一種柑橘果皮的基因瞬時(shí)表達(dá)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種柑橘果皮的基因瞬時(shí)表達(dá)方法，通過柑橘不同組織器官RNA的提取和cDNA的合成；通過將外源目的基因搭載到pGreen II 002962?SK載體上電轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌GV3101::pSoup中，結(jié)合滲透液配方，以及獨(dú)特的注射手法和嚴(yán)格的對(duì)照，分析柑橘果皮瞬時(shí)表達(dá)。本發(fā)明方法設(shè)計(jì)合理，操作方便簡(jiǎn)單，能快速將多年生果樹柑橘的基因進(jìn)行同源功能驗(yàn)證，可以為多年生果樹的基因同源功能驗(yàn)證提供新思路和方法。本方法同樣適用于其他果實(shí)的瞬時(shí)表達(dá)研究。
【專利說明】
一種柑橘果皮的基因瞬時(shí)表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種柑橘果皮的基因瞬時(shí)表達(dá)方法，可用于 多年生果樹基因功能同源驗(yàn)證。
【背景技術(shù)】
[0002] 柑橘屬于蕓香科（Rutaceae)柑橘亞科（Aurantioideae)，分為枳屬（Poncirus Raf)、金柑屬(Fortnoella Swing)和柑桔屬(Citrus L·)，是世界第一大果樹種類，其種植 面積和產(chǎn)量均居首位，也是我國(guó)原產(chǎn)水果之一。柑橘果肉風(fēng)味獨(dú)特且具有抗癌和抗腫瘤等 營(yíng)養(yǎng)功能，并且柑橘果皮富含芳香物質(zhì)和天然色素，是研究揮發(fā)性物質(zhì)和色素代謝及其調(diào) 控相關(guān)基因的良好材料。
[0003] 基因功能驗(yàn)證可以分為兩種情況，一種是通過增強(qiáng)其表達(dá)，取得表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行研 究；另一種是減弱或者終止其表達(dá)，觀察整體功能的變化，進(jìn)而推測(cè)相應(yīng)基因的功能。目前， 柑橘主要是通過遺傳轉(zhuǎn)化的方法將外源基因過量導(dǎo)入柑橘體內(nèi)。植物遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)際上是一 個(gè)組織培養(yǎng)和再分化的過程，其操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)、對(duì)實(shí)驗(yàn)員技術(shù)要求高，再加上柑橘屬 于多年生木本植物，具有童期長(zhǎng)、基因高度雜合、多胚性和以及性器官敗育等生物學(xué)特性， 其遺傳轉(zhuǎn)化的高效再生體系不完善，轉(zhuǎn)化效率及再生效率都很低，這些都使柑橘遺傳轉(zhuǎn)化 受到極大的限制。此外，從獲得轉(zhuǎn)基因抗性芽到成苗的過程周期長(zhǎng)、難度大。
[0004] 植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)是引入的外源DNA和宿主細(xì)胞染色體DNA并不發(fā)生整合，這些 DNA隨載體進(jìn)入細(xì)胞后12h內(nèi)就可以表達(dá)，并持續(xù)約80h左右。它具有簡(jiǎn)單快速、表達(dá)水平高 和安全有效等優(yōu)點(diǎn)。多年生果樹常采用此方法進(jìn)行相關(guān)基因同源功能驗(yàn)證，但是目前柑橘 相關(guān)基因研究較少用柑橘果實(shí)材料進(jìn)行過量表達(dá)，可能是因?yàn)楸磉_(dá)載體、農(nóng)桿菌菌株、以及 表達(dá)體系等原因?qū)е隆?br>
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種柑橘果皮的基因瞬時(shí)表達(dá)方法，來克服現(xiàn)有柑橘遺傳轉(zhuǎn) 化方法存在的操作復(fù)雜、周期長(zhǎng)、難以獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株等方面的不足，解決柑橘果皮相 關(guān)基因的同源功能驗(yàn)證，為多年生果樹的基因同源功能驗(yàn)證提供新思路和方法。
[0006] 本發(fā)明提供的一種柑橘果皮的基因瞬時(shí)表達(dá)方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：
