一種腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變異體及其制備方法和用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變異體，它是腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體與F3肽的融合蛋白，F(xiàn)3肽通過連接子連接在腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的N末端或者C末端。本發(fā)明還公開了一種如核苷酸序列以及包括它的重組載體、重組菌，還公開了前述變異體的制備方法和用途。本發(fā)明通過基因工程的方式制備得到了腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變異體，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的親和力、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力、腫瘤靶向性和體內(nèi)抗腫瘤活性均明顯優(yōu)于腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體，用于治療腫瘤的療效優(yōu)良，臨床應(yīng)用前景良好。
【專利說明】
一種腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變異體及其制備方法 和用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變異體 及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥是威脅人類生命的主要疾病之一。手術(shù)、放療和化療是目前癌癥治療的 主要手段。能深入瘤內(nèi)殺傷腫瘤細(xì)胞且對(duì)正常細(xì)胞損傷較小的藥物是理想的化療藥 物。然而大多數(shù)傳統(tǒng)的化療藥物對(duì)細(xì)胞的殺傷缺乏選擇性。隨著對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展分 子機(jī)制的深入了解和腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，靶向性治療藥物已成為腫瘤化療藥物發(fā)展的 新趨勢(shì)（Nero TL et al. Nat Rev Cancer. 2014, 14:248 - 62 ;Goel HL et al. Nat Rev Cancer. 2013, 13:871-82)〇
[0003] 腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)是腫瘤壞死因子 TNF(Tumor Necrosis Factor)超家 族成員。全長(zhǎng)分子由281個(gè)氨基酸組成，包含N末端疏水跨膜區(qū)和暴露于胞膜外的C末端 親水區(qū)。TRAIL有四種膜結(jié)合型受體分子（TRAIL Rl，R2, R3和R4)和一種可溶性受體分 子（0PG)。這些受體中，只有TRAIL R1和R2是死亡受體（Death Rec印tor，DR)，在細(xì)胞膜 表面與TRAIL結(jié)合后即被活化，通過胞內(nèi)死亡信號(hào)結(jié)構(gòu)域招募系列信號(hào)分子，傳遞死亡信 號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而TRAIL R3和R4兩種受體都是誘騙受體（Decoy Rec印tor，DcR)，分 子內(nèi)缺乏死亡信號(hào)傳遞結(jié)構(gòu)域或該結(jié)構(gòu)域不完整，與TRAIL結(jié)合后不傳遞死亡信號(hào)，不誘 導(dǎo)細(xì)胞凋亡。死亡受體TRAIL R1和R2高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，而誘騙受體R3和R4在正常細(xì) 胞高表達(dá)。因此，TRAIL能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡卻不傷害正常細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷具有選 擇性（Gonzalvez F et al· Oncogene. 2010, 29:4752 - 65)。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，利用基因工 程生產(chǎn)的人可溶性TRAIL在體外和動(dòng)物模型中對(duì)乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌、腎癌、膀 胱癌、肝癌、骨肉瘤、軟骨瘤、淋巴瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、血液腫瘤和腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞等都表現(xiàn)強(qiáng) 烈的殺傷作用（Stucke DW et al· Trends Mol Med. 2013, 19(11) :685-94 ;Wilson NS et al. Cancer Cell. 2012, 22(1) :80-90)?；蚬こ讨亟M的人可溶性TRAIL作為抗腫瘤藥物已 進(jìn)入臨床I-II期試驗(yàn)。結(jié)果表明，TRAIL具有良好的安全性，多種腫瘤病人對(duì)TRAIL的治療 都有反應(yīng)，極有可能被開發(fā)為新型抗腫瘤藥物（Subbiah V et al. Mol Cancer Ther. 2012， 11(11) :2541-6. Soria JC et al. J Clin Oncol. 2011,29(33) :4442-51)〇
[0004] 但是，現(xiàn)有基因工程重組的可溶性TRAIL抗腫瘤效果還不理想，主要原因在于其 受體分布廣泛，對(duì)腫瘤的靶向性不強(qiáng)。針對(duì)這一缺陷，采用能特異結(jié)合腫瘤細(xì)胞的單鏈抗體 或者腫瘤導(dǎo)向肽與TRAIL連接，可能增強(qiáng)TRAIL的腫瘤靶向性，進(jìn)而改善其體內(nèi)抗腫瘤效 果。
[0005] F3肽是由人高迀移率族核小體結(jié)合蛋白2 (high mobility group nucleosomal binding protein 2) 17-48位氨基酸組成，其能夠特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞及腫瘤血管內(nèi)皮細(xì) 胞（Porkka K et al.Proc Natl Acad Sci U S A. 2002,99(11) :7444-9)，能增強(qiáng)某些抗腫 瘤藥物的靶向性，但未見用其增強(qiáng)TRAIL腫瘤靶向性進(jìn)而提高其抗腫瘤活性的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變異體，即 TRAIL變異體，及其制備方法和用途。
