA進行實時PCR (見表1，工作流程6)?；蛘撸蓪⒑唵蔚碾s交反應(yīng)用作后續(xù)反應(yīng)；在這種情況下可省略額外的結(jié)合和歸一化步驟(見表1，工作流程2)。本發(fā)明方法的工作流程的其它例子見表1。工作流程1-5包括一步法，因為在這些方法過程中，不需要打開反應(yīng)容器加入新反應(yīng)試劑。工作流程6是一個兩步法，因為在這種情況下在mRNA水平和cDNA水平進行歸一化；即在兩個反應(yīng)之間打開容器以啟動第二個結(jié)合和歸一化步驟。
權(quán)利要求
1.一種用于歸一化樣品中生物分子含量的方法，其包括以下步驟a)提供反應(yīng)容器，該容器的容器表面至少部分官能化，優(yōu)選在容器內(nèi)部官能化，以使該容器表面能夠在高鹽條件下可逆地結(jié)合生物分子，b)進行至少一個樣品制備步驟，c)在高鹽條件下使所制備樣品中的生物分子結(jié)合于容器表面(“結(jié)合和歸一化步驟”)，d)任選洗滌(“洗滌步驟”)，和e)進行至少一個后續(xù)反應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物分子是核酸。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述至少一個樣品制備步驟選自下組 細(xì)胞裂解，細(xì)胞變性， 分離生物分子， 純化生物分子，從RNA到DNA的逆轉(zhuǎn)錄，和/或酶促反應(yīng)和/或樣品加工。
4.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述至少一個后續(xù)反應(yīng)選自下擴增反應(yīng)，酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)，和/或雜交捕獲試驗。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述擴增反應(yīng)是選自下組的反應(yīng) 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，逆轉(zhuǎn)錄(RT)，環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增(LAMP)，基于核酸序列的擴增(NASBA)，滾環(huán)鏈反應(yīng)(RCCI )或滾環(huán)擴增(RCA)，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)，連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，嵌套式PCR，和/或免疫-PCR。
6.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，a)在結(jié)合和歸一化步驟中使用結(jié)合緩沖液，和/或b)在洗滌步驟中使用洗滌緩沖液。
7.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，至少部分官能化的所述容器表面含有a)硅烷醇基，b)不飽和的有機酸，c)羧基、磺酸鹽/酯基團和其它極性基團，和/或d)含羥基的金屬氧化物和半金屬氧化物。
8.一種用于實施前述權(quán)利要求中任一項所述方法的反應(yīng)容器，其中所述反應(yīng)容器的容器表面至少部分官能化，優(yōu)選在容器內(nèi)部官能化，以使該容器表面能夠在所述工藝條件下可逆地結(jié)合生物分子。
9.如權(quán)利要求8所述的反應(yīng)容器，其特征在于，至少部分官能化的所述容器表面含有a)硅烷醇基，b)不飽和的有機酸，c)羧基、磺酸鹽/酯基團和其它極性基團，和/或d)含羥基的金屬氧化物和半金屬氧化物。
10.如權(quán)利要求9所述的反應(yīng)容器，其特征在于，權(quán)利要求9中所述的官能團a)通過等離子體涂布法施加于反應(yīng)容器的材料上，b)通過濕化學(xué)法施加于反應(yīng)容器的材料上，和/或c)由反應(yīng)容器本身的材料特性決定。
11.一種用于實施前述權(quán)利要求中任一項所述方法的試劑盒，其至少包括a)結(jié)合緩沖液，b)洗滌緩沖液，c)實施樣品制備步驟，優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄(RT)的任選試劑，d)實施后續(xù)反應(yīng)，優(yōu)選聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的任選試劑，和e)任選包括至少一個如權(quán)利要求8-10中任一項所述的反應(yīng)容器。
12.如前述權(quán)利要求中任一項所述的試劑盒或方法，其特征在于，所述洗滌緩沖液含有水、Tris、絡(luò)合劑、多元醇、去污劑以及聚合物、共聚物和/或三元共聚物。
13.如前述權(quán)利要求中任一項所述的試劑盒或方法，其特征在于，所述結(jié)合緩沖液含有離液物質(zhì)。
14.如權(quán)利要求13所述的試劑盒或方法，其特征在于，所述離液物質(zhì)是選自下組的至少一種物質(zhì)鹽酸胍，(異)硫氰酸胍，碘化鈉，碘化鉀，(異)硫氰酸鈉，和/或尿素，或其混合物。
15.前述權(quán)利要求中任一項所述的反應(yīng)容器和/或試劑盒在歸一化樣品中生物分子含量中的應(yīng)用。
16.前述權(quán)利要求中任一項所述的反應(yīng)容器和/或試劑盒在歸一化cDNA含量中的應(yīng)用，其中所述cDNA是在所述反應(yīng)容器中通過逆轉(zhuǎn)錄(RT)由RNA，優(yōu)選mRNA產(chǎn)生的并且所述 cDNA隨后進行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。
17.—種檢測生物分子，優(yōu)選核酸，特別優(yōu)選RNA的方法，包括前述權(quán)利要求中任一項所述的方法步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種歸一化樣品中生物分子含量的方法，其包括以下步驟a)提供反應(yīng)容器，該容器的容器表面至少部分官能化，優(yōu)選在容器內(nèi)部官能化，以使該容器表面能夠在高鹽條件下可逆地結(jié)合生物分子；b)進行至少一個樣品制備步驟；c)在高鹽條件下使所制備樣品中的生物分子結(jié)合于容器表面(“結(jié)合和歸一化步驟”)；d)任選洗滌(“洗滌步驟”)；和e)進行至少一個后續(xù)反應(yīng)(圖6b)。本申請還涉及用于上述方法的反應(yīng)容器。
文檔編號B05D7/24GK102159333SQ200980137018
公開日2011年8月17日 申請日期2009年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月17日
發(fā)明者C·埃爾巴赫, P·格魯內(nèi)費德 申請人:恰根有限公司