[0007] 1. RNA的提取和cDNA的合成:柑橘不同組織器官(莖、葉、花、果實(shí)）總RNA的提取采 用CTAB法進(jìn)行，并使用TURBO DNase (Ambion，美國(guó)）去除基因組DNA污染，再取1. Oyg RNA用 iScript cDNA Synthesis Kit(Bi〇-Rad，美國(guó)）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA備用，其中柑橘RNA的提取采 用不同組織器官分別為莖、葉、花、果實(shí)的混合樣品，去DNA后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
[0008] 2.表達(dá)載體構(gòu)建：基于甜橙和克林曼丁柑橘基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http:// WWW.citrusgenomedb.org)，通過注釋并利用已報(bào)道的擬南芥AP2/ERF家族基因序列進(jìn)行 BLAST(TBLASTN和BLASTP)分析獲得與葉綠素降解相關(guān)的CUERF13全長(zhǎng)序列（SEQ:N0.1)。利 用PCR技術(shù)，結(jié)合引物對(duì)SEQ:N0.2和SEQ: N0.3擴(kuò)增獲得該基因，并采用測(cè)序手段進(jìn)一步驗(yàn) 證。根據(jù)已確認(rèn)的CitERF13(SEQ:N0.1)660bp全長(zhǎng)序列和全長(zhǎng)擴(kuò)增引物SEQ:N0.2和SEQ : 腸.3擴(kuò)增該基因的開放閱讀框。以柑橘混合〇0嫩為模板，參照1?〇(3116公司？38七3七31'1:!^區(qū)11 Fidelity PCR System進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中30μ1 PCR體系為：10XBuffer 3yl，dNTP 2·4μ1， 上/下游引物各〇 · 6μ1，酶Ο · 15μ1，DEPC-H20 22 · 5μ1，cDNA Ο · 75μ1; PCR程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性 5min;95°C 變性 30sec，58°C 退火 30sec，72°C 延伸 lmin，35 個(gè)熱循環(huán)；72°C 延伸 10min，4°C 保 存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳回收后連接于Promega公司的pGEM-T easy載體上，ΙΟμΙ 連接體系為:載體ΙμL，Τ4連接酶ΙμL，緩沖液5μ1，回收產(chǎn)物3μ1，16°C過夜連接。將重組質(zhì)粒 采用熱激法導(dǎo)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，用不含任何抗生素的液體LB培養(yǎng)基(購(gòu)自上 海生工生物工程股份有限公司，配方為胰蛋白胨l〇.〇g，酵母粉5.0g，NaCl lO.Og)于37°C 150rpm培養(yǎng)lh后，均勾涂布于含lOOyg ml/1氨節(jié)青霉素的固體LB培養(yǎng)基(配方為胰蛋白胨 l〇.〇g，酵母粉5.0g，NaCl lO.Og，瓊脂糖15.0g)上初步篩選，用T載體通用引物(SEQ:N0.4和 SEQ:N0.5)對(duì)陽(yáng)性克隆采用Takara公司的exTaq酶進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證后測(cè)序。經(jīng)測(cè)序獲得序 列正確的陽(yáng)性克隆再采用NEB公司限制性內(nèi)切酶Spe I和Not I進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)物再次電泳回 收，然后連接到經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶處理的pGreenn〇029 62-SK表達(dá)載體上，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞后經(jīng)50yg ml/1卡那霉素篩選，用pGreenn〇029 62-SK表達(dá)載 體自帶的檢測(cè)引物（SEQ:NO. 6和SEQ:NO. 7)對(duì)陽(yáng)性克隆菌液PCR后測(cè)序再驗(yàn)證。將最終確認(rèn) 正確構(gòu)建的表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化入GV3101: :pSoup農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布到含25yg ml/1慶 大霉素和50yg ml/1卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h，挑取陽(yáng)性克隆菌液PCR驗(yàn)證。 將驗(yàn)證成功的陽(yáng)性克隆在3ml含25yg ml/1慶大霉素和50yg ml/1卡那霉素的液體LB中， 200rpm，28 °C培養(yǎng)24h后，用終濃度20 %滅菌甘油保存陽(yáng)性克隆，存放于-80 °C備用。