[0007] 本發(fā)明腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變異體，它是包含腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡 誘導(dǎo)配體和F3肽的融合蛋白。F3肽通過連接子連接在腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的 N末端或者C末端。
[0008] 其中，所述腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的氨基酸序列如SEQ ID N0 :2所示。
[0009] 其中，所述F3肽的氨基酸序列如SEQ ID N0 :4所示。優(yōu)選地，所述F3肽由SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列編碼。
[0010] 其中，所述連接子由2-20個(gè)氨基酸組成。優(yōu)選地，所述連接子是（64幻3連接子， 其氨基酸序列如SEQ ID N0 :6所示。
[0011] 其中，所述腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變異體由SEQ ID N0 :7或9所示的核 苷酸序列編碼。所述腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變異體的氨基酸序列如SEQ ID N0 :8 或10所示。
[0012] 本發(fā)明核苷酸序列，它包括腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的編碼序列與F3肽 的編碼序列，二者之間通過連接子的編碼序列連接。
[0013] 其中，所述腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的編碼序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0014] 其中，所述F3肽的編碼序列如SEQ ID N0 :3所示。
[0015] 其中，所述連接子是（G4S)3連接子，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :5所示。
[0016] 所述核苷酸序列如SEQ ID N0 :7或9所示。
[0017] 本發(fā)明還提供了包含前述核苷酸序列的重組載體或重組菌。
[0018] 本發(fā)明制備前述腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變異體的方法，它是以前述核苷 酸序列為目標(biāo)片段，采用基因工程的方法制備得到的。
[0019] 本發(fā)明還提供了前述腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變異體在制備治療細(xì)胞增 生性疾病的藥物中的用途。
[0020] 其中，所述治療細(xì)胞增生性疾病的藥物是治療腫瘤或自身免疫性疾病的藥物。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種抗腫瘤藥物，它是以前述腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變 異體為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料制備而成的制劑。
[0022] 目前，通過在抗腫瘤蛋白上添加導(dǎo)向肽、增強(qiáng)腫瘤靶向性是本領(lǐng)域提高蛋白藥物 抗腫瘤活性的方法之一。其中的關(guān)鍵問題在于，導(dǎo)向肽與蛋白藥物連接在一起形成了新蛋 白。新添加的導(dǎo)向肽與原有蛋白藥物間可能相互影響而不能充分發(fā)揮各自原來的功能。因 此，新蛋白不一定比原來的蛋白活性更強(qiáng)。目前的腫瘤導(dǎo)向肽眾多，如RGD家族、NGR家族 的腫瘤導(dǎo)向肽等。添加哪種導(dǎo)向肽，如何添加，能夠最終制備得到一種抗腫瘤活性更強(qiáng)的 新蛋白并不確定。比如，Bieker等（Blood 2009;113:5019-5027)利用一種L-NGR導(dǎo)向 肽（GNGRAHA)與組織因子連接，增強(qiáng)了其抗腫瘤活性。但本發(fā)明人將L-NGR導(dǎo)向肽添加到 TRAIL N-末端，獲得的新蛋白抗腫瘤活性與TRAIL相比沒有得到增強(qiáng)。這充分說明了利用 腫瘤導(dǎo)向肽提高蛋白藥物抗腫瘤活性的不確定性。
[0023] 然而，本發(fā)明以F3肽為靶向肽，并對(duì)其核苷酸序列進(jìn)行了優(yōu)化以后，與TRAIL融合 制備的融合蛋白，具有良好的腫瘤靶向性和選擇殺傷腫瘤的活性，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證明其抗 腫瘤活性優(yōu)于TRAIL，尤其是對(duì)TRAIL抗性腫瘤，取得了意料不到的技術(shù)效果。
[0024] 本發(fā)明通過基因工程的方式，制備得到了純品TRAIL變異體蛋白TRAIL-F3-C 和TRAIL-F3-N，它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性明顯高于TRAIL，其中，TRAIL變異體蛋白 TRAIL-F3-N對(duì)腫瘤細(xì)胞的親和力、穩(wěn)定性、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡的能力、腫瘤靶向性和體內(nèi) 抗腫瘤活性均明顯優(yōu)于TRAIL，用于治療腫瘤的療效優(yōu)良；更進(jìn)一步地，TRAIL變異體蛋白 TRAIL-F3-N能抑制TRAIL抗性腫瘤，可用于治療TRAIL抗性腫瘤，臨床應(yīng)用前景良好。
【附圖說明】
[0025] 圖1融合蛋白結(jié)構(gòu)示意圖。
[0026] 圖2重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定。M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。1 :pET21d-TRAIL ;2 : PQE30-TRAIL-PC-N ;3 :pET21d-TRAIL-F3-N ;4 :pET21d-TRAIL-F3-C。箭頭所示為酶切產(chǎn)生 的目的基因片段。
[0027] 圖 3 純化蛋白的 SDS-PAGE 電泳。Μ :蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1 :TRAIL-F3-C ;2 :TRAIL-F3-N ; 3 :TRAIL-PC-N ;4 :TRAIL。
