專利名稱：培養(yǎng)單細(xì)胞生物的方法
培養(yǎng)單細(xì)胞生物的方法 本發(fā)明涉及培養(yǎng)單細(xì)胞生物，尤其是原核生物(例如真細(xì)菌和古細(xì)菌(archaea))的方法；涉及用于該方法的設(shè)備，涉及在地下應(yīng)用中使用和抑制這 些生物，涉及新的這樣的生物，和涉及包含這些生物的組合物和庫。天然的地下烴儲層(reservoir)提供了油和氣的有限資源。因此重要的是對 從這些儲層回收烴的過程進(jìn)行優(yōu)化。為了這個目的使用了很多技術(shù)，但是仍 然持續(xù)需要新的技術(shù)。令很多人驚訝的是，在這些儲層中充滿(impregnate with)烴類的巖石，即 使處于表面以下幾千米因而處于非常高的溫度和壓力下，也不是無菌的 (sterile)。存在單細(xì)胞生物，特別是原核生物如真細(xì)菌和古細(xì)菌。甚至已經(jīng)提 出，這些微生物可能與烴類的產(chǎn)生有關(guān)。我們已經(jīng)認(rèn)識到，促進(jìn)或抑制這些內(nèi)生微生物的生長，或者引入分離自 地下巖層的微生物培養(yǎng)物，可以提供改善儲層管理的方法。但是為此，必需 將這些微生物收集并培養(yǎng)，且如果合適的話對其挑戰(zhàn)(challenge),從而可發(fā)現(xiàn) 生長抑制的方法。當(dāng)在環(huán)境的表面條件培養(yǎng)一些由地下巖層取回的微生物時，我們驚訝地 發(fā)現(xiàn)，如果在類似儲層本身?xiàng)l件的物理化學(xué)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，則可以分離和 測試的微生物的范圍明顯更大，特別是如果取自儲層的樣品在培養(yǎng)前和培養(yǎng) 過程中保持在高壓時。這是特別讓人驚訝的，因?yàn)椴幌駳怏w，液體是非常難于壓縮的。因此液 體培養(yǎng)基中的細(xì)菌基本上是充滿液體的膜，其處于周圍的液體中，其跨膜壓 差如果存在，也是可以忽略的。因此可以期望的是，細(xì)菌生長基本上不受培 養(yǎng)基壓力的影響。然而實(shí)際并非如此，因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)在高壓和環(huán)境壓力下培 養(yǎng)的烴樣品會導(dǎo)致完全不同的生物的生長，特別是一些只在高壓條件下生長 的生物在環(huán)境(即地表)壓力下不生長。此外，這些嗜壓生物所用的某些酶似乎 在環(huán)境壓力下不起作用，可能是由于三級結(jié)構(gòu)的不同而引起的。因此雖然已知要培養(yǎng)單獨(dú)的地下微生物，但是先前并不知道要培養(yǎng)地下 生態(tài)系統(tǒng)，其由多樣的微生物組成，其中一些在表面條件下不旺盛生長(thrive)。如果井下處理(down-hole treatment)的效果能夠在實(shí)驗(yàn)室條件再現(xiàn)， 那么就有必要使用本發(fā)明的新方法。如此從一個方面看來，本發(fā)明提供產(chǎn)生地下微生物培養(yǎng)物的方法，所述 方法包括從地下儲層，例如從來自這種儲層的流體流獲得加壓流體的樣品； 在保持所述樣品的壓力的同時將其轉(zhuǎn)移入發(fā)酵反應(yīng)器；和在高壓下和，優(yōu)選 也在高溫下，在所述反應(yīng)器中培育所述樣品。通常在100至900 bar,優(yōu)選230至280 bar，特別優(yōu)選為取樣儲層或意欲 用培養(yǎng)的;f效生物處理的地層的壓力的50%至150%,更特別是80%至120%， 尤其是90%至110%的壓力培育樣品。樣品優(yōu)選為液體烴樣品；然而也可以使用含水樣品。取自儲層的樣品通 常包括氣體、脂質(zhì)、有機(jī)酸等。培育溫度通常為60至160。C,優(yōu)選為80至100。C，特別優(yōu)選地，在取樣 儲層或意欲用培養(yǎng)的微生物處理的地層的溫度的20。C范圍之內(nèi)，特別是在 l(TC范圍之內(nèi)。在將樣品轉(zhuǎn)移至發(fā)酵反應(yīng)器之前、過程中或之后，優(yōu)選通過將樣品與營 養(yǎng)物混合來進(jìn)行培育。營養(yǎng)物可以包含礦物質(zhì)和/或維生素，但優(yōu)選至少包含 粉狀巖石(pulverulent rock)，特別優(yōu)選來自取樣儲層或來自意欲用經(jīng)培養(yǎng)的微 生物處理的地層的巖石，或者與這種儲層巖石在地質(zhì)學(xué)上可比較的巖石。如 果期望的話，營養(yǎng)物還將包含來自取樣儲層的流體。通常，儲層流體將為微 生物生長提供碳源。