一種食管癌細胞系及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種食管癌細胞系及其應用，所述食管癌細胞系，命名為人食管鱗癌細胞系ZEC?134，保藏號為：CCTCC NO：C2016108。本發(fā)明人食管鱗癌細胞系ZEC?134來自于一例中國的食管癌患者的胸水，STR檢測結(jié)果證明其是唯一的，且在原代培養(yǎng)過程中未發(fā)生和其他細胞的交叉污染，克隆形成與成瘤性強，可以作為食管癌研究及食管癌檢測試劑盒開發(fā)、藥物篩選等方面應用的理想細胞系。CCTCC NO：C201610820160705
【專利說明】
一種食管癌細胞系及其應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物學和腫瘤學技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種食管癌細胞系及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 食管癌是常見的消化道惡性腫瘤。全世界每年約有30萬人死于食管癌。其發(fā)病率 和死亡率各國差異很大。我國是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一，每年平均病死約15萬人。男多 于女，發(fā)病年齡多在40歲以上。食管癌典型的癥狀為進行性咽下困難，先是難咽干的食物， 繼而是半流質(zhì)食物，最后水和唾液也不能咽下。在我國，食管癌發(fā)病率居全身腫瘤第5位，其 死亡率居第4位。食管癌的兩種主要亞型:鱗癌和腺癌，其中鱗癌約占90%。
[0003] 食管癌患者臨床表現(xiàn)如下：
[0004] 早期:癥狀常不明顯，但在吞咽粗硬食物時可能有不同程度的不適感覺，包括咽下 食物梗噎感，胸骨后燒灼樣、針刺樣或牽拉摩擦樣疼痛。食物通過緩慢，并有停滯感或異物 感。梗噎停滯感常通過吞咽水后緩解消失。癥狀時輕時重，進展緩慢。
[0005] 中晚期:食管癌典型的癥狀為進行性咽下困難，先是難咽干的食物，繼而是半流質(zhì) 食物，最后水和唾液也不能咽下。常吐黏液樣痰，為下咽的唾液和食管的分泌物。患者逐漸 消瘦、脫水、無力。持續(xù)胸痛或背痛表示為晚期癥狀，癌已侵犯食管外組織。當癌腫梗阻所引 起的炎癥水腫暫時消退，或部分癌腫脫落后，梗阻癥狀可暫時減輕，常誤認為病情好轉(zhuǎn)。若 癌腫侵犯喉返神經(jīng)，可出現(xiàn)聲音嘶??；若壓迫頸交感神經(jīng)節(jié)，可產(chǎn)生Horner綜合征;若侵入 氣管、支氣管，可形成食管、氣管或支氣管痿，出現(xiàn)吞咽水或食物時劇烈嗆咳，并發(fā)生呼吸系 統(tǒng)感染。最后出現(xiàn)惡病質(zhì)狀態(tài)。若有肝、腦等臟器轉(zhuǎn)移，可出現(xiàn)黃疸、腹腔積液、昏迷等狀態(tài)。
[0006] 治療主要分外科治療、放射治療、化學治療等，近年來，以手術(shù)為主的綜合治療已 經(jīng)達到了瓶頸，而食管癌化療發(fā)展緩慢，尚無明確結(jié)論與標準方案。
[0007] 為深入了解食管鱗癌的發(fā)病機理和藥物及其他治療方法的研究，必須建立合適的 研究模型。目前國內(nèi)外常用的食管癌細胞株主要來源于日本，包括KYSE系列和TE系列。這些 細胞系長期在體外傳代，一些已經(jīng)喪失了原始腫瘤組織的特性。因為種族差異，生活習慣不 同，環(huán)境因素等原因，這些細胞能否代表我國食管癌的類型和特點存在很大的疑問。國內(nèi)少 數(shù)實驗室已建立的細胞株較少，部分廣泛使用的細胞株受到其他細胞的污染，使得食管癌 的研究不能深入開展。而且，隨著腫瘤精準醫(yī)學的治療理念的深入臨床實踐，提供更多的食 管癌細胞株有助于靶向藥物的研發(fā)和應用。建立中國人來源的食管癌細胞株，為食管鱗癌 的發(fā)病機制及治療提供新的模型，具有重要的理論和實際應用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明針對目前國內(nèi)缺乏中國人來源的食管癌細胞株，而提供了一種來源于中國 人的食管癌細胞系。