[0028] 圖4融合F3增強(qiáng)了 TRAIL對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。
[0029] A. F3與TRAIL共價(jià)連接增強(qiáng)了 TRAIL的腫瘤細(xì)胞殺傷活性。B.隨機(jī)對(duì)照肽PC與 TRAIL融合對(duì)TRAIL腫瘤細(xì)胞殺傷活性無增強(qiáng)作用。
[0030] 圖5 TRAIL變異體蛋白與TRAIL的細(xì)胞殺傷活性比較。
[0031] 圖6 TRAIL變異體蛋白與TRAIL的細(xì)胞結(jié)合能力比較。
[0032] A. F3、TRAIL 和 TRAIL-F3-N 對(duì)腫瘤細(xì)胞 SMMC-7721 的結(jié)合能力。B. F3(4 μΜ)與腫 瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞結(jié)合率比較。C. TRAIL和TRAIL-F3-N對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的結(jié)合率比 較。
[0033] 圖7TRAIL變異體蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。A，B.Annexin V(綠色熒光）/PI(紅色熒 光）染色聯(lián)合熒光顯微鏡觀察（A)和流式細(xì)胞分析（B)檢測(cè)TRAIL-F3-N誘導(dǎo)的SMMC-7721 細(xì)胞凋亡。C，D. TRAIL-F3-N與SMMC-7721細(xì)胞作用后細(xì)胞核形態(tài)變化（C)和DNA斷裂 (TUNEL 陽性細(xì)胞百分率，D)。E. TRAIL-F3-N 和 TRAIL 誘導(dǎo) SMMC-7721 細(xì)胞 Caspase-3、8、9 的活化。
[0034] 圖8 TRAIL變異體蛋白在血漿（A)和全血（B)中的穩(wěn)定性。
[0035] 圖9 TRAIL變異體蛋白在體內(nèi)的腫瘤靶向性和組織分布。A.熒光活體成像顯示腫 瘤對(duì)TRAIL-F3-N和TRAIL的攝?。▓A圈指示腫瘤部位）。B.腫瘤對(duì)TRAIL-F3-N和TRAIL 的攝取量的比較。C. TRAIL-F3-N和TRAIL組織分布圖。1 :腦；2 :心；3 :肝；4 :脾；5 :肺；6 : 腎；7 :肌肉；8 :腫瘤。D. TRML-F3-N和TRML在各組織中的含量比較。
[0036] 圖10 TRAIL變異體對(duì)TRAIL敏感細(xì)胞C0L0 205的體內(nèi)抗腫瘤活性。
[0037] A.瘤內(nèi)注射TRAIL-F3-N和TRAIL的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用（η = 7)。B.尾靜脈注射 TRAIL-F3-N和TRAIL的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用（η = 7)。C.尾靜注射不同劑量TRAIL-F3-N(n =6)的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用。D.圖C觀察結(jié)束時(shí)各組瘤體大小比較。箭頭顯示給藥時(shí)間。
[0038] 圖11 TRAIL變異體蛋白對(duì)TRAIL抗性細(xì)胞A549的體內(nèi)抗腫瘤活性。
[0039] A.瘤內(nèi)注射TRAIL-F3-N和TRAIL的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用（η = 6)。B.尾靜脈注射 TRAIL-F3-N和TRAIL的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用（η = 7~8)。C.圖Β觀察結(jié)束時(shí)各組腫瘤的大 小及瘤重比較。
[0040] 圖12 TRAIL變異體蛋白短期急性毒性評(píng)價(jià)。Α.給藥期間小鼠體重變化曲線。Β.給 藥結(jié)束小鼠肝、腎功能血液生化指標(biāo)。ALT :谷丙轉(zhuǎn)氨酶；AST :谷草轉(zhuǎn)氨酶；UREAL :尿素； UA:尿酸。C.給藥結(jié)束小鼠肝、腎組織學(xué)觀查。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步詳細(xì)說明。 但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所 實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0042] 實(shí)施例1本發(fā)明TRAIL變異體的制備
[0043] 1、TRAIL變異體的設(shè)計(jì)和基因克隆
[0044] 1) TRAIL變異體的設(shè)計(jì)
[0045] F3肽由31個(gè)氨基酸組成。TRAIL是截取人TRAIL114-281氨基酸組成的片段。F3 可連接在TRAIL N末端或C末端，兩片段之間加入柔性連接子，如（64幻3等。如圖1所示， F3連接在TRAIL N末端或C末端形成的融合蛋白分別命名為TRAIL-F3-N和TRAIL-F3-C。 同時(shí)選擇對(duì)照肽PC，連接在TRAIL N末端構(gòu)建TRAIL-PC-N作為對(duì)照。
[0046] 利用核酸分析軟件，將各片段編碼基因進(jìn)行拼接，獲得TRAIL變異體蛋白 TRAIL-F3-N、TRAIL-F3-C和TRAIL-PC-N的編碼基因，然后提交南京金斯瑞公司人工合成。
[0047] 表1本發(fā)明涉及氨基酸及核酸序列
[0048]

[0050] 2) TRAIL變異體蛋白重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0051] 本實(shí)例中，以pET21d和pQE30作為載體表達(dá)為例。為方便克隆，在TRAIL、 TRAIL-F3-N，TRAIL-F3-C編碼基因兩端分別添加 Nco I和BamH I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)， 基因酶切后克隆至表達(dá)載體PET21 d(購自Novagen)，構(gòu)建出表達(dá)質(zhì)粒pET21 d-TRAIL， pET21d-TRAIL-F3-N 和 pET21d-TRAIL-F3-C。在 TRAIL-PC-N 編碼基因兩端添加 BamH I和Κρη I酶切位點(diǎn)，酶切后克隆至表達(dá)載體pQE30 (購自Qiagen)，構(gòu)建出表達(dá)質(zhì)粒 PQE30-TRAIL-PC-N。表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法均為常規(guī)方法，具體操作步驟參見《分子克隆實(shí)驗(yàn) 技術(shù)指南》（J.薩姆布魯克編著，黃培堂主譯，2008年出版）。
