專利名稱：疏水蛋白在防止表面結(jié)冰中的應(yīng)用的制作方法
疏水蛋白在防止表面結(jié)冰中的應(yīng)用本發(fā)明涉及疏水蛋白在防止表面結(jié)冰中的應(yīng)用，特別是防止在硬表面上結(jié)冰。表面結(jié)冰，例如飛機(jī)或機(jī)動(dòng)車的表面，會(huì)帶來(lái)相當(dāng)多的安全問(wèn)題；并且在極端 情況下，冰封的飛機(jī)或機(jī)動(dòng)車無(wú)法再運(yùn)轉(zhuǎn)。表面結(jié)冰也會(huì)導(dǎo)致所討論的部件的性質(zhì)發(fā)生 不期望的變化。例如，在風(fēng)力渦輪機(jī)的情況下，由于結(jié)冰，風(fēng)輪機(jī)的空氣動(dòng)力學(xué)性質(zhì)會(huì) 發(fā)生變化。因此，已知存在用于除去冰層或防止表面結(jié)冰的各種技術(shù)。就其實(shí)際意義而言，除冰應(yīng)當(dāng)理解為是指主動(dòng)除去表面上已經(jīng)存在的雪或冰 層。這包括如下技術(shù)，諸如采用適當(dāng)工具，簡(jiǎn)單地從表面機(jī)械刮除冰。由于在其為飛 機(jī)的情況下，在飛行過(guò)程中當(dāng)然這是不可能的，因此許多飛機(jī)裝備有所謂的“防冰裝 置(boots)”。這些防冰裝置是置于飛機(jī)上特別受到威脅的部位上(如機(jī)翼的前端、翼 面(aerofoil)或方向舵)的橡膠軟管，如果需要的話，其能被吹脹，從而以爆炸的方式除 冰。關(guān)于這一點(diǎn)，進(jìn)一步的細(xì)節(jié)已由，例如GB1,166,526或W002/42150所公開(kāi)。此 外，可采用由管道系統(tǒng)轉(zhuǎn)來(lái)的發(fā)動(dòng)機(jī)廢熱將冰融化，例如，如US 6,267,328所公開(kāi)的那 樣。但是，這種方法只有在相對(duì)較大的飛機(jī)的情況下才是可行的；而且效果越來(lái)越不理 想，這是因?yàn)楝F(xiàn)代飛機(jī)的發(fā)動(dòng)機(jī)的能效變得比以往更高，產(chǎn)生的廢熱更少了。此外，可 在特別受到威脅的部位上，安置電熱膜(GB787954)。采用化學(xué)品除冰也是已知的。典型的除冰流體通常是由水以及特定比例的乙二 醇和/或丙二醇組成的。參見(jiàn)例如GB 2,050,398，WO 00/00568或WO 07/104996。除 冰流體能使冰點(diǎn)降低，從而使表面上沒(méi)有冰。在飛行中，除冰流體可從翼面上的孔中噴 出。US 6,861,009公開(kāi)了含有蛋白質(zhì)的除冰組合物。其提出，特別是采用農(nóng)業(yè)或畜牧業(yè) 中普遍采用的蛋白質(zhì)。除了對(duì)已經(jīng)結(jié)冰的表面進(jìn)行主動(dòng)除冰，也提出了從一開(kāi)始就防止表面結(jié)冰的技 術(shù)(防冰技術(shù))，從而使得不再需要進(jìn)行隨后的除冰操作。為此，例如，可為表面提供防冰涂料。在航空領(lǐng)域，為此目的可采用例如冰點(diǎn) 降低涂料，所述涂料是由乙二醇和/或丙二醇與水的增稠混合物組成的。但是，這些涂 料的粘結(jié)力太弱，以至于它們會(huì)在數(shù)分鐘直至最高為數(shù)小時(shí)內(nèi)，從飛機(jī)的翼面上流走， 從而無(wú)法再提供防冰效果。此外，用于防止結(jié)冰的疏水涂料是已知的。例如，JP-A 60-208373公開(kāi)了用于 涂覆的組合物，其含有甲基硅氧烷、丙烯?；s水甘油醚、基于聚硅氧烷的增稠劑、環(huán) 氧樹(shù)脂、Teflon粉末以及氟磷酸酯。US 6,702,953公開(kāi)了以溶膠-凝膠法制備的涂料，其 是由疏水基體和多組分冰點(diǎn)降低劑組成的。所述冰點(diǎn)降低劑是由醇鹽前體組成的，所述 醇鹽前體能延緩多元醇在涂層的表面的出現(xiàn)。疏水蛋白是具有約100 150個(gè)氨基酸的小蛋白質(zhì)，其存在于絲狀真菌中，如裂 褶菌(Schizophyllum commune)。它們通常具有8個(gè)半胱氨酸單元。疏水蛋白可從天然源 中分離，也可通過(guò)重組法獲得，如WO 2006/082251或WO 2006/131564所公開(kāi)的那樣?，F(xiàn)有技術(shù)已提出了將疏水蛋白用于各種應(yīng)用場(chǎng)合。WO 96/41882提出了將疏水蛋白用作乳化劑、增稠劑、表面活性劑，用于使疏水表面親水化，用于提高親水基材的水穩(wěn)定性，以及用于制備水包油型乳液或者油包水 型乳液。還提出了其藥物應(yīng)用，如軟膏或乳膏的制備；以及化妝品應(yīng)用，如護(hù)膚、或者 洗發(fā)劑或洗發(fā)液的制備。