一種用于微生物油氣勘探的芯片及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于微生物油氣勘探的芯片及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了用于油氣勘探的探針組、芯片、試劑盒與勘探方法，該探針組根據(jù)微生物的16s rRNA基因以及alkB基因、alkH基因、alkJ基因、alkK基因、pmoA基因、mmoX基因或BmoX基因設(shè)計(jì)，具有良好的特異性。將該引物組或芯片用于油氣資源的勘探，節(jié)省了傳統(tǒng)方法中菌群培養(yǎng)的時(shí)間，且操作簡便，準(zhǔn)確性高。能夠?yàn)橛蜌赓Y源的勘探提供更加可靠的依據(jù)。
【專利說明】
-種用于微生物油氣勘探的巧片及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種用于微生物油氣勘探的忍片及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 油氣資源勘探是一項(xiàng)高風(fēng)險(xiǎn)的商業(yè)活動(dòng)，由于地下地質(zhì)條件的復(fù)雜性，目前行業(yè) 內(nèi)的油氣勘探鉆探成功率一直維持在30%左右，在油氣勘探技術(shù)的發(fā)展歷程中，逐步形成 了一套W石油地質(zhì)學(xué)研究為基礎(chǔ)，W地球物理、地球化學(xué)及鉆井等技術(shù)為主的勘探技術(shù)體 系，但是運(yùn)套技術(shù)體系存在著包括勘探成本高、無法確定目標(biāo)含油氣性等技術(shù)缺陷，能夠進(jìn) 一步提高有油氣資源勘探成功率的技術(shù)一直都是行業(yè)的需求。
[0003] 油氣微生物勘探技術(shù)是一種直接的控檢測技術(shù)，相比于地球化學(xué)指標(biāo)，微生物指 標(biāo)受地表干擾較小，多解性少，可靠度較高，其異常形態(tài)也較為確定，適用范圍較廣。目前正 在被應(yīng)用的油氣微生物勘探技術(shù)主要W平板計(jì)數(shù)法和MPN法為主，運(yùn)兩種方法利用了油氣 微生物對控類的選擇性代謝，對實(shí)驗(yàn)室能夠進(jìn)行培養(yǎng)的油氣微生物進(jìn)行檢測計(jì)數(shù)，從而完 成地表油氣微生物數(shù)目的確定。
[0004] 但是運(yùn)類技術(shù)的也存在一些缺陷，比如目前可培養(yǎng)的微生物只占原地微生物的 1%左右的科研現(xiàn)狀限制了培養(yǎng)法對原地油氣微生物的覆蓋度，另外實(shí)驗(yàn)室選擇培養(yǎng)有時(shí) 候也會(huì)對原地非石油微生物產(chǎn)生訓(xùn)化從而造成技術(shù)檢測偏差，同時(shí)單一的一類選擇培養(yǎng)基 也無法將可培養(yǎng)油氣微生物都培養(yǎng)出來，也造成了培養(yǎng)法在進(jìn)行油氣微生物的偏差。
[0005] 基因忍片技術(shù)作為基因診斷、相關(guān)基因確定、疾病分子機(jī)理分析、藥物篩選等重要 工具，具有高通量、并行性及樣品消耗量少的優(yōu)勢，能夠進(jìn)行大規(guī)模篩選。通過基因表達(dá)譜 忍片實(shí)驗(yàn)可W同時(shí)觀察成千上萬個(gè)基因在不同個(gè)體、不同組織、不同發(fā)育階段的表達(dá)狀況， 改變了傳統(tǒng)的一次實(shí)驗(yàn)僅對單個(gè)或幾個(gè)基因表達(dá)差異進(jìn)行觀察，為多祀標(biāo)的同時(shí)研究提供 了有力工具。
[0006] 基于分子生物學(xué)的技術(shù)手段能夠克服基于培養(yǎng)的微生物技術(shù)手段對大部分微生 物不可培養(yǎng)的技術(shù)短板，但目前尚未見關(guān)于與油氣開發(fā)相關(guān)的基因忍片的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種用于微生物油氣勘探的忍片及 其應(yīng)用。本發(fā)明本發(fā)明提供的忍片能夠?qū)碧絽^(qū)地表樣品進(jìn)行特異性檢測，能夠?qū)崿F(xiàn)對地 表油氣資源相關(guān)微生物的一次性全面檢測，能為提高油氣資源勘探成功率提供更加可靠的 依據(jù)。