[0052] 構(gòu)建好的質(zhì)粒通過DNA序列分析，確保序列正確（圖2)。
[0053] 3)重組菌的構(gòu)建和篩選
[0054] 根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)技術(shù)指南》(J.薩姆布魯克編著，黃培堂主譯，2008年出版）描 述的方法將表達(dá)質(zhì)粒 pET21d-TRAIL，pET21d-TRAIL-F3-N 和 pET21d-TRAIL-F3-C 轉(zhuǎn)入大腸 桿菌BL21-DE3,然后用含氨芐西林（100 μ g/ml)的LB抗性平板篩選陽性克隆。
[0055] 2、TRAIL變異體蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化
[0056] 挑取單克隆菌體接種于含氨芐西林（lOOwg/ml)的液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培 養(yǎng)至A600nm = 0· 6~1。再加入ImM異丙基-β -D-硫代半乳糖苷（Isopropyl β -D-1-thi ogalactopyranoside，IPTG)誘導(dǎo)4~6小時(shí)。6000g離心10min收集菌體，用裂解液（lOmM 磷酸鹽緩沖液，pH 7. 6, 10%甘油，10mM 2-巰基乙醇）重懸，再加入終濃度為ImM苯甲基 橫酰氣（Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)，冰浴條件超聲破菌（功率 300-400W， 工作l〇s間隔50s)。超聲破菌完成后，樣品于4°C，20000g離心15min，重復(fù)4次，收集破菌 上清。PQE30-TRAIL-PC-N表達(dá)質(zhì)粒則轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15 (購自Qiagen)，除了在培養(yǎng)基中加 入karamycin(30μg/ml)外，其余方法同前。破菌上清首先與經(jīng)裂解液平衡的陽離子交換 柱SP-Sepharose (購自GE公司）結(jié)合，然后用含0. 2M NaCl的裂解液洗掉雜蛋白，再用含 0. 8M NaCl的裂解液洗脫。洗脫的蛋白再與Ni-NTA-Agarose (購自Qiagen公司）結(jié)合，最 后用50-300mM咪唑洗脫，即得純品目的蛋白。純化后的蛋白用內(nèi)毒素去除試劑盒（購自 Genscript公司）按說明書提供的方法去除內(nèi)毒素備用。
[0057] 如圖3所示，純化后的蛋白在還原性SDS-PAGE電泳后，按標(biāo)準(zhǔn)分子量計(jì)算， 各蛋白單體分子量分別為：TRAIL，17. 8KD JRAIL-PC-N，22. 8KD ;TRAIL-F3-N，26. 3KD ; TRAIL-F3-C，25.6KD，所有蛋白表觀分子量均與預(yù)期分子量相符。
[0058] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明制備得到了蛋白TRML和變異體蛋白TRML-F3-N、 TRAIL-F3-C 和 TRAIL-PC-N。
[0059] 以下用實(shí)驗(yàn)例的方式說明本發(fā)明的有益效果：
[0060] 實(shí)驗(yàn)例1 TRAIL變異體功能片段共價(jià)連接方式對(duì)變異體活性的影響
[0061] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0062] 利用體外細(xì)胞毒性測(cè)試模型檢測(cè)TRAIL變異體蛋白的細(xì)胞殺傷活性。
[0063] 分別以人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721和人肺癌細(xì)胞株A549進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞在含10% 小牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100μg/ml鏈霉素和100U/ml青霉素的RPMI 1640中于37°C， 5% C02條件下培養(yǎng)。將IX 10 4個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中貼壁過夜，然后將培養(yǎng)基換為含 2%小牛血清的1640培養(yǎng)基，同時(shí)加入不同濃度的蛋白，作用過夜后，加入CCK-8溶液，反應(yīng) 2_4h后用酶標(biāo)儀測(cè)定495nm吸光值。以未經(jīng)蛋白處理的細(xì)胞存活率為100%來計(jì)算蛋白處 理組細(xì)胞存活率。
[0064] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0065] 結(jié)果如圖4所示：
[0066] 1、如圖4A所示，變異體TRAIL-F3-N和TRAIL-F3-C對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721和肺癌 細(xì)胞A549都顯示了殺傷活性。蛋白濃度越高，殺傷作用越強(qiáng)。
[0067] 結(jié)果說明本發(fā)明構(gòu)建的TRAIL變異體具有腫瘤細(xì)胞殺傷活性。
[0068] 2、進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，用于構(gòu)建TRAIL變異體的F3肽在測(cè)試濃度范圍內(nèi)對(duì)肝癌細(xì)胞 SMMC-7721和肺癌細(xì)胞A549均沒有明顯細(xì)胞毒作用。單獨(dú)的TRAIL只在高濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞有 一定殺傷。F3肽與TRAIL的混合物與單獨(dú)的TRAIL細(xì)胞殺傷活性相近，表明與F3簡(jiǎn)單混 合不能增強(qiáng)TRAIL活性。但是，將F3分別共價(jià)連接在TRAIL N末端或C末端形成的變異體 TRAIL-F3-N和TRAIL-F3-C均比相同濃度TRAIL的細(xì)胞殺傷活性強(qiáng)。
[0069] 結(jié)果表明，只有采用本發(fā)明特定融合方式，將TRAIL與F3共價(jià)連接，才能顯著增強(qiáng) 了 TRAIL對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性（圖4A)，而二者的簡(jiǎn)單混合則無法達(dá)到目的。
[0070] 3、對(duì)同一種腫瘤細(xì)胞，TRAIL-F3-N比TRAIL-F3-C的殺傷活性更強(qiáng)。
[0071] 結(jié)果表明將F3連接在TRAIL N末端比連接在C末端更利于增強(qiáng)TRAIL的腫瘤細(xì) 胞殺傷活性。