[0009] 本發(fā)明人食管鱗癌細胞系ZEC-134從一例食管癌患者（患者為54歲男性，腫瘤位于 食管中段癌，CT顯示縱隔多組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、兩側(cè)氣管-食管溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，胃鏡病理活檢顯 示低分化鱗狀細胞癌，胸水鏡下可見腫瘤細胞，臨床分期4期。）的胸水標本取樣，經(jīng)原代培 養(yǎng)并建系成功后，命名為人食管鱗癌細胞系ZEC-134,于2016年7月5日保藏于位于中國武漢 武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為:CCTCC N0:C2016108。
[0010]本發(fā)明人食管鱗癌細胞系ZEC-134細胞生長旺盛，背景清晰，雜質(zhì)少見，細胞呈扁 平不規(guī)則多角形，細胞彼此緊密相連，符合上皮樣細胞的特點。貼壁后生長較快，具有良好 的體外培養(yǎng)擴增性。染色體數(shù)目大多分布在45~57之間，眾數(shù)為52，符合惡性腫瘤的特征。 [0011] 本發(fā)明人食管鱗癌細胞系ZEC-134的STR測序結(jié)果與ATCC、DSMZ等細胞保存庫的數(shù) 據(jù)庫進行查詢對比，未發(fā)現(xiàn)相同STR檢測結(jié)果，證明其是唯一的，且在原代培養(yǎng)過程中未發(fā) 生和其他細胞的交叉污染。免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)，人食管鱗癌細胞系ZEC-134細胞呈CK5/6陽 性，CK14陽性，p63陽性，CgA陰性，Sy陰性和CD56陰性。
[0012] 克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，人食管鱗癌細胞系ZEC-134細胞的克隆形成率與接種密度有 關(guān)系，接種密度為4500個細胞時的細胞克隆形成能力較強。
[0013] 裸鼠（裸小鼠）成瘤實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人食管鱗癌細胞系ZEC-134成瘤性較強。
[0014] 本發(fā)明又提供了所述的食管癌細胞系的子代細胞。所述子代細胞基本或全部保留 了親代細胞的特性。
[0015] 本發(fā)明又提供了所述的食管癌細胞系在作為食管癌發(fā)生機理研究的細胞模型中 的應用。由于本發(fā)明人食管鱗癌細胞系ZEC-134是從中國人來源建立的，且建系時間較短， 性狀穩(wěn)定，以該食管癌細胞系作為研究模型，對于了解中國人的原發(fā)性食管癌發(fā)生機理有 很大幫助。
[0016] 本發(fā)明還提供了所述的食管癌細胞系在建立哺乳動物食管癌模型中的應用。所述 的哺乳動物為裸小鼠或裸大鼠。通過將一定細胞數(shù)量的所述人食管鱗癌細胞系ZEC-134細 胞接種于裸小鼠或裸大鼠的皮下、肝臟、腹腔或者尾靜脈等部位，獲得食管癌的動物模型。
[0017] 本發(fā)明還提供了所述的食管癌細胞系在提取食管癌特異性腫瘤標志物中的應用。 通過與正常的食管細胞及其他種類的癌癥細胞進行比較研究，可以發(fā)現(xiàn)食管癌的分子標 記，針對該分子標記可以進行后續(xù)的疾病檢測及藥物開發(fā)等方面的應用。