EP 1 252 516公開(kāi)了用溶液對(duì)各種基材進(jìn)行涂覆，所述溶液含有 溫度為30 80°C的疏水蛋白。WO 2006/082253公開(kāi)了用pHM的融合疏水蛋白對(duì)表面 進(jìn)行涂覆。US 2006 0024417公開(kāi)了含有疏水蛋白的充氣或起泡食品，例如冰激凌或慕司。 US 2006 0024419公開(kāi)了含有疏水蛋白的冷凍組合物，例如食品。其還公開(kāi)了用于抑制 冷凍產(chǎn)品中冰晶體的生長(zhǎng)的方法，其中，在待冷凍的產(chǎn)品中或者在冷凍過(guò)程中，加入疏 水蛋白。在這兩種情況下，在每種情況下都優(yōu)選采用II類疏水蛋白。與I類疏水蛋白相 比，II類疏水蛋白是易溶的。迄今為止，采用疏水蛋白來(lái)防止表面結(jié)冰仍然是未知的。本發(fā)明的目標(biāo)是提供用于防止表面結(jié)冰的簡(jiǎn)單方法。因此，我們發(fā)現(xiàn)了疏水蛋白在防止表面結(jié)冰中的應(yīng)用，其是用至少一種疏水蛋 白，對(duì)未被冰覆蓋的表面進(jìn)行處理。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述表面是飛機(jī)表面。就本發(fā)明而言，可做如下具體說(shuō)明在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“疏水蛋白”，在下文中應(yīng)當(dāng)理解為是指通式⑴的 多肽 X _C1-X1_50_C2-Xo-5_C3-X1_1oo_C4-X1_1oo_C5-X1_50_C6-Xo-5_C7-X1_50_C8-Xm (I)其中，X可為20種天然存在的氨基酸中的任意一個(gè)(Phe、Leu、Ser、Tyr、 Cys> Trp> Pro、His、Gin、Arg> lie、Met、Thr> Asn> Lys> VaL Ala、Asp、Glu> Gly)。在該式中，在每種情況下，X殘基可相同或不同。X旁邊的指數(shù)每個(gè)都表示特定 的部分序列X中的氨基酸的數(shù)量；C為半胱氨酸、丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或 蘇氨酸，其中至少四個(gè)由C表示的殘基為半胱氨酸；指數(shù)η和m彼此獨(dú)立地為0 500， 優(yōu)選為15 300的自然數(shù)。式⑴的多肽也可通過(guò)如下性質(zhì)加以表征在室溫下，在涂覆玻璃表面之后，它 們能使水滴的接觸角增大至少20°，優(yōu)選為至少25°，更優(yōu)選為30°，在每種情況下都 是與同樣大小的水滴與未涂覆的玻璃表面之間的接觸角進(jìn)行比較的。C1 C8所表示的氨基酸優(yōu)選為半胱氨酸。但是，它們也可被具有類似的空間 填充(space filling)效應(yīng)的其他氨基酸所代替，優(yōu)選被丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸 或甘氨酸所代替。但是，至少4個(gè)，優(yōu)選為至少5個(gè)，更優(yōu)選地為至少6個(gè)，特別地為 至少7個(gè)位置上的C1 C8應(yīng)當(dāng)由半胱氨酸所構(gòu)成。在本發(fā)明的蛋白質(zhì)中，半胱氨酸可 為還原形式，或者彼此形成二硫橋鍵。特別優(yōu)選地形成分子內(nèi)C-C橋鍵，特別是具有至 少1個(gè)分子內(nèi)二硫橋鍵，優(yōu)選為2個(gè)，更優(yōu)選為3個(gè)，最優(yōu)選為4個(gè)分子內(nèi)二硫橋鍵的那 些。在如上文所述用具有類似空間填充效應(yīng)的氨基酸代替半胱氨酸的情況下，那些能彼 此形成分子內(nèi)二硫橋鍵的C位置有利地被成對(duì)代替。如果半胱氨酸、絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或蘇氨酸也用于X所表示的 位置中，通式中各個(gè)C位置的編號(hào)可相應(yīng)變化。優(yōu)選采用通式(II)的疏水蛋白來(lái)實(shí)施本發(fā)明