[000引本發(fā)明提供了用于油氣勘探的探針組，其具有針對W下微生物的RNA或DNA進(jìn)行檢 測的探針；微生物選自 Ac inetobac ter 屬，Micrococcus 屬，Nocardia屬，Rhodococcus 屬， Pseudomonas屬，Arthrobacter屬，Streptomyces屬，Bacillus屬，Brevundimonas屬， icrobacterium 屬，Psychrobacter 屬或 Paracoccus 屬。
[0009] 油氣微生物勘探是一種依靠地表微生物進(jìn)行油氣勘探的方法。本發(fā)明通過分析油 氣田區(qū)地表±壤樣品，發(fā)現(xiàn)含有油氣資源地區(qū)的地表±中一些微生物的含量與不含有油氣 資源地區(qū)的含量不同，W運(yùn)些微生物作為指示微生物能夠預(yù)測待測±樣是否來自含有油氣 資源的區(qū)域。選擇運(yùn)些微生物的16s rRNA作為祀基因設(shè)計(jì)探針，即可實(shí)現(xiàn)對運(yùn)些微生物的 檢測。本發(fā)明中所述的探針可W是上述微生物的相應(yīng)16s rRNA基因的核酸序列、其互補(bǔ)序 列，或者它們的片段。
[0010] 本發(fā)明提供的探針組中還包括針對W下基因進(jìn)行檢測的探針；基因選自alkB基 因、a化Η基因、a化J基因、a化K基因、pmoA基因、mmoX基因或BmoX基因。
[0011] 燒控降解基因包括a化B(燒控徑化酶基因）、a化H(醒脫氨酶基因）、a化J(醇脫氨酶 基因）、a化K(乙酷-CoA合酶基因），甲燒氧化菌的功能基因包括pmoA(甲燒單加氧酶基因）、 mmoX(可溶性甲燒單加氧酶基因）或BmoX(下燒單加氧酶基因），通過分析±壤中運(yùn)些基因的 豐度，能夠預(yù)測±樣是否來自含有油氣資源的區(qū)域。本發(fā)明中所述的探針可W是上述基因 的核酸序列、其互補(bǔ)序列，或者它們的片段。
[001^ 在一些實(shí)施例中，探針的數(shù)量化~92條。
[0013] 在一些實(shí)施例中，探針的核巧酸序列選自SEQ ID NO: 1~92。
[0014] 核巧酸序列為SEQ ID NO: 1~92的探針針對各微生物的16s rRNA的保守區(qū)域或各 基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)，具有良好的特異性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。降低了假陽性的產(chǎn)生，從而提 高了檢測的準(zhǔn)確性。
[0015] 其中：各探針序列針對的微生物或基因如表1:
[0016]
[0017]
[0018] 本發(fā)明還提供了擔(dān)載本發(fā)明所述探針組的忍片。
[0019] 本發(fā)明提供的忍片上擔(dān)載探針的數(shù)量為1條~92條，其序列選自SEQ ID NO: 1~ 92〇
[0020] 本發(fā)明提供的探針被固定在適于檢測反應(yīng)的基片上，制成忍片。本發(fā)明中所述基 片可選用本領(lǐng)域中眾所周知的載體，只要所述載體與所述反應(yīng)物相容，不會(huì)影響檢測結(jié)果。 本發(fā)明提供的忍片的基片為娃晶基片、玻璃基片或高分子Ξ維基片。
[0021] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述基片為高分子Ξ維基片。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種用于油氣勘探的試劑盒，其中包括本發(fā)明提供探針組或本發(fā) 明提供的忍片。
[0023] 本發(fā)明提供的試劑盒W定量或定性檢測微生物中16s rRNA的表達(dá)情況或alkB基 因、a化Η基因、a化J基因、a化K基因、pmoA基因、mmoX基因或BmoX基因的表達(dá)情況為目的，試 劑盒中，除包括本發(fā)明提供的探針組或忍片外，還應(yīng)該包括能夠定量或定性檢測基因表達(dá) 情況的分子生物學(xué)方法中所需的試劑、緩沖液或說明書。
[0024] 在本發(fā)明中，試劑盒為：巧光定量PCR檢測試劑盒、原位雜交及原位RT-PC時(shí)式劑盒 或nodhern檢測試劑盒。
[0025] 作為優(yōu)選，試劑盒為巧光定量PCR檢測試劑盒，其中包括本發(fā)明提供的探針組，± 壤基因組DNA提取試劑、巧光定量PCR檢測試劑。