通常地，對于發(fā)酵過程，可以添加不同的營養(yǎng)物或抑制 劑，以確定它們對^i:生物生長的作用。本發(fā)明的方法中的培育通常為7至360天，特別是180至240天。如果 期望的話，可以監(jiān)測和控制培育過程，使得如果^f效生物沒有生長或者如果微 生物生長達(dá)到了預(yù)定的可以接受的水平，則將其終止。監(jiān)測可以原位進(jìn)行， 或者在從發(fā)酵反應(yīng)器提取的材料上進(jìn)行，而且可以以任何適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行。 因此，例如，樣品的混濁程度、營養(yǎng)物質(zhì)中放射性示蹤物(tracer)的吸收、有 機(jī)固形物含量等，通?？梢杂米鞅O(jiān)測的參數(shù)。監(jiān)測通常通過下述方式進(jìn)行 抽取培養(yǎng)基的等分試樣，并通過例如GC、 LC-MS、 MS等對它們進(jìn)行分析， 以顯示出氣體產(chǎn)生或消耗或脂質(zhì)的曲線。一旦產(chǎn)生了充足的微生物生長，通常將期望鑒定出已經(jīng)在培養(yǎng)中增殖的 微生物。這可以通過下述方法容易地完成細(xì)胞裂解，然后核酸片段化(例如使用DNA酶或RNA酶)、片段復(fù)制(例如使用對原核生物通用的引物或其組 進(jìn)行PCR);和片段分離(例如使用凝膠電泳)。然后可以將片段"特征 (signature)"與原核生物核酸片段的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，以確定培養(yǎng)物中存在哪 些微生物和其中是否有微生物是新的。當(dāng)發(fā)現(xiàn)新微生物時，通常期望的是將 其分離，可能還要對其測序。分離通常可以用下述方法實(shí)現(xiàn)稀釋，然后培 育，即，使用常規(guī)技術(shù)，但是仍然在高壓下培育。測序可以用常規(guī)技術(shù)實(shí)現(xiàn)。在期望單獨(dú)微生物或微生物組合的活樣品時，可以使培養(yǎng)物非常緩慢地， 例如在至少10小時，優(yōu)選至少24小時中達(dá)到環(huán)境壓力和溫度來實(shí)現(xiàn)。如果 期望的話，在減壓過程中，可將培養(yǎng)物暴露于電場的脈沖以引起電致孔，從 而釋放跨細(xì)胞膜的壓差。然后可以通過常規(guī)方法從培養(yǎng)物中分離微生物，例如離心、在無菌流體 中重懸、再離心等。然后如果期望的話，可以將得到的材料凍干用于儲存和/ 或運(yùn)輸。所用流體通常是礦物油或甘油。然而更優(yōu)選地，培養(yǎng)物的樣品可以在加壓容器中儲存，例如在進(jìn)行培育 的壓力儲存。這種加壓樣品及其庫，形成本發(fā)明的更多方面。從這方面看，本發(fā)明提供了加壓容器，例如其內(nèi)部壓力為100至900 bar, 特別是200至350bar，其中包含微生物，任選地在烴基流體(例如甘油或礦物 油)中包含微生物，并且優(yōu)選設(shè)有帶閥取樣口。從另一方面看，本發(fā)明提供微 生物庫，其包含多個這種加壓容器，例如至少10個，優(yōu)選至少100個。在壓力下但在環(huán)境溫度或低于環(huán)境溫度(sub-ambient)(例如低至液氮溫度) 儲存培養(yǎng)物是可行的，因?yàn)榈叵挛⑸镌谶@樣的條件下，可為基本上休眠的。在本發(fā)明的方法中，培育的混合物含量可以不同，以模擬不同的地下條 件。因此，例如疏酸鹽、鹽、水、曱烷、氮和二氧化碳的含量可以不同，以 模擬當(dāng)水滲透入含烴地層時所遇到的條件，或者將水、天然氣、氮?dú)饣蚨?化碳注入儲層中以增強(qiáng)烴回收率時的那些條件，或者當(dāng)對生產(chǎn)井實(shí)施擠壓以 進(jìn)行井下鉆井處理(例如使用結(jié)垢抑制劑)時所遇到的那些條件。以此方式，從 培育過程中的培養(yǎng)物增殖，有可能確定適合微生物生長的條件，適合抑制微 生物生長的條件，用于井下注射以產(chǎn)生生物量(例如來阻礙水流)的適當(dāng)?shù)奈⑸?物，等。確定了這些因素后，就有可能實(shí)施設(shè)計為增強(qiáng)或抑制微生物生長的井下 處理。這形成了本發(fā)明的又一個方面。因此，從又一個方面看，本發(fā)明提供用于地下儲層處理的方法，例如處 理烴井的方法，所述方法包括向所述儲層中注入;f敬生物培養(yǎng)物，可選地與所 述微生物的營養(yǎng)物一起注入，所述培養(yǎng)物通過高壓培育產(chǎn)生。從再一個方面方面看，本發(fā)明提供增強(qiáng)從地下烴儲層回收烴的方法，所 述方法涉及將流體注入所述儲層以將烴驅(qū)動至生產(chǎn)井，其中預(yù)先選擇所述流 體的組成，以抑制或促進(jìn)所述儲層中內(nèi)源微生物的生長，例如基于本發(fā)明的 方法的性能來進(jìn)行。