X _C1-X3-25_C2-Xo-2_C3-X5-50_C4-X2-35_C5-X2-i5_C6-Xo-2_C7-X3-35_C8-Xm (II)其中，X、C以及X和C旁邊的指數(shù)各自如上文所定義；指數(shù)η和m各自為0 350，優(yōu)選為15 300的數(shù)；所述蛋白質(zhì)還具有上文所述的改變接觸角的性質(zhì)；而且， 至少6個(gè)C表示的殘基是半胱氨酸。更優(yōu)選地，所有的C殘基都是半胱氨酸。特別優(yōu)選地采用通式(III)的疏水蛋白xn-c1-x5_9-c2-c3-x11_39-c4-x2_23-c5-x5_9-c6-c7-x6_18-c8-xm (III)其中，X、C以及X和C旁邊的指數(shù)各自如上文所定義；指數(shù)η和m各自為0 200的數(shù)；所述蛋白質(zhì)還具有上文所述的改變接觸角的性質(zhì)；并且，至少6個(gè)C表示的殘 基是半胱氨酸。更優(yōu)選地，所有的C殘基都是半胱氨酸。X1^PXm殘基可為也是天然連接到疏水蛋白上的肽序列。但是，一個(gè)殘基或兩 個(gè)殘基也可為不是天然連接到疏水蛋白上的肽序列。這也應(yīng)當(dāng)理解為是指如下那些Xn和 /或Xm殘基，其中天然存在于疏水蛋白中的肽序列，被不是天然存在于疏水蛋白中的肽 序列所延長(zhǎng)。如果Xn和/或Xm不是天然鍵接到疏水蛋白上的肽序列，這種序列的長(zhǎng)度通常至 少為20個(gè)，優(yōu)選為至少35個(gè)氨基酸。它們可為，例如，具有20 500個(gè)，優(yōu)選為30 400個(gè)，更優(yōu)選地為35 100個(gè)氨基酸的序列。這種不是天然連接到疏水蛋白上的殘基， 在下文中也稱作融合配偶體(fosionpartner)。其旨在表示，所述蛋白質(zhì)可由至少一種疏水 蛋白片段和在自然界中不是以這種形式一起出現(xiàn)的融合配偶體片段構(gòu)成。由融合配偶體 和疏水蛋白片段構(gòu)成的融合疏水蛋白已描述在，例如W02006/082251、W02006/082253 和 WO 2006/131564 中。所述融合配偶體片段可選自多種蛋白質(zhì)?？赡苤挥袉蝹€(gè)融合配偶體鍵接到所述 疏水蛋白片段上，或者也有可能多個(gè)融合配偶體連接到一個(gè)疏水蛋白片段上，例如連接 到所述疏水蛋白片段的端氨基(Xn)和端羧基(Xm)上。但是，還有可能將例如兩個(gè)融合 配偶體連接到本發(fā)明的蛋白質(zhì)的一個(gè)位置(又或乂」上。特別適當(dāng)?shù)娜诤吓渑俭w為微生物中，特別是大腸桿菌(Exoli)或枯草芽孢桿 菌(Bacillus Subtilis)中天然存在的蛋白質(zhì)。這種融合配偶體的例子為序列yaad (WO 2006/082251 中的 SEQ IDNO 16)、yaae (WO 2006/082251 中的 SEQ ID NO 18)、泛素 和硫氧還蛋白。還非常適當(dāng)?shù)氖沁@些序列的片段或衍生物，其僅僅含有一些，例如70 99%,優(yōu)選為5 50%，更優(yōu)選地為10 40%的所述序列，或者與所述序列相比，其中 有各氨基酸或核苷酸發(fā)生了變化，在上述情況下，所述百分?jǐn)?shù)各自基于氨基酸的數(shù)量。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述融合疏水蛋白，以及作為又或乂 1基團(tuán)中的一 個(gè)或者作為這種基團(tuán)的端基取代基加以提及的融合配偶體，還具有所謂的親和域(affinity domain)(親和標(biāo)簽/親和尾)。以原則上已知的方式，這包括錨定基團(tuán)，所述基團(tuán)能與特 定的互補(bǔ)基團(tuán)相互作用，并且能起到更容易對(duì)所述蛋白質(zhì)進(jìn)行后處理和提純的作用。這 種親和域的例子包括(His)k、(Arg)k, (Asp)k, (Phe)k或(Cys)k基團(tuán)，其中，k通常為 1 10的自然數(shù)。其可優(yōu)選為(His)k基團(tuán)，其中k為4 6。在這種情況下，所述Xn 和/或Xm基團(tuán)可僅僅由這種親和域構(gòu)成，或者天然鍵接或不是天然鍵接到疏水蛋白上的 Xn或Xm殘基被端親和域延長(zhǎng)。也可對(duì)用于本發(fā)明的疏水蛋白的多肽序列進(jìn)行改性，例如通過(guò)糖基化、乙?；?，或者通過(guò)化學(xué)交聯(lián)，如用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)。用于本發(fā)明的疏水蛋白或其衍生物的一個(gè)性質(zhì)為，當(dāng)用所述蛋白質(zhì)涂覆表面 時(shí)，表面性質(zhì)會(huì)發(fā)生變化。表面性質(zhì)的變化可通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，例如，通過(guò)測(cè)量用所述蛋 白質(zhì)對(duì)表面進(jìn)行涂覆前后的水滴接觸角，并確定兩個(gè)測(cè)量結(jié)果之差。原則上，接觸角測(cè)試的實(shí)施，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的。所述測(cè)試是基 于室溫以及5μ1的水滴的，并采用玻璃板作為基材。作為測(cè)量接觸角的適當(dāng)方法的一個(gè) 例子的精確實(shí)驗(yàn)條件，將在實(shí)驗(yàn)部分給出。