[0009] 3.柑橘果皮瞬時(shí)表達(dá)分析:將保存于-80°C的甘油菌劃線接種于含25yg ml/1慶大 霉素和50yg ml/1卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h進(jìn)行菌落活化，隨后挑取小部分 活化后的菌落涂布于新的含以上兩種抗生素的固體LB培養(yǎng)基上繼續(xù)28°C培養(yǎng)12h，接著將 活化兩次的農(nóng)桿菌收集到滲透液（10mMMES，10mMMgCl 2，150mM乙酰丁香酮，pH5.6)中，調(diào) 整其濃度為〇D600 = 0.75備用。挑選一定數(shù)量大小均勻、色澤一致且無機(jī)械傷病蟲害的果實(shí) 進(jìn)行基因瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。先將注射器針頭修剪到果皮厚度長(zhǎng)度，防止菌液注射不進(jìn)或注射 進(jìn)入果肉，分別取lml調(diào)整過濃度的含目的基因或?qū)φ盏木河脦п橆^的注射器分別注射 同一個(gè)果實(shí)的赤道面對(duì)立部位，通過緩慢推動(dòng)注射器來使菌液滲入果皮并使其擴(kuò)散面積最 大化。注射5d后，與對(duì)照相比，注射CUERF13的果皮葉綠素降解明顯增強(qiáng)。收集農(nóng)桿菌滲透 區(qū)域果皮組織樣品，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，注射CUERF13的果皮葉綠素含量顯著低于陰性對(duì)照 [0010]本發(fā)明利用甜橙和克林曼丁柑橘基因組數(shù)據(jù)庫(kù)得到CUERF13全長(zhǎng)序列，然后應(yīng)用 普通PCR技術(shù)對(duì)電子克隆到的序列進(jìn)行驗(yàn)證，再利用pGreen II 0029 62-SK表達(dá)載體，結(jié)合 滲透液配方（1〇1^1^3，10禮1%(：12，15〇1111乙酰丁香酮，？!15.6)，以及獨(dú)特的注射手法和嚴(yán) 格的對(duì)照(帶針頭的注射器分別注射到同一個(gè)果實(shí)的赤道面對(duì)立部位），得出一種柑橘果皮 相關(guān)基因瞬時(shí)表達(dá)方法。本發(fā)明方法設(shè)計(jì)合理，操作方便簡(jiǎn)單，能快速將多年生果樹柑橘的 基因進(jìn)行同源功能驗(yàn)證，可以為多年生果樹的基因同源功能驗(yàn)證提供新思路和方法。本方 法同樣適用于其他果實(shí)的瞬時(shí)表達(dá)研究。
【附圖說明】
[0011]附圖1:外源基因 CitERF13(SEQ:N0.1)在甜橙果皮中的表達(dá)，箭頭所指方向?yàn)樽⑸?口位置
[0012]附圖2:外源基因 Ci tERFl 3 (SEQ: NO. 1)在櫳柑果皮中的表達(dá)，箭頭所指方向?yàn)樽⑸?口位置。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，以外源基因 CUERF13在甜橙和櫳柑果皮中的表達(dá)為 例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但實(shí)施例不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014] 下述實(shí)施例中常規(guī)的基因操作方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版）。
[0015]實(shí)施例1:柑橘果皮CUERF13基因在甜橙果皮中瞬時(shí)表達(dá)
[0016] 1. RNA的提取和CDNA的合成:柑橘不同組織器官(莖、葉、花、果實(shí)）總RNA的提取采 用CTAB法進(jìn)行，并使用TURBO DNase (Ambion，美國(guó)）去除基因組DNA污染，再取1. Oyg RNA用 iScript cDNA Synthesis Kit(Bi〇-Rad，美國(guó)）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA備用，具體操縱按說明書進(jìn) 行。