[0072] 4、用隨機(jī)對(duì)照PC肽替換F3與TRAIL共價(jià)連接，形成的變異體TRAIL-PC-N對(duì)腫瘤 細(xì)胞的殺傷與TRAIL無顯著差異（圖4B)。
[0073] 結(jié)果說明只有共價(jià)連接F3肽才能增強(qiáng)TRAIL抗腫瘤活性。
[0074] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，前述3種變異體蛋白中，本發(fā)明變異體TRAIL-F3-N和TRAIL-F3-C 對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性明顯高于TRAIL，而TRAIL-PC-N對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷與TRAIL無顯著 差異，其中，TRAIL-F3-N的殺傷活性最強(qiáng)。
[0075] 實(shí)驗(yàn)例2變異體蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷特性檢測(cè)
[0076] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0077] 利用體外細(xì)胞毒性測(cè)試模型比較TRAIL變異體蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的殺 傷活性，以確定其細(xì)胞殺傷的選擇性。將1X 1〇4個(gè)細(xì)胞（100 μ 1)接種于96孔板中貼壁過 夜，然后將培養(yǎng)基換為含2%小牛血清的1640培養(yǎng)基，同時(shí)加入不同濃度實(shí)施例1獲得的 TRAIL和TRAIL變異體蛋白，作用過夜后，加入10 μ 1 CCK-8溶液，反應(yīng)2-4h后用酶標(biāo)儀測(cè) 定495nm吸光值。以未經(jīng)蛋白處理的細(xì)胞存活率為100%來計(jì)算蛋白處理組細(xì)胞存活率。
[0078] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0079] 結(jié)果如圖5所示：
[0080] 1、對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用：TRAIL-F3-N和TRAIL-F3-C對(duì)肝癌（SMMC-7721、 SK-HEP-1、QGY-7703、QGY-7701、BEL-7402、BEL-7404、PLC/PRF/5)、肺癌（A549、SPC-A1、 NCI-H358、NCI-H1650、95D、NCI-H446、NCI-H1299)、結(jié)腸癌（COLO 205、SW480)、乳腺癌 (MDA-MB-231、MDA-MB-435S)和膠質(zhì)瘤（T98G)細(xì)胞都具有殺傷作用，且活性明顯強(qiáng)于 TRAIL。
[0081] 其中，TRAIL-F3-N對(duì)這些細(xì)胞的IC50介于0. 1~0. 5nM之間，比TRAIL的IC50低 10-40 倍。
[0082] 2、對(duì)正常細(xì)胞的殺傷作用：與TRAIL-樣，TRAIL-F3-N和TRAIL-F3-C對(duì)正常細(xì)胞 (如皮膚成纖維細(xì)胞HSF和C0S-7)均無明顯殺傷作用。
[0083] 結(jié)果表明，本發(fā)明制備的TRAIL變異體蛋白，TRAIL-F3-N和TRAIL-F3-C，都保留了 TRAIL選擇性殺死腫瘤細(xì)胞的特性，且TRAIL-F3-N對(duì)腫瘤的殺傷活性更強(qiáng)。
[0084] 實(shí)驗(yàn)例3 TRAIL變異體蛋白TRAIL-F3-N對(duì)腫瘤細(xì)胞的親和力
[0085] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0086] 我們用FITC標(biāo)記了 F3肽，TRAIL和TRAIL-F3-N，然后將其與細(xì)胞共同孵育，再用 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞與肽/蛋白的結(jié)合。FITC標(biāo)記時(shí)，將肽/蛋白溶液用Na 2C03調(diào)至pH 8. 5,然后與FITC按摩爾比1:24比例混合，避光25°C反應(yīng)lh，透析去除未偶聯(lián)的FITC。取 2X 105個(gè)細(xì)胞，懸浮于500 μ 1磷酸鹽緩沖液（PBS, 50mM，150mM NaCl，pH7. 4)中，加入不同 濃度FITC標(biāo)記物，4°C下結(jié)合lh，然后再用PBS洗滌2次后流式檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞陽性率。陽 性率越高，表明蛋白對(duì)細(xì)胞的結(jié)合能力越強(qiáng)。
[0087] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0088] 結(jié)果如圖6所示：
[0089] 1、如圖6A所示，單獨(dú)的F3肽（4μΜ)與肝癌細(xì)胞SMMC-7721孵育后，流式檢測(cè) 陽性率為55%，表明F3能與腫瘤細(xì)胞結(jié)合。單獨(dú)的TRAIL在2. 5, 5. 0和7. 5ηΜ濃度下 對(duì) SMMC-7721 的結(jié)合率為 5· 8 %，13. 2 %，25. 8 %。而 2· 5, 5· 0 和 7· 5nM 的 TRAIL-F3-N 對(duì) SMMC-7721的結(jié)合率為42%，63. 1 %，88. 8%，表明其對(duì)腫瘤細(xì)胞的結(jié)合能力高于單獨(dú)的F3 肽和TRAIL蛋白。
[0090] 也就是說，在更低劑量下，本發(fā)明變異體蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的親和力高于高劑量單 獨(dú)使用的F3與TRAIL，說明F3與TRAIL采用本發(fā)明特定方式融合可發(fā)揮協(xié)同增效作用。
[0091] 2、進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，將相同劑量的F3肽（4 μΜ)與不同種類腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞 進(jìn)行孵育，F(xiàn)3肽對(duì)腫瘤細(xì)胞的結(jié)合率（50~90% )高于對(duì)正常細(xì)胞的結(jié)合率（〈30% )(圖 6Β)。同樣，用流式細(xì)胞術(shù)比較1，2. 5和5nM TRAIL和TRAIL-F3-N對(duì)多種腫瘤細(xì)胞和正常 細(xì)胞的結(jié)合發(fā)現(xiàn)，相同劑量的TRAIL-F3-N對(duì)腫瘤細(xì)胞的結(jié)合強(qiáng)于TRAIL，但其對(duì)正常細(xì)胞 的結(jié)合與TRAIL接近（圖6C)。