在這里所用的驅(qū)動流體通常是水、氮?dú)?、曱烷或二氧化碳，?yōu)選二氧化 碳?？梢赃x擇流體的組成，例如以包括營養(yǎng)物質(zhì)，其在含水的條件下使內(nèi)源 微生物增殖，即在儲層的含水區(qū)出現(xiàn)生物量增長，導(dǎo)致巖石孔隙阻塞，從而 減少流向生產(chǎn)井的水流。這樣的營養(yǎng)物質(zhì)通?？梢园ㄋ苄缘V物鹽。這種方法通常將涉及對于擠壓而實(shí)現(xiàn)井處理和對于流體注射以增強(qiáng)烴回 收率來說常規(guī)的注射條件，因此不需要更詳細(xì)地描述。當(dāng)本發(fā)明的方法產(chǎn)生了新的，即先前未知的微生物時，形成了本發(fā)明的一個方面；包含所述新微生物的無巖石的(rock-free)組合物形成本發(fā)明的又一 方面。這種組合物可以干燥(例如凍干(hydrophilize)，任選地與防凍劑(例如糖) 一起凍干)，或者可以是液體，而且可以在壓力或環(huán)境壓力下。對于液體，溶 劑優(yōu)選除其中發(fā)現(xiàn)該微生物的天然烴之外的有機(jī)溶劑，例如礦物油或甘油。本發(fā)明的方法通常在能在井下壓力下操作的發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行。這與常 規(guī)的發(fā)酵反應(yīng)器完全不同，常規(guī)的發(fā)酵反應(yīng)器通常是玻璃容器或者具有薄金 屬外殼的容器。這種高壓反應(yīng)器形成了本發(fā)明的又一方面。從這一方面看， 本發(fā)明提供了微生物發(fā)酵反應(yīng)器，其包含具有入口的培育室，優(yōu)選還具有樣 品去除口，所述室的壁由足夠強(qiáng)的材料制成，以承受至少180bar,更優(yōu)選至 少200 bar,特別是至少300 bar,更特別地多至900 bar的壓差。本發(fā)明的反應(yīng)器優(yōu)選設(shè)有發(fā)酵監(jiān)測器和熱源，以及能夠操作以緩慢地， 例如以小于50bar/小時，優(yōu)選小于10bar/小時，更優(yōu)選小于1 bar/小時的速率 降低室中壓力的閥門。熱源通常可以與培育室整合，然而在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，反 應(yīng)器只是簡單地置于烘箱中?？梢栽跓N進(jìn)入井內(nèi)的點(diǎn)或其附近采集井下樣品。已經(jīng)知道能以此方式采 才羊的i殳備。然而，優(yōu)選4吏用力o壓J立移槽(pressurized displacement cell)在力。壓力t 體流離開地面后從中取樣。然后優(yōu)選地，使加壓位移槽絕熱(insulate),或者置于加熱的容器中，以使流體樣品在轉(zhuǎn)移至發(fā)酵反應(yīng)器之前保持高溫。如果期望的話，樣品可以取自儲層中不同的流線(flow-line),然后匯聚起來，從而 可以檢測來自不同儲層區(qū)的不同微生物菌叢。從取樣到轉(zhuǎn)移入發(fā)酵反應(yīng)器的過程中維持樣品壓力是重要的，否則對壓 力下降敏感的微生物將破碎，且不會在反應(yīng)器中生長。而且，保持壓力和溫 度確保了從溶解的氣體含量等方面，生長培養(yǎng)基與井下條件近似?，F(xiàn)在將參照附圖來描述本發(fā)明，在附圖中

圖1、 5和6是根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)器的示意圖；圖2和3是使用圖1的反應(yīng)器，在對照條件下所培養(yǎng)樣品的凝膠電泳圖；和圖4是柱狀圖，顯示根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的培養(yǎng)物中，以及對照操作中 微生物的數(shù)目和類型。參考圖1，其中顯示了末端開放的圓柱體1的水平橫截面。圓柱體1由 316鋼或哈斯特合金C(HastelloyC)加工而成，且能夠承受350bar的壓力。圓柱體1的開放末端可以用錐形塞子2封閉，塞子2與凹槽3中O型環(huán) 結(jié)合并具有中心口 4，用于加入或去除流體。塞子2通過空心螺栓5安裝就 位，空心螺栓5與圓柱體1 口部的內(nèi)部螺紋嚙合。優(yōu)選地，在塞子2和螺栓 5之間放置墊圈(未顯示)，從而將塞子2的旋轉(zhuǎn)降至最小同時將螺栓5變緊或 變松。參考圖2和3，其中顯示了 21個培養(yǎng)物的DGGE圖。那些標(biāo)明CHP的 是在儲層的條件下采集和培養(yǎng)的樣品，標(biāo)識中含字母K的除外，其為在lbar 下培養(yǎng)的對照樣品?？