[0017] 2.表達(dá)載體構(gòu)建：基于甜橙和克林曼丁柑橘基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http:// WWW.citrusgenomedb.org)，通過注釋并利用已報(bào)道的擬南芥AP2/ERF家族基因序列進(jìn)行 BLAST (TBLASTN和BLASTP)分析獲得與葉綠素降解相關(guān)的Ci tERF 13 (SEQ: NO. 1)。利用PCR技 術(shù)，結(jié)合引物對(duì)SEQ:N0.2和SEQ:N0.3擴(kuò)增獲得該基因，并采用測(cè)序手段進(jìn)一步驗(yàn)證。根據(jù)已 確認(rèn)的CitERF13(SEQ:N0.1)660bp全長(zhǎng)序列和全長(zhǎng)擴(kuò)增引物SEQ:N0.2和SEQ:N0.3擴(kuò)增該基 因的開放閱讀框。以柑橘不同組織器官（莖、葉、花、果實(shí)）混合cDNA為模板，參照Roche公司 FastStart High Fidelity PCR System進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中30μ1 PCR體系為：10 XBuffer 3 μl，dNTP2·4μl，上/下游引物各0·6μl，酶0·15μl，DEPC-H20 22·5μl，cDNA0·75μl;PCR程序 為：95°C 預(yù)變性 5min;95°C 變性 30sec，58°C 退火 30sec，72°C 延伸 lmin，35 個(gè)熱循環(huán)；72°C 延 伸lOmin，4°C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳回收后連接于Promega公司的pGEM-T easy載體上，10μ1連接體系為:載體ΙμL，T4連接酶ΙμL，緩沖液5μ1，回收產(chǎn)物3μ1，16°C過夜 連接。將重組質(zhì)粒采用熱激法導(dǎo)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，用不含任何抗生素的液體 LB培養(yǎng)基(購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，配方為胰蛋白胨lO.Og，酵母粉5.0g，NaCl 10.Og)于37°C 150rpm培養(yǎng)lh后，均勻涂布于含lOOyg ml/1氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基(配方 為胰蛋白胨10. 〇g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，瓊脂糖15.0g)上初步篩選，用T載體通用引物 (SEQ: N0.4和SEQ: N0.5)對(duì)陽(yáng)性克隆采用Takara公司的exTaq酶進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證后測(cè)序。經(jīng) 測(cè)序獲得序列正確的陽(yáng)性克隆再采用NEB公司限制性內(nèi)切酶Spel和Notl進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)物 再次電泳回收，然后連接到經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶處理的pGreenn〇029 62-SK表達(dá)載體上， 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞后經(jīng)50yg mL-1卡那霉素篩選，用pGreen Π 0029 62-SK表達(dá)載體自帶的檢測(cè)引物(SEQ: NO. 6和SEQ:NO. 7)對(duì)陽(yáng)性克隆菌液PCR后測(cè)序再驗(yàn)證。 將最終確認(rèn)正確構(gòu)建的表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化入GV3101: :pSoup農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布到含 25yg ml/1慶大霉素和50yg ml/1卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h，挑取陽(yáng)性克隆 菌液PCR驗(yàn)證。將驗(yàn)證成功的陽(yáng)性克隆在3ml含25yg ml/1慶大霉素和50yg ml/1卡那霉素的 液體LB中，200rpm，28 °C培養(yǎng)24h后，用終濃度20 %滅菌甘油保存陽(yáng)性克隆，存放于-80 °C備 用。