[0092] 結(jié)果表明，本發(fā)明TRAIL變異體蛋白TRAIL-F3-N對(duì)正常細(xì)胞的親和力與TRAIL接 近，但對(duì)腫瘤細(xì)胞的親和力卻大大高于TRAIL，在一定的濃度下，TRAIL-F3-N可有效結(jié)合腫 瘤細(xì)胞而不結(jié)合正常細(xì)胞。
[0093] 同時(shí)，在相同劑量下，本發(fā)明變異體蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的親和力高于單獨(dú)使用的F3 與TRAIL，說明F3與TRAIL采用本發(fā)明特定方式融合可以發(fā)揮協(xié)同增效的作用。
[0094] 實(shí)驗(yàn)例4 TRAIL變異體蛋白TRAIL-F3-N誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡
[0095] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0096] 腫瘤細(xì)胞經(jīng)蛋白處理后，利用Annexin V(綠色熒光）聯(lián)合碘化丙啶（Propidium Iodide，PI，紅色熒光）染色，通過熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞。Annexin V+PI-顯示凋亡細(xì)胞，Annexin V+PI+顯示壞死細(xì)胞，Annexin ν-ΡΙ-顯示活細(xì)胞。
[0097] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0098] 肝癌細(xì)胞SMMC-7721經(jīng)2nM TRAIL-F3-N處理4h，用Annexin V/PI染色后于熒光 顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，大部分細(xì)胞為凋亡細(xì)胞（Annexin V+PI-)(圖7A)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā) 現(xiàn)，經(jīng)1、2、51^了狀11^43，處理后，凋亡細(xì)胞比率分別為48.6%、74.4%和85.9%，而相應(yīng) 的壞死細(xì)胞僅為0. 19%、0. 22%和0. 4% (圖7B)。用DAPI染色觀察細(xì)胞核的變化發(fā)現(xiàn)， TRAIL-F3-N對(duì)細(xì)胞作用8h，可觀察到大量細(xì)胞核固縮；作用24h，細(xì)胞核大量斷裂形成不 同長(zhǎng)度的核小體片段（圖7C)。TUNEL染色，然后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示TUNEL陽性率為 66. 3%，進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞核DNA斷裂（圖7D)。利用廣譜Caspase抑制劑Z-VAD-FMK與細(xì) 胞預(yù)先孵育2h，再加蛋白處理，發(fā)現(xiàn)Caspase抑制劑顯著抑制TRAIL-F3-N對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺 傷。檢測(cè)細(xì)胞Caspa Se3、8和9三種酶活性，發(fā)現(xiàn)TRAIL-F3-N作用后，腫瘤細(xì)胞三種酶均被 活化。且與單獨(dú)的TRAIL相比，相同劑量TRAIL-F3-N處理后三種Caspase酶的活化程度更 高（圖 7E)。
[0099] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明TRAIL變異體TRAIL-F3-N與TRAIL -樣，均通過Caspase 途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并且，TRAIL變異體TRAIL-F3-N誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性高于 TRAIL。
[0100] 實(shí)驗(yàn)例5 TRAIL變異體蛋白TRAIL-F3-N的體外穩(wěn)定性
[0101] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0102] 將血漿或全血與蛋白等體積混合，37°C孵育不同時(shí)間后，取樣檢測(cè)蛋白的細(xì)胞殺 傷活性，并根據(jù)活性變化判斷蛋白體外穩(wěn)定性。
[0103] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0104] 結(jié)果如圖8所示：
[0105] TRAIL在血漿中的活性隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減弱，孵育3h活性至少降低一半，24h后絕 大部分活性喪失。但TRAIL-F3-N在血漿中非常穩(wěn)定，孵育72h活性無明顯下降（圖8A)。
[0106] 圖8B的結(jié)果顯示，TRAIL-F3-N在全血中也很穩(wěn)定性，孵育6h活性無明顯下降。
[0107] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明TRAIL變異體蛋白TRAIL-F3-N比TRAIL更穩(wěn)定，也就是說， 以本發(fā)明方式將F3與TRAIL融合，可以有效提高TRAIL的體外穩(wěn)定性，便于儲(chǔ)存。
[0108] 實(shí)驗(yàn)例6 TRAIL變異體蛋白TRAIL-F3-N體內(nèi)腫瘤靶向性
[0109] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0110] 裸鼠皮下接種COLO 205(5X 105個(gè)/只）建立荷瘤模型。同時(shí)，按照常規(guī)方法，用 熒光染料CF750標(biāo)記TRAIL-F3-N和TRAIL蛋白。待腫瘤生長(zhǎng)至50~100mm 3時(shí)，通過尾靜 脈給藥。然后用熒光成像系統(tǒng)活體動(dòng)態(tài)觀察瘤體內(nèi)蛋白含量的變化，以確定蛋白是否能到 達(dá)腫瘤部位。觀察結(jié)束，處死荷瘤裸鼠，取出重要器官和組織，用熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白在 不同器官和組織中的分布。
[0111] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0112] 熒光成像結(jié)果如圖9A、B所示：給藥后10h，明顯觀察到TRAIL-F3-N在腫瘤部位富 集。隨時(shí)間延長(zhǎng)，瘤體內(nèi)累積的蛋白含量逐漸增多，至48h左右達(dá)峰值。腫瘤對(duì)TRAIL的攝 入比TRAIL-F3-N略快，給藥后6h即可在腫瘤部位觀察到。但富集于腫瘤部位的TRAIL含 量明顯少于TRAIL-F3-N。這說明TRAIL-F3-N比TRAIL更容易到達(dá)并富集于腫瘤部位。