[0026] 作為優(yōu)選，試劑盒為原位雜交試劑盒，其中包括本發(fā)明提供的探針組，±壤基因組 DNA提取試劑、巧光標(biāo)記試劑和雜交試劑。
[0027] 作為優(yōu)選，試劑盒為原位RT-PC時(shí)式劑盒，其中包括本發(fā)明提供的探針組，和原位 RT-PCR 試劑。
[0028] 作為優(yōu)選，試劑盒為nodhern檢測試劑盒其中包括本發(fā)明提供的探針組，±壤RNA 提取試劑和nodhern雜交試劑。
[0029] 本發(fā)明提供的忍片或試劑盒在油氣勘探中的應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明提供了一種油氣勘探的方法，具體包括:提取研究地區(qū)±樣的DNA后進(jìn)行巧 光標(biāo)記，與本發(fā)明提供的忍片進(jìn)行雜交，根據(jù)檢測結(jié)果分析研究地區(qū)是否含有油氣資源。 [0031 ]在本發(fā)明中，研究地區(qū)±樣的取樣深度為20cm。
[0032] 在本發(fā)明中，研究地區(qū)的范圍為距探井半徑50m范圍內(nèi)。
[0033] 本發(fā)明采用的分析的方法為PCA、DCA、Cluster聚類、heatmap繪制或柱狀圖成圖。
[0034] 優(yōu)選的，與不含有油氣資源地區(qū)的±樣相比，研究地區(qū)±樣中各微生物16s rRNA 的表達(dá)量和各基因的表達(dá)量皆顯著升高則該地區(qū)地下可能含有油氣資源。
[0035] 本發(fā)明提供了用于油氣勘探的探針組、忍片、試劑盒與勘探方法，該探針組根據(jù)微 生物的16s rRNA基因 W及a化B基因、a化Η基因、a化J基因、a化K基因、pmoA基因、mmoX基因或 BmoX基因設(shè)計(jì)，具有良好的特異性。將該引物組或忍片用于油氣資源的勘探，節(jié)省了傳統(tǒng)方 法中菌群培養(yǎng)的時(shí)間，且操作簡便，準(zhǔn)確性高。能夠?yàn)橛蜌赓Y源的勘探提供更加可靠的依 據(jù)。
【附圖說明】
[0036] 圖1示待評(píng)價(jià)目標(biāo)區(qū)內(nèi)和區(qū)外的檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 本發(fā)明提供了一種用于微生物油氣勘探的忍片及其應(yīng)用。，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W 借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng) 域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通 過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文的 方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0038] 本發(fā)明采用的試劑或儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。
[0039] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0040] 實(shí)施例1
[0041] 委托服務(wù)公司對SEQ ID N0:1~92的探針序列進(jìn)行探針合成，用晶忍TM16點(diǎn)樣儀 將探針點(diǎn)制到晶忍愈高分子Ξ維基片，完成忍片的制備；
[0042] 對某待評(píng)價(jià)勘探區(qū)進(jìn)行樣品采集，在待評(píng)價(jià)目標(biāo)區(qū)內(nèi)和區(qū)外分別采集樣品，樣品 采集深度為20cm，樣品送回實(shí)驗(yàn)室后用化stDNA愈Spin Kit for 5〇11±壤0魁提取試劑盒 進(jìn)行±壤DNA提??；
[0043] 使用安捷倫SureTag DNA Labeling Kit對提取的DNA進(jìn)行巧光標(biāo)記，用Qiagen QIAquick Kit對標(biāo)記完的DNA進(jìn)行純化；
[0044] 使用安捷倫01 igo aCGH/化IP-化ip Hybridization Kit雜交試劑盒將純化后的 標(biāo)記產(chǎn)物與點(diǎn)制好的忍片進(jìn)行雜交，雜交溫度為65攝氏度，雜交20小時(shí)后用試劑盒自帶的 清洗液對雜交完的忍片進(jìn)行清洗；