[0018] 3.柑橘果皮瞬時(shí)表達(dá)分析:將保存于-80 °C的甘油菌劃線接種于含25yg ml/1慶大 霉素和50yg ml/1卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h進(jìn)行菌落活化，隨后挑取小部分 活化后的菌落涂布于新的含以上兩種抗生素的固體LB培養(yǎng)基上繼續(xù)28°C培養(yǎng)12h，接著將 活化兩次的農(nóng)桿菌收集到滲透液（10mMMES，10mMMgCl 2，150mM乙酰丁香酮，pH5.6)中，調(diào) 整其濃度為〇D600 = 0.75備用。
[0019]盛花期后150d的甜橙果實(shí)于采后當(dāng)天抵運(yùn)實(shí)驗(yàn)室，挑選一定數(shù)量大小均勻、色澤 一致且無機(jī)械傷病蟲害的果實(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。先將注射器針頭修剪到果皮厚度長(zhǎng)度，防止 菌液注射不進(jìn)或注射進(jìn)入果肉，將盛有l(wèi)ml菌液的注射器針頭插入果皮，緩慢推動(dòng)注射器使 菌液滲入果皮并使擴(kuò)散最大化。每次實(shí)驗(yàn)中，都要設(shè)計(jì)嚴(yán)格的陰性對(duì)照，即注入含pGreen II 0029 62-SK對(duì)照的農(nóng)桿菌菌株滲透液，目的基因和陰性對(duì)照注射部位為同一個(gè)果實(shí)的 赤道面對(duì)立部位。注射5d后，果皮表型和葉綠素含量如附圖1，與對(duì)照相比，注射CUERF13的 果皮葉綠素降解明顯增強(qiáng)。收集農(nóng)桿菌滲透區(qū)域果皮組織樣品，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，注射CUERF13的 果皮葉綠素含量顯著低于陰性對(duì)照。
[0020] 實(shí)施例2:柑橘果皮CUERF13基因在櫳柑果皮中瞬時(shí)表達(dá)
[0021] 整個(gè)步驟同實(shí)施例1，注射果實(shí)為櫳柑果皮。
[0022]采取盛花期后160d的櫳柑果實(shí)進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。注射5d后，果皮表型和葉綠素 含量如附圖2,與對(duì)照相比，注射CUERF13的果皮葉綠素降解明顯增強(qiáng)。收集農(nóng)桿菌滲透區(qū) 域果皮組織樣品，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，注射CUERF13的果皮葉綠素含量顯著低于陰性對(duì)照 [0023]本發(fā)明利用柑橘基因組數(shù)據(jù)庫(kù)分離得到與葉綠素降解相關(guān)的CUERF13,將其搭載 到pGreen II 0029 62-SK表達(dá)載體上，并導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101::pSoup中，結(jié)合滲透液配方 (1〇11^1^3，1〇11^1^(：1 2，15〇11^乙酰丁香酮，？!15.6)，以及獨(dú)特的注射手法和嚴(yán)格的對(duì)照 (帶針頭的注射器分別注射到同一個(gè)果實(shí)的赤道面對(duì)立部位），得出一種柑橘果皮相關(guān)基因 瞬時(shí)表達(dá)方法，為多年生果樹的基因同源功能驗(yàn)證提供新思路和方法。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種柑橘果皮的基因瞬時(shí)表達(dá)方法，其特征在于，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)： (1) RNA的提取和cDNA的合成：柑橘不同組織器官混合樣品總RNA的提取采用CTAB法進(jìn) 行，并使用TURBO DNase去除基因組DNA污染，再取l.Oyg RNA用iScript cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄成cDNA備用； (2) 表達(dá)載體構(gòu)建:基于甜橙和克林曼丁柑橘基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得SEQ:N0.1的CUERF13 全長(zhǎng)序列，以柑橘不同組織器官混合cDNA為模板，結(jié)合全長(zhǎng)擴(kuò)增引物序列SEQ: NO. 2和SEQ: 繼.3，參照?&8七3七31'1：]^811?丨(161;^7?0?35^七61]1說明書配制?0?體系，按照其推薦的？0? 