在其所述的條件下，用于本發(fā)明的融合蛋白 具有將接觸角提高至少20°，優(yōu)選為至少25°，更優(yōu)選地為至少30°的性質(zhì)，在每種情 況下都是與同樣大小的水滴與未涂覆的玻璃表面之間的接觸角進(jìn)行比較的。用于實(shí)施本發(fā)明的特別優(yōu)選的疏水蛋白為dewA、rodA、hypA、hypB、sc3、 basfl、basi2型疏水蛋白。這些疏水蛋白，包括其序列，已公開(kāi)在，例如WO 2006/82 251 中。除非另有說(shuō)明，下文所述的序列是基于W02006/82251中所公開(kāi)的序列的。SEQID 序號(hào)的綜述表可參見(jiàn)W02006/82251第20頁(yè)。根據(jù)本發(fā)明，特別適當(dāng)?shù)臑槿诤系鞍讁aad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO 20)、 yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO 22)或者 yaad-Xa-basfl-his (SEQ IDNO 24)，其具有括 號(hào)中所述的多肽序列以及對(duì)其進(jìn)行編碼的核酸序列，特別是SEQ ID NO: 19、21、23序 列。更優(yōu)選地，可采用yaad-Xa-dewA-his (SEQ IDNO : 20)。如下蛋白質(zhì)也是特別優(yōu)選 的實(shí)施方式所述蛋白質(zhì)起始自SEQIDN0.20、22或24所示的多肽序列，通過(guò)將至少為 1個(gè)直至10個(gè)，優(yōu)選為5個(gè)氨基酸，更優(yōu)選地為所有氨基酸的5%，進(jìn)行交換、插入或缺 失而獲得，其仍然具有起始蛋白質(zhì)至少50%的生物學(xué)性質(zhì)。此處，所述蛋白質(zhì)的生物學(xué) 性質(zhì)應(yīng)當(dāng)理解為是指，使接觸角改變至少20°，這已在上文加以描述了。特別適于實(shí)施本發(fā)明的衍生物是衍生自yaad-Xa-dewA-his (SEQ IDNO 20)、 yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO 22)或 yaad-Xa_basfl-his(SEQ IDNO 24)的、通過(guò)將 yaad融合配偶體截短而獲得的衍生物。不采用具有294個(gè)氨基酸的完整yaad融合配偶體 (SEQ ID NO 16)，有利地可采用截短的yaad殘基。盡管所述截短的殘基應(yīng)當(dāng)含有至少 20個(gè)，更優(yōu)選地為至少35個(gè)氨基酸。例如，可采用具有20 293個(gè)，優(yōu)選為25 250 個(gè)，更優(yōu)選地為35 150個(gè)，例如35 100個(gè)氨基酸的截短的殘基。這種蛋白質(zhì)的一 個(gè)例子為 yaad40-Xa_dewA-his(WO 2007/014897 中的 SEQ ID NO 26)，其具有被截短 40個(gè)氨基酸的yaad殘基?？衫盟鍪杷鞍着c一個(gè)或多個(gè)融合配偶體之間的切割位點(diǎn)，將所述融合配 偶體分離，并釋放出處于未衍生形式的純疏水蛋白(例如，通過(guò)在蛋氨酸上進(jìn)行的BrCN 切割、Xa因子切割、腸激酶切割、凝血酶切割、TEV切割等)。根據(jù)本發(fā)明，用于改性開(kāi)孔泡沫的疏水蛋白，可通過(guò)已知的肽合成方法化學(xué)制 備，例如通過(guò)Merrifield固相合成法。天然產(chǎn)生的疏水蛋白可通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒?，從天然源中分離得到。參見(jiàn)例如， WoSten等的 Eur.J Cell Bio.63，122-129(1994)或者 WO 96/41882。US2006/0040349 描述了 由嗜熱籃狀菌(Talaromyces thermophilus)制備不含融合