[0045] 使用安捷倫Agilent G4900DA微整列掃描儀對清洗完的基因忍片進(jìn)行掃描，到處 數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；
[0046] 對掃描數(shù)據(jù)采用柱狀圖分析，如圖1所示，在評(píng)價(jià)目標(biāo)體區(qū)內(nèi)樣品顯示出高信號(hào) 值，在評(píng)價(jià)目標(biāo)體區(qū)外的樣品則顯示出低信號(hào)值特征。對評(píng)價(jià)目標(biāo)體區(qū)進(jìn)行打井，結(jié)果證明 本次評(píng)價(jià)的目標(biāo)體為含油目標(biāo)體，試油結(jié)果顯示單井日產(chǎn)能為12.2方，符合本次評(píng)價(jià)的結(jié) 果。評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性良好。
[0047] W上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來 說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可w做出若干改進(jìn)和潤飾，運(yùn)些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于油氣勘探的探針組，其具有針對以下微生物的RNA或DNA進(jìn)行檢測的探針； 所述微生物選自 Ac inetobac ter 屬，Micrococcus 屬，Nocard ia屬，Rhodococcus 屬， Pseudomonas 屬，Arthrobac ter 屬，Strep tomyces 屬，Bacillus 屬，Brevundimonas 屬， icrobacterium 屬，Psychrobacter 屬或 Paracoccus 屬。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針組，其特征在于，還包括針對以下基因進(jìn)行檢測的探針； 所述基因選自alkB基因、alkH基因、alkj基因、alkK基因、pmoA基因、mmoX基因或BmoX基 因。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針組，其特征在于，其中探針的數(shù)量為1~92條。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針組，其特征在于，所述探針的的核苷酸序列選自SEQ ID NO:1~92。5. -種用于油氣勘探的芯片，其特征在于，在基片上載有權(quán)利要求1~4任一項(xiàng)所述的 探針。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的芯片，其特征在于，所述基片為玻璃基片、硅晶基片或高分子 三維基片。7. -種用于油氣勘探的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1~4任一項(xiàng)所述的探針，或 權(quán)利要求5或6所述的芯片。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒為：熒光定量PCR檢測試劑 盒、原位雜交及原位RT-PCR試劑盒或northern檢測試劑盒。9. 一種油氣勘探的方法，其特征在于，提取研究地區(qū)土樣的DNA后進(jìn)行熒光標(biāo)記，與權(quán) 利要求1~4所述芯片進(jìn)行雜交，根據(jù)檢測結(jié)果分析研究地區(qū)是否含有油氣資源。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的勘探方法，其特征在于，所述分析的方法為PCA、DCA、Cluster 聚類、heatmap繪制或柱狀圖成圖。
【文檔編號(hào)】C12R1/06GK106011241SQ201610350277
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月24日
【發(fā)明人】鄧詩財(cái), 郝純, 梅海, 張勇, 褚厚娟
【申請人】盎億泰地質(zhì)微生物技術(shù)（北京）有限公司