程序進(jìn)行產(chǎn)物擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收后連接于pGEM-T easy載體上，將重 組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，在含l〇〇yg M/1氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上初 步篩選，用T載體通用引物序列SEQ: NO. 4和SEQ: NO. 5的菌液PCR后經(jīng)測(cè)序獲得序列正確的陽(yáng) 性克隆，再將其質(zhì)粒采用相應(yīng)限制內(nèi)切酶酶切，產(chǎn)物電泳回收，然后連接到經(jīng)相同限制性內(nèi) 切酶處理的pGreen Π 0029 62-SK表達(dá)載體上，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞后 經(jīng)50yg mL-1卡那霉素篩選，用pGreen Π 0029 62-SK表達(dá)載體自帶的檢測(cè)引物序列SEQ: NO. 6 和SEQ: NO. 7對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證后測(cè)序再驗(yàn)證，將最終確認(rèn)正確構(gòu)建的表達(dá)載體 電轉(zhuǎn)化入GV3101::pSoup農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，陽(yáng)性克隆保存成甘油菌，存放于-80°C備用； (3) 柑橘果皮瞬時(shí)表達(dá)分析:將保存于-80°C的甘油菌劃線接種于含25yg ml/1慶大霉素 和50yg ml/1卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h進(jìn)行菌落活化，隨后挑取小部分活化 后的菌落涂布于新的含以上兩種抗生素的固體LB培養(yǎng)基上繼續(xù)28°C培養(yǎng)12h，接著將活化 兩次的農(nóng)桿菌收集到滲透液中，調(diào)整其濃度為〇D600 = 0.75備用，挑選大小均勻、色澤一致 且無機(jī)械傷病蟲害的果實(shí)，分別取lml調(diào)整濃度后的含目的基因或?qū)φ盏木海謩e注射同 一個(gè)果實(shí)的赤道面對(duì)立部位，注射5天后，與對(duì)照相比，注射CUERF13的果皮葉綠素降解明 顯增強(qiáng)，收集農(nóng)桿菌滲透區(qū)域果皮組織樣品，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，注射CUERF13的果皮葉綠素含量顯 著低于陰性對(duì)照。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種柑橘果皮瞬時(shí)表達(dá)方法，其特征在于，步驟（1)所述柑橘 不同組織器官混合樣品是指莖、葉、花、果實(shí)的混合樣品，去DNA后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種柑橘果皮瞬時(shí)表達(dá)方法，其特征在于，步驟(2)中，表達(dá)載 體的構(gòu)建是將CUERF13的開放閱讀框采用高保真酶擴(kuò)增最終搭載到pGreen II 0029 62-SK載體上，并通過電擊法將其導(dǎo)入到農(nóng)桿菌GV3101: :pSoup中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種柑橘果皮瞬時(shí)表達(dá)方法，其特征在于，步驟(3)中，農(nóng)桿菌 活化次數(shù)為兩次，收集菌體的滲透液配方為10mM MES，10mM MgCl2，150mM乙酰丁香酮，pH 5.6，菌液濃度調(diào)整為0D600 = 0.75。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種柑橘果皮瞬時(shí)表達(dá)方法，其特征在于，步驟(3)中，所挑選 的果實(shí)大小均勻、色澤度一致且無機(jī)械傷病蟲害，用帶針頭的注射器分別注射到同一個(gè)果 實(shí)的赤道面對(duì)立部位進(jìn)行嚴(yán)格的對(duì)照試驗(yàn)。
【文檔編號(hào)】C12N15/84GK105969798SQ201610290979
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年5月4日
【發(fā)明人】殷學(xué)仁, 陳昆松, 謝秀蘭, 劉曉芬
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)