[0113] 72h后處死動(dòng)物，觀察蛋白的組織分布結(jié)果如圖9C、D所示：TRAIL和TRAIL-F3-N 主要分布于腎、肝和腫瘤組織。兩種蛋白均通過肝和腎清除。因此，蛋白在肝，尤其是腎臟 中含量較多。而腫瘤組織內(nèi)的蛋白含量顯著高于肝腎以外的其它組織，說明TRAIL-F3-N 和TRAIL兩種蛋白均有腫瘤靶向性。但腫瘤部位富集的TRAIL-F3-N比TRAIL多，說明 TRAIL-F3-N的靶向性更強(qiáng)。
[0114] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明TRAIL變異體蛋白TRAIL-F3-N比TRAIL的靶向性更強(qiáng)，也 就是說，以本發(fā)明方式將F3與TRAIL融合，可以有效提高TRAIL的腫瘤靶向性。
[0115] 實(shí)驗(yàn)例7 TRAIL變異體蛋白TRAIL-F3-N對(duì)TRAIL敏感細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤活性
[0116] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0117] 體外活性測(cè)試結(jié)果顯示，結(jié)腸癌C0L0 205為TRAIL敏感細(xì)胞。裸鼠皮下接種C0L0 205(5X 105個(gè)/只），待瘤體生長(zhǎng)至100-200mm3時(shí)，瘤內(nèi)注射TRAIL和TRAIL-F3-N蛋白（0. 1 和0. 3mg/kg)，每天1次，連續(xù)3天。以等體積PBS為對(duì)照。定期測(cè)量瘤體大小。
[0118] 為進(jìn)一步測(cè)試尾靜脈注射蛋白的抗腫瘤效果，C0L0205細(xì)胞皮下接種后6天，尾靜 脈注射TRAIL和TRAIL-F3-N蛋白（10mg/kg)，全程給藥1次。
[0119] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0120] 瘤內(nèi)注射蛋白的抗腫瘤效果結(jié)果如圖10A所示，與對(duì)照組相比，TRAIL和 TRAIL-F3-N蛋白處理組腫瘤明顯生長(zhǎng)緩慢，說明兩種蛋白均有抗腫瘤活性。但TRAIL-F3-N 抑瘤效果比TRAIL好。TRAIL-F3-N蛋白處理組的腫瘤比相同劑量TRAIL處理后的腫瘤更 小。不僅如此，〇· lmg/kg TRAIL-F3-N抑瘤效果還優(yōu)于0· 3mg/kg的TRAIL。
[0121] 尾靜脈注射蛋白的抗腫瘤效果結(jié)果如圖10B所示，TRAIL和TRAIL-F3-N均能顯著 抑制腫瘤生長(zhǎng)。但同一時(shí)間點(diǎn)，TRAIL-F3-N處理組腫瘤小于TRAIL處理組，說明TRAIL-F3-N 比TRAIL的抗腫瘤效果更好。尾靜脈注射不同劑量TRAIL-F3-N，全程給藥1次。結(jié)果如圖 10C所示，與對(duì)照組相比，所有蛋白處理組瘤體生長(zhǎng)滯后，隨著蛋白濃度增高，瘤體生長(zhǎng)滯后 越明顯。觀察結(jié)束后剝離瘤體進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，不同劑量（2,5和10mg/kg)TRAIL-F3-N處理 組瘤體均明顯小于對(duì)照組（圖10D)。
[0122] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明TRAIL變異體蛋白TRAIL-F3-N比TRAIL的體內(nèi)抑瘤效果更 好，也就是說，以本發(fā)明方式將F3與TRAIL融合，可以有效提高TRAIL的體內(nèi)抑瘤效果。
[0123] 實(shí)驗(yàn)例8 TRAIL變異體蛋白TRAIL-F3-N對(duì)TRAIL抗性細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤活性
[0124] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0125] 體外殺傷活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞A549為TRAIL抗性細(xì)胞。皮下接種A549(5X 106 個(gè)/只），待瘤體平均生長(zhǎng)至50mm3左右，瘤內(nèi)注射不同劑量（1，3mg/kg) TRAIL和 TRAIL-F3-N蛋白，每天1次，共給藥3次。以等體積PBS為對(duì)照。
[0126] 在A549模型中，尾靜脈注射TRAIL和TRAIL-F3-N，每天1次，連續(xù)5次。
[0127] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0128] 瘤內(nèi)注射蛋白的抗腫瘤效果結(jié)果如圖11A所示：lmg/kg TRAIL不能抑制腫瘤生 長(zhǎng)，3mg/kg TRAIL延緩了腫瘤生長(zhǎng)，但瘤體大小與對(duì)照組無顯著性差異。而TRAIL-F3-N對(duì) A549的殺傷作用顯然強(qiáng)于TRAIL。lmg/kg和3mg/kg TRAIL-F3-N處理組瘤體大小與對(duì)照相 比有顯著性差異。
[0129] 尾靜脈注射蛋白的抗腫瘤效果結(jié)果如圖11B所示：10mg/kg TRAIL處理組腫瘤大 小與對(duì)照組無顯著性差異。而5mg/kg TRAIL-F3-N處理組腫瘤生長(zhǎng)就明顯慢于對(duì)照組。 10和20mg/kgTRAIL-F3-N處理組腫瘤生長(zhǎng)更慢。觀察結(jié)束后剝離瘤體進(jìn)行比較，10mg/kg TRAIL處理組瘤體大小和重量與對(duì)照組相比無差異。TRAIL-F3-N各處理組（5,10,20mg/kg) 瘤體和重量均小于對(duì)照組。其中，10和20mg/kg TRAIL-F3-N處理組瘤體平均重量與對(duì)照 組比有顯著性差異。10mg/kgTRAIL-F3-N處理組瘤體重量顯著低于相同劑量TRAIL組（圖 11C) 〇
[0130] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明TRAIL變異體蛋白TRAIL-F3-N對(duì)TRAIL抗性腫瘤有明顯的 抑瘤效果，可以用于治療對(duì)TRAIL有抗性的腫瘤，取得了完全意料不到的技術(shù)效果。
[0131] 實(shí)驗(yàn)例9 TRAIL變異體蛋白TRAIL-F3-N的短期急性毒性
[0132] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0133] SPF級(jí)BALB/c小鼠通過尾靜脈注射20mg/kg的TRAIL-F3-N、TRAIL或等體積PBS， 隔天1次共計(jì)10次。以小鼠給藥前的體重為100%，定期測(cè)定并計(jì)算給藥后小鼠體重的變 化。