配偶體的疏水蛋白的重組制備法。融合蛋白可優(yōu)選通過(guò)基因工程法制備，其中，將一個(gè)對(duì)所述融合配偶體進(jìn)行編碼的核酸序列，特別地為DNA序列，以及一個(gè)對(duì)所述疏水蛋白片段進(jìn)行編碼的核酸序列 以如下方式進(jìn)行組合使得由于組合的核酸序列的基因表達(dá)的結(jié)果，在宿主生物體內(nèi)產(chǎn) 生所期望的蛋白質(zhì)。這種制備方法已由，例如W02006/082251或W02006/082253所公 開(kāi)。所述融合配偶體能使得疏水蛋白的制備以容易得多的方式進(jìn)行。與不具有融合配偶 體的疏水蛋白相比，用重組法制備融合疏水蛋白能獲得明顯要高的產(chǎn)率。通過(guò)重組法由宿主生物體制備的融合疏水蛋白，能以原則上已知的方式進(jìn)行后 處理，并通過(guò)已知的色譜法提純。在優(yōu)選實(shí)施方式中，可采用W02006/082253第11/12頁(yè)所公開(kāi)的經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)化的后 處理和提純方法。為此，首先從發(fā)酵液中除去發(fā)酵的細(xì)胞，并將其消化，并將細(xì)胞碎片 從包涵體中分離。后者可有利地通過(guò)離心分離進(jìn)行。最后，將包涵體以原則上已知的方 式進(jìn)行消化，例如通過(guò)酸、堿和/或洗滌劑，以釋放出融合疏水蛋白。即使是采用0.1M 的NaOH，在約Ih內(nèi)，通常也可將含有用于本發(fā)明的融合疏水蛋白的包涵體完全溶解。得到的溶液可——如果合適的話，在獲得所期望的pH值后——在不進(jìn)一步提純 的情況下，用于實(shí)施本發(fā)明。但是，所述融合疏水蛋白也可作為固體從溶液中分離。優(yōu) 選地，可通過(guò)噴霧造?；驀婌F干燥的方式進(jìn)行分離，如W02006/082253第12頁(yè)所述。 在所述經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)化的后處理和提純方法之后獲得的產(chǎn)物，除了細(xì)胞碎片的殘余物之外，通 常含有約80 90wt%的蛋白質(zhì)。取決于融合結(jié)構(gòu)和發(fā)酵條件，融合疏水蛋白的含量通常 為30 80wt%，基于所有蛋白質(zhì)的總量。含有融合疏水蛋白的分離產(chǎn)物可作為固體儲(chǔ)存，并且可將其溶解以用于在每種 情況下所期望的介質(zhì)中。所述融合疏水蛋白能以本來(lái)的形式，或者在脫離并除去所述融合配偶體之后， 以“純”疏水蛋白的形式，用于實(shí)施本發(fā)明。切割有利地是在將包涵體分離并溶解之后 進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，所述疏水蛋白用于防止表面結(jié)冰。為此，用疏水蛋白對(duì)未被冰覆 蓋的表面進(jìn)行處理。在下文中，以通常的方式，術(shù)語(yǔ)“冰”應(yīng)當(dāng)理解為是指，能在足夠低的溫度 下，在物體表面上形成的凍結(jié)的水。在本發(fā)明上下文中，所述冰可為所有種類的冰，如 塊狀冰、雪、霜或者凍結(jié)在表面上的表面水。特別地，其是冷表面與特定大氣濕度的空 氣接觸后形成的冰。所述表面可為待防止結(jié)冰的所有種類的表面。特別地，它們可為硬表面，例如 由諸如鋼或鋁的金屬、玻璃、塑料、木材構(gòu)成的表面、石頭表面和混凝土表面。此外， 它們可為存在于其他材料之上的涂層表面。其例子包括航空器和航天器、機(jī)動(dòng)車、摩托車頭盔、所有種類的窗玻璃(如窗 戶玻璃、汽車擋風(fēng)玻璃、飛機(jī)擋風(fēng)玻璃)、鋼結(jié)構(gòu)(如陸上線路桿)、電力線(如陸上的 電力線)的表面、以及用于工業(yè)工廠或電氣工廠中的表面。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述表面是航空器，特別是飛機(jī)的那些表面，以 及冷卻的物體如冰箱和冷凍箱的、以及用于冷卻的液體或冷卻的氣體的管道的表面。但是，所述表面也可為軟質(zhì)表面，例如水果和蔬菜的表面。對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用而言，優(yōu)選采用至少含有水或水性溶劑混合物，以及至少一種疏水蛋白的配方。適當(dāng)?shù)乃匀軇┗旌衔锖兴鸵环N或多種水互溶性溶劑。這些組分的選擇僅 僅被限制到如下程度所述疏水蛋白和其他組分必須能在所述混合物中充分溶解。一般 而言，這些混合物含有至少50wt%，優(yōu)選為至少65wt%，更優(yōu)選地為至少80wt%的水。 適當(dāng)?shù)乃ト苄匀軇┑睦影ㄒ辉?，如甲醇、乙醇或丙醇；高?jí)醇，如乙二醇、丙 二醇或聚醚多元醇；以及醚醇，如丁基乙二醇或甲氧基丙醇。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)所 期望的配方性質(zhì)，在水互溶性溶劑中作出適當(dāng)?shù)倪x擇。例如，對(duì)于低溫應(yīng)用而言，在水 中加入乙二醇和/或丙二醇以降低冰點(diǎn)，這是可取的。用于處理的配方優(yōu)選具有24，優(yōu)選為淡，更優(yōu)選地為》的pH值。特別地， pH值為4 11，優(yōu)選為6 10，更優(yōu)選為7 9.5，最優(yōu)選為7.5 9。例如，pH值可 為7.5 8.5，或者8.5 9。