[0018] 本發(fā)明還提供了所述的食管癌細胞系在篩選或評估治療食管癌藥物中的應用。首 先，通過向所述人食管鱗癌細胞系ZEC-134培養(yǎng)基中添加不同藥物，觀察細胞狀態(tài)變化，獲 得初步有效的候選藥物。然后，將候選藥物施藥于上述食管癌的動物模型，觀察與未施藥組 動物的存活期、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移情況等，篩選獲得潛在治療食管癌的藥物。
[0019] 本發(fā)明還提供了所述的食管癌細胞系在開發(fā)食管癌檢測試劑盒中的應用。發(fā)現(xiàn)食 管癌特異性的腫瘤標志物后，可根據(jù)該腫瘤標志物開發(fā)出檢測食管癌發(fā)生或發(fā)展情況的檢 測試劑盒。
[0020] 本發(fā)明人食管鱗癌細胞系ZEC-134來自于一例中國的食管癌患者的胸水，STR檢測 結(jié)果證明其是唯一的，且在原代培養(yǎng)過程中未發(fā)生和其他細胞的交叉污染，克隆形成與成 瘤性強，可以作為食管癌研究及食管癌檢測試劑盒開發(fā)、藥物篩選等方面應用的理想細胞 系。
【附圖說明】
[0021] 圖1為人食管鱗癌細胞系ZEC-134細胞的形態(tài)檢測圖；
[0022]圖2為人食管鱗癌細胞系ZEC-134的細胞生長曲線圖；
[0023]圖3為人食管鱗癌細胞系ZEC-134細胞的染色體核型分布圖；
[0024]圖4為STR分析結(jié)果圖，其中，圖A~F分別是不同等位基因的結(jié)果圖；
[0025]圖5為人食管鱗癌細胞系ZEC-134細胞免疫細胞化學分析結(jié)果圖；
[0026]圖6為人食管鱗癌細胞系ZEC-134細胞克隆形成實驗結(jié)果圖，其中，圖A、B和C接種 細胞數(shù)分別為500、1500和4500個；
[0027]圖7為小鼠成瘤實驗結(jié)果圖。
【具體實施方式】 [0028] 實施例1
[0029]從一例食管癌患者（患者為54歲男性，腫瘤位于食管中段癌，CT顯示縱隔多組淋巴 結(jié)轉(zhuǎn)移、兩側(cè)氣管-食管溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，胃鏡病理活檢顯示低分化鱗狀細胞癌，胸水鏡下可 見腫瘤細胞，臨床分期4期。）的胸水標本取樣，離心取沉淀在無菌超凈臺中用PBS洗凈離心 后，向培養(yǎng)皿中加入含10mL的10%FBS(GIBC0公司），1%雙抗DMEM/F12細胞培養(yǎng)基(GIBC0公 司），放入37°C、5%C0 2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。5~7天后換液，棄去組織塊中壞死脫落的漂浮 小塊，進行傳代培養(yǎng)。在傳代培養(yǎng)過程中，利用成纖維細胞與腫瘤細胞消化能力的不同，不 斷去除成纖維細胞。多次傳代后，培養(yǎng)皿中肉眼已無法觀察到成纖維細胞，并能持續(xù)生長傳 代。建系成功后，命名為人食管鱗癌細胞系ZEC-134,于2016年7月5日保藏于位于中國武漢 武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為:CCTCC N0:C2016108。
[0030] 實施例2
[0031]取傳代培養(yǎng)的人食管鱗癌細胞系ZEC-134細胞，在光學顯微鏡下（日本Olympus 頂T-2倒置顯微鏡)觀察活細胞生長情況。如圖1所示，細胞光學形態(tài)圖片，可見細胞生長旺 盛，背景清晰，雜質(zhì)少見，細胞呈扁平不規(guī)則多角形，細胞彼此緊密相連，符合上皮樣細胞的 特點。
[0032] 實施例3
[0033]取生長狀態(tài)良好的人食管鱗癌細胞系ZEC-134細胞，經(jīng)胰酶消化，制成細胞懸液， 并計數(shù)。在96孔板中接種細胞懸液（1 OOyL/孔，2000個細胞），貼壁后4小時，加入1 OyL CCK8， 繼續(xù)培養(yǎng)2小時，用酶標儀測定在490nm處的吸光值，之后，每隔1天進行檢測，持續(xù)6天。利用 Graph Pad軟件繪制生長曲線，并計算得到細胞的群體倍增時間約60小時。如圖2所示，本發(fā) 明人食管鱗癌細胞系ZEC-134貼壁后生長較快，具有良好的體外培養(yǎng)擴增性。