[0134] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0135] 如圖12A所示，給藥后小鼠體重逐漸增長(zhǎng)，且各組小鼠體重?zé)o明顯差異。最后1 次給藥后3天處死小鼠取血清檢測(cè)肝腎功能指標(biāo)結(jié)果如圖12B所示，三組小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨 酶（ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST)水平無明顯差異。TRAIL-F3-N組尿素氮（UREAL)為PBS組的 1.6倍，尿酸（UA)約為PBS組0.7倍，但均在正常波動(dòng)范圍內(nèi)。肝腎組織學(xué)檢測(cè)也未發(fā)現(xiàn) TRAIL-F3-N和TRAIL有明顯肝腎毒性（圖12C)。
[0136] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TRAIL-F3-N具有良好的安全性，短期使用未出現(xiàn)明顯的肝和腎毒 性。
[0137] 本發(fā)明通過基因工程的方式，制備得到了純品TRAIL變異體蛋白TRAIL-F3-N 和TRAIL-F3-C，它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性明顯高于TRAIL，其中，TRAIL變異體蛋白 TRAIL-F3-N對(duì)腫瘤細(xì)胞的親和力、穩(wěn)定性、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡的能力、腫瘤靶向性和體內(nèi) 抗腫瘤活性均明顯優(yōu)于TRAIL，用于治療腫瘤的療效優(yōu)良；更進(jìn)一步地，TRAIL變異體蛋白 TRAIL-F3-N對(duì)TRAIL抗性腫瘤有良好療效，可用于治療TRAIL抗性腫瘤。
[0138] 綜上，本發(fā)明TRAIL變異體蛋白TRAIL-F3-N和TRAIL-F3-C具有優(yōu)良的性能，臨床 應(yīng)用前景良好。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變異體，其特征在于：它是腫瘤壞死因子相關(guān) 凋亡誘導(dǎo)配體與F3肽的融合蛋白，F(xiàn)3肽通過連接子連接在腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配 體的N末端或者C末端。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變異體，其特征在于：所述 腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變異體，其特征在于：所述 F3肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變異體，其特征在于：所述 F3肽由SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列編碼。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變異體，其特征在于：所述 連接子由2~20個(gè)氨基酸組成。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變異體，其特征在于：所述 連接子是（G4S)3連接子，其氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變異體，其特征在于：其由 SEQ ID NO :7或9所示的核苷酸序列編碼。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變異體，其特征在于：其氨 基酸序列如SEQ ID NO :8或10所示。9. 一種核苷酸序列，其特征在于：它包括腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的編碼序列 與F3肽的編碼序列，二者之間通過連接子的編碼序列連接。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的編碼序列，其特征在于：所述腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配 體的編碼序列如SEQ ID NO :1所示。11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的編碼序列，其特征在于：所述F3肽的編碼序列如SEQ ID NO: 3所示。12. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的核苷酸序列，其特征在于：所述連接子是（G4S) 3連接子，其 核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示。13. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的核苷酸序列，其特征在于：其如SEQ ID NO :7或9所示。14. 包含權(quán)利要求9~13任意一項(xiàng)所述核苷酸序列的重組載體或重組菌。15. -種制備權(quán)利要求1~8任意一項(xiàng)所述腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變異體的 方法，其特征在于：它是以權(quán)利要求9~13任意一項(xiàng)所述核苷酸序列為目標(biāo)片段，采用基因 工程的方法制備得到的。16. 權(quán)利要求1~8任意一項(xiàng)所述腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變異體在制備治療 細(xì)胞增生性疾病的藥物中的用途。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的用途，其特征在于：所述治療細(xì)胞增生性疾病的藥物是治 療腫瘤或自身免疫性疾病的藥物。18. -種抗腫瘤藥物，其特征在于：它是以權(quán)利要求1~8任意一項(xiàng)所述腫瘤壞死因子 相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體變異體為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料制備而成的制劑。
【文檔編號(hào)】A61K47/48GK105985445SQ201510074032
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月11日
【發(fā)明人】盧曉風(fēng), 楊浩, 萬琳, 程驚秋
【申請(qǐng)人】四川大學(xué)華西醫(yī)院