為了獲得所述pH值，所述配方優(yōu)選含有適當(dāng)?shù)木彌_液。本領(lǐng)域技術(shù)人員能根據(jù) 所用的涂料的pH值范圍，選擇適當(dāng)?shù)木彌_液。其例子包括磷酸二氫鉀緩沖液、三(羥甲 基)氨基甲烷緩沖液(Tris緩沖液)、硼砂緩沖液、碳酸氫鈉緩沖液或者磷酸氫鈉緩沖液。 優(yōu)選為Tris緩沖液。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)所期望的配方性質(zhì)，確定溶液中的緩沖液的濃度。本領(lǐng) 域技術(shù)人員通常應(yīng)確保其具有足夠的緩沖能力，以獲得非常恒定的涂覆條件。所發(fā)現(xiàn)的 有用的濃度為0.001mol/l lmol/1，優(yōu)選為0.005mol/l 0.1mol/l，更優(yōu)選地為O.Olmol/ 1 0.05mol/l。此外，所述配方含有至少一種疏水蛋白。應(yīng)當(dāng)理解的是，還能采用不同疏水蛋 白的混合物。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所用的疏水蛋白可為上文所述的融合疏水蛋 白。例如，可采用 yaad-Xa_dewA-his(W02006/082251 的 SEQ ID NO 20)，特別是具 有截短的yaad殘基的產(chǎn)物，例如yaad40-Xa-dewA-his。有利地，可采用由上文所述的經(jīng) 過(guò)簡(jiǎn)化的提純方法所制備的產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)所期望的涂料性質(zhì)，選擇配方中的疏水蛋白的濃度。濃 度越高，通常能獲得更快的涂覆。一般地，發(fā)現(xiàn)有用的濃度為O.lyg/ml lOOOyg/ml， 優(yōu)選為1 μ g/ml 500 μ g/ml，更優(yōu)選地為10 μ g/ml 250 μ g/ml，更進(jìn)一步優(yōu)選地為 30 μ g/ml 200 μ g/ml,例如 50 100 μ g/ml。所用的配方還可任選含有其他組分或添加劑。其他組分的例子包括表面活性劑。適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣?，例如含有聚烷氧基?特別是聚氧化乙烯基的非離子表面活性劑。其例子包括聚氧乙烯硬脂酸酯、烷氧基化 的苯酚等。適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┑钠渌影ň垡叶?20)脫水山梨糖醇單月桂酸酯 (Tween 20),聚乙二醇(20)脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯(Tween 40)、聚乙二醇(20)脫水 山梨糖醇單硬脂酸酯(Tween 60)、聚乙二醇(20)脫水山梨糖醇單油酸酯(Tween 80)、 環(huán)己基甲基-β D-麥芽糖苷、環(huán)己基乙基-i3D_麥芽糖苷、環(huán)己基正己基-i3D_麥芽糖 苷、Ei烷基-β D-麥芽糖苷、正辛基-β D-吡喃麥芽糖苷、正辛基-β D-吡喃葡萄 糖苷、正辛基_α D-吡喃葡萄糖苷、正十二烷?；?糖。其他表面活性劑已公開(kāi)在， 例如W02005/68087的第9頁(yè)第10行 第10頁(yè)第2行中。表面活性劑的濃度一般為 0.001wt%~ 0.5wt%,優(yōu)選為 0.01wt% 0.25wt%，更優(yōu)選地為 0.1wt% 0.2wt%，在每種情況下都基于所述配方的所有組分的量。此外，也可在所述配方 中加入金屬離子，特別是二價(jià)金屬離子。金屬離子能有 助于獲得更均勻的涂料。適當(dāng)?shù)亩r(jià)金屬離子的例子包括，例如，堿土金屬離子如Ca2+ 離子。這些金屬離子可優(yōu)選以可溶于所述配方中的鹽的形式加入，例如以氯化物、硝 酸鹽或碳酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、葡萄糖酸鹽、氫氧化物、乳酸鹽、硫酸鹽、琥珀酸 鹽、酒石酸鹽的形式。例如，可加入CaCl2或MgCl2。溶解度也可任選通過(guò)適當(dāng)?shù)闹?劑加以提高，例如絡(luò)合劑。如果存在的話，這些金屬離子的濃度一般為O.Olmmol/1 10mmol/l,優(yōu)選為 0.1mmol/l 5mmol/l，更優(yōu)選地為 0.5mmol/l 2mmol/l。所述配方可通過(guò)如下方法獲得將由后處理獲得的上文所述的溶液，與所期望 的其他組分混合，并將其稀釋至所期望的濃度。應(yīng)當(dāng)理解的是，所述配方也可通過(guò)相應(yīng) 地將分離的固體疏水蛋白溶解而獲得。