梢钥闯?，在CHP樣品中生長的細(xì)菌在CHP-K樣品中 不生長。圖2涉及使用對真細(xì)菌通用的引物擴(kuò)增的測試樣品。圖3涉及使用對古細(xì)菌通用的引物擴(kuò)增的測試樣品。圖4顯示在高壓(壓力細(xì)胞)或者環(huán)境壓力(對照)培養(yǎng)取自儲層的四種不同 樣品，然后對獲得的培養(yǎng)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增而產(chǎn)生的克隆的數(shù)目。圖5和6分別是部件分解圖和裝配圖，顯示了 316鋼制的圓柱體21、 JM7(鋁青銅合金)制的螺栓22、 Tefloi^的塞子23、 JM7制的圓盤24、 316鋼 制的塞子25和Vitoi^的O型環(huán)26。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生地下微生物培養(yǎng)物的方法，所述方法包括從地下儲層獲得加壓流體的樣品；在將所述樣品保持壓力的同時將其轉(zhuǎn)移至發(fā)酵反應(yīng)器中；和在高壓下在所述反應(yīng)器中培育所述樣品。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品在高溫下在所述反應(yīng)器中培育。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述的來自地下儲層的加壓流體樣品從 來自這種儲層的流體流中獲得。
4. 任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述樣品在100至900 bar的壓力培育。
5. 任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述樣品在230至280 bar的壓力培育。
6. 任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述樣品在60至160。C的溫度培育。
7. 任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述樣品在80至100。C的溫度培育。
8. 任何前述權(quán)利要求的方法，其中通過將所述樣品與至少包含粉狀巖石 的營養(yǎng)物質(zhì)混合來進(jìn)行培育。
9. 任何前述權(quán)利要求的方法，其中培育進(jìn)行7至360天。
10. 任何前述權(quán)利要求的方法，其還包括將培養(yǎng)物于環(huán)境壓力和溫度保 持至少10小時。
11. 設(shè)有帶閥取樣口的加壓容器，且該容器中的烴基流體中包含微生物。
12. 權(quán)利要求11的加壓容器，其內(nèi)部壓力為100至900bar。
13. 權(quán)利要求11或12的加壓容器，其中所述烴基流體是甘油或礦物油。
14. 微生物庫，其包含如權(quán)利要求11至13中任何項(xiàng)所限定的多個容器。
15. 用于地下儲層處理的方法，所述方法包括向所述儲層中注入微生物 培養(yǎng)物，可選地與所述微生物的營養(yǎng)物質(zhì)一起注入，所述培養(yǎng)物通過如4又利 要求1至10中任一項(xiàng)所限定的高壓培育來產(chǎn)生。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述地下儲層是烴井。
17. 增強(qiáng)從地下烴儲層中烴回收率的方法，所述方法涉及將流體注入所 述儲層中，以將烴驅(qū)動至生產(chǎn)井，其中所述流體的組成經(jīng)過預(yù)先選擇，從而 抑制或促進(jìn)所述儲層中內(nèi)源微生物的生長。
18. 微生物發(fā)酵反應(yīng)器，其包括具有入口的培育室，優(yōu)選地還有樣品移 除口，所述室的壁由足夠強(qiáng)的材料制成，以承受至少180bar的壓差。
全文摘要
本發(fā)明提供產(chǎn)生地下微生物培養(yǎng)物的方法，所述方法包括從地下儲層獲得加壓流體的樣品；在將所述樣品保持壓力的同時將其轉(zhuǎn)移至發(fā)酵反應(yīng)器中；和在高壓下在所述反應(yīng)器中培育所述樣品。
文檔編號C09K8/58GK101336289SQ200680051806
公開日2008年12月31日 申請日期2006年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月28日
發(fā)明者奧德·G·布雷克斯泰德, 漢斯·K·科特拉, 西德塞爾·馬庫森, 阿斯蓋爾·溫伯格 申請人:斯塔托伊爾海德羅公司