對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用而言，用所述配方對(duì)要防止結(jié)冰的表面進(jìn)行處理。例如，可將 防護(hù)物體浸入所述配方中，或者用所述配方對(duì)其進(jìn)行噴涂。處理方式的類型由待防護(hù)的 表面種類確定，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可相應(yīng)地加以選擇。例如，為了處理飛機(jī)，可采用 機(jī)場(chǎng)現(xiàn)有的常規(guī)系統(tǒng)，用除冰劑對(duì)飛機(jī)進(jìn)行噴涂。例如，汽車可通過(guò)洗車場(chǎng)中的適當(dāng)?shù)?噴灑設(shè)備進(jìn)行處理，特別地在洗車過(guò)程中或之后，并在干燥之前進(jìn)行。所述疏水蛋白也 可通過(guò)例如擋風(fēng)玻璃清洗系統(tǒng)，噴涂到汽車擋風(fēng)玻璃上。為此，所述疏水蛋白溶液也可 通過(guò)獨(dú)立的罐或容器提供。對(duì)表面進(jìn)行手工噴涂也是可行的。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述疏水蛋白也可作為液體泡沫施加，以防止噴 霧溶液過(guò)早流走。為此，首先，通過(guò)在空氣中進(jìn)行機(jī)械攪拌，或者通過(guò)施加適當(dāng)?shù)臍怏w 如空氣或氮?dú)?，使疏水蛋白溶液起泡，然后噴涂到表面上。一般地，需要一定的作用時(shí)間，以將疏水蛋白沉積到表面上。本領(lǐng)域技術(shù)人員 可根據(jù)所期望的結(jié)果，選擇適當(dāng)?shù)淖饔脮r(shí)間。典型的作用時(shí)間的例子為0.1 12h，但其 目的不是將本發(fā)明局限于此。一般地，所述作用時(shí)間取決于溫度，以及溶液中的疏水蛋白的濃度。涂覆操作 過(guò)程中的溫度越高，濃度越高，作用時(shí)間就越短。涂覆操作過(guò)程中的溫度可為室溫，或 者可在升溫下進(jìn)行。例如，所述溫度可為5，10，20，30，40，50，60，70，80，90， 100，110或120°C。所述溫度優(yōu)選為15 120°C，更優(yōu)選地為20 100°C，例如40 100°C或者70 90°C。為此，例如，可相應(yīng)地調(diào)節(jié)噴涂浴的溫度，或者在噴涂施加前對(duì) 所述溶液進(jìn)行加熱。涂覆之后除去溶劑。溶劑可通過(guò)，例如在空氣中進(jìn)行簡(jiǎn)單的蒸發(fā)而除去。溶劑 的除去也可通過(guò)升高溫度和/或采用適當(dāng)?shù)臍饬骱?或施加真空而促進(jìn)。蒸發(fā)可通過(guò)例如 在干燥箱中加熱涂覆的物體或者用加熱的氣流對(duì)其進(jìn)行吹風(fēng)而促進(jìn)。所述方法也可加以 組合，例如在強(qiáng)制通風(fēng)干燥箱或者烘干通道中干燥。此外，也可通過(guò)輻射，特別是IR輻 射，將涂層加熱以除去溶劑。為此，能采用所有種類的寬帶IR輻射器，例如NIR、MIR 或NIR輻射器。但是，還可采用，例如IR激光。適當(dāng)?shù)妮椛湓茨芤愿鞣N輻射幾何形狀 商購(gòu)獲得。是否能進(jìn)行加熱，就其本質(zhì)而言，取決于待處理的物體的種類。相對(duì)小的物 體可在加熱的干燥箱中，以相對(duì)沒(méi)有問(wèn)題的方式，進(jìn)行熱處理。較大物體的表面，例如 可用熱空氣鼓風(fēng)機(jī)進(jìn)行加熱。為了涂覆汽車，例如，可采用用于干燥汽車的鼓風(fēng)機(jī)進(jìn)行熱處理。
干燥過(guò)程中的溫度和干燥時(shí)間由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，有用的干燥 溫度為10 130°C，優(yōu)選為20 120°C，更優(yōu)選地為70 110°C，更進(jìn)一步優(yōu)選地為 75-105°C,例如85-100°C。此處所指的是涂料本身的溫度。干燥器中的溫度當(dāng)然還可能 更高。就其本質(zhì)而言，干燥溫度越高，干燥時(shí)間就越短。涂覆和干燥過(guò)程中的熱處理，可有利地彼此組合。例如，可首先在室溫下，用 所述配方處理一個(gè)表面，然后在升溫下進(jìn)行干燥和熱處理。與未處理的表面相比，用所述疏水蛋白處理的表面具有高得多的防結(jié)冰性。疏 水蛋白層與表面的粘合性非常好。下文實(shí)施例旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明疏水蛋白的提供實(shí)施例采用了具有完整的融合配偶體yaad的融合疏水蛋白 (yaad-Xa-dewA-his,下文稱之為疏水蛋白A)，正如采用了具有截短至40個(gè)氨基酸的融 合配偶體的融合疏水蛋白yaad40-Xa-dewA-his (疏水蛋白B) —樣。其制備是按照WO 2006/082253中所述的步驟進(jìn)行的。腦誦i她赫趣卜.隨M細(xì)瓶碰☆獻(xiàn)舶賄表ffi基材玻璃(窗玻璃，SMdeutscheGlas，Mannheim)為了進(jìn)行測(cè)試，將含有融合疏水蛋白的噴霧干燥的產(chǎn)品溶解在水中，加入 50mM的pH為4的醋酸鈉以及0.1wt%的聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單月桂酸酯(Tween 20)。產(chǎn)物的濃度在水溶液中為100 μ g/mL。步驟-將玻璃板培養(yǎng)過(guò)夜(溫度80°C)，然后在蒸餾水中洗滌涂層，-然后培養(yǎng)10min/8(TC/1 %十二烷基硫酸鈉(SDS)的蒸餾水溶液，-在蒸餾水中洗滌。將試樣在空氣中干燥，在室溫下，測(cè)定一滴5μ1的水的接觸角(° )。接觸角測(cè)試是在Dataphysics OCA 15+接觸角系統(tǒng)，軟件SCA20.2.0. (2002年i^一
月)上進(jìn)行的。測(cè)試是按照生產(chǎn)商的指示進(jìn)行的。未處理的玻璃獲得了 15° 30° 士5°的接觸角。具有融合疏水蛋 白yaad-Xa-dewA-his6的涂層使接觸角的增大超過(guò)了 30 ° ；具有融合疏水蛋白 yaad40-Xa-dewA-his的涂層同樣使接觸角的增大超過(guò)了 30°。防結(jié)冰泖丨試分析的試樣采用了玻璃顯微鏡載物片(約1.6X2.6cm)。用異丙醇和重蒸餾水清洗玻璃， 按照上文所述涂覆疏水蛋白。采用濃度為0.1% (w/v)的疏水蛋白進(jìn)行涂覆。在搖動(dòng)器 (250rpm ； 3cm陪替氏培養(yǎng)皿)上，在室溫下培養(yǎng)過(guò)夜。測(cè)試裝置采用

圖1所示的氣候控制室進(jìn)行測(cè)試。氣候控制室⑴由用于空氣(2)的冷卻 和可控加濕的氣候控制系統(tǒng)(6)、以及用于控制流速的鼓風(fēng)機(jī)構(gòu)成。將試樣(3)固定在溫度可控的試樣架(4)上。該試樣架由低溫恒溫器(5)冷卻。為了使結(jié)冰過(guò)程可視化，所 述室中放有照相機(jī)。測(cè)試步驟將試樣置于試樣架上，用冷濕空氣(2)吹風(fēng)。將試樣架冷卻。所述冷濕空氣吹到試樣上。當(dāng)所述空氣與試樣相遇時(shí)，開(kāi)始形 成霜。在測(cè)試過(guò)程中，能通過(guò)照相機(jī)記錄霜的形成。測(cè)試參數(shù)試樣架的溫度_4°C空氣溫度1°C相對(duì)空氣濕度88%空氣速度9m/s測(cè)試時(shí)長(zhǎng)4小時(shí)測(cè)試結(jié)果圖2 5顯示了測(cè)試前后的試樣架。
權(quán)利要求
1.疏水蛋白在防止表面結(jié)冰中的應(yīng)用，用至少一種疏水蛋白對(duì)未被冰覆蓋的表面進(jìn) 行處理。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，將水性配方用于所述處理中，所述水性配方含有 水或溶劑混合物、以及至少一種疏水蛋白，所述溶劑混合物含有至少50wt%的水。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述配方除了水之外，還含有至少一種醇。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述配方含有乙二醇和/或丙二醇。
5.如權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述疏水蛋白是融合疏水蛋白。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述表面是硬表面。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中，所述表面是航空器和航天器、機(jī)動(dòng)車、摩托車頭 盔、窗玻璃，鋼結(jié)構(gòu)、電力線、電氣設(shè)備或工業(yè)設(shè)備的表面。
8.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中所述表面是飛機(jī)表面。
全文摘要
疏水蛋白在防止表面結(jié)冰中的應(yīng)用，特別是防止飛機(jī)表面結(jié)冰。
文檔編號(hào)C09K3/18GK102015955SQ200980105230
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月14日
發(fā)明者C·博爾施韋勒, I·格林瓦爾德, K·里舍卡, T·薩布科夫斯基, T·蒙塔格, U·鮑斯 申請(qǐng)人:巴斯夫歐洲公司