[0034] 實施例4
[0035] 取人食管鱗癌細胞系ZEC-134細胞，種植在六孔板中，培養(yǎng)48小時后，用0.01mg/mL 的秋水仙素處理16h，當鏡檢觀察到Μ期細胞比例為50%以上時，收集Μ期細胞。使用KC1低滲 液低滲處理Μ期細胞15~20min，用甲醇/冰醋酸（體積比3:1)作為固定液在室溫下固定細 胞，玻片上制片。將玻片置于〇.〇2%胰酶溶液中消化30~6〇8，經(jīng)1^3漂洗，6丨61118 &染色，晾 干，完成制片。于顯微鏡下觀察，計算每個細胞中染色體數(shù)目，隨機選取20個細胞進行計算。 如圖3所示，染色體數(shù)目大多分布在45~57之間，眾數(shù)為52,符合惡性腫瘤的特征。
[0036] 實施例5
[0037] 短串聯(lián)重復序列（short tandem repeat，STR)又稱為微衛(wèi)星DNA。一般由一個長2 ~6bp的核心序列經(jīng)多次串聯(lián)重復排列而成，重復次數(shù)大多在10~60次之間。個體間核心序 列的重復次數(shù)呈高度變異性，因而一組STR序列的重復次數(shù)在不同個體中幾乎是唯一的，是 細胞生物學對細胞身份和來源進行鑒定的主要方法。收集新鮮培養(yǎng)的人食管鱗癌細胞系 ZEC-134細胞，用Qiagen基因組DNA小量提取試劑盒（購自Qiagen公司，貨名QIAamp DNA Mini Kit，貨號為51304)提取細胞基因組DNA，用5'端熒光標記的STR引物進行PCR擴增，對 所得產(chǎn)物進行測序。其中STR位點的引物序列及拷貝數(shù)如表1和圖4所示。上述序列和ATCC， DSMZ等細胞保存庫的數(shù)據(jù)庫進行查詢對比，未發(fā)現(xiàn)相同STR檢測結(jié)果，由此可以證明其是唯 一的，且在原代培養(yǎng)過程中未發(fā)生和其他細胞的交叉污染。
[0038]表1STR位點的拷貝數(shù)。
[0041 ] 實施例6
[0042]免疫組化檢測人食管鱗癌細胞系ZEC-134細胞標記蛋白。采用S-P法進行免疫組化 染色，相關(guān)試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。所用的抗體為CK5/6(貨號MAB- 0276,福州邁新公司），P63(貨號ZM-04-06,北京中衫金橋公司），CK14(貨號ZA-0540,北京中 衫金橋公司），CgA(貨號ZA-0507,北京中衫金橋公司），Sy(貨號IR660，DAK0公司），CD56(I貨 號R628，DAKO公司）。
[0043]腫瘤細胞免疫組化:待檢測細胞(人食管鱗癌細胞系ZEC-134細胞)提前24小時爬 片于消毒載玻片上，24小時后，用PBS緩沖液沖洗2次，冷丙酮固定15分鐘，浸泡于PBS中備 用。取所需玻片加50yL過氧化物酶阻斷溶液(試劑A)的室溫下孵育10分鐘，PBS緩沖液沖洗3 次，每次3分鐘，除去PBS液，滴加50yL正常非免疫動物血清(試劑B)，室溫下孵育10分鐘；除 去血清，滴加50yL-抗，室溫下孵育60分鐘，PBS沖洗三次，每次3~5分鐘；滴加二抗，室溫下 孵育10分鐘，？1^沖洗三次，每次3分鐘。滴加?〇17口61'(?丨(1&86-&111：；[-1]1〇1186/抑1313；[1：]^6，室 溫下孵育30分鐘，PBS緩沖液沖洗3次，每次2分鐘。稀釋配制DAB溶液，顯色5~10分鐘，鏡下 觀察。清水沖洗，蘇木素復染，常規(guī)脫水，透明、封片。
[0044] 結(jié)果如圖5所示，人食管鱗癌細胞系ZEC-134細胞呈CK5/6陽性，CK14陽性，p63陽 性，CgA陰性，Sy陰性和CD56陰性。細胞免疫組織化學結(jié)果均說明人食管鱗癌細胞系ZEC-134 是鱗癌來源的。
[0045] 實施例7
[0046]取生長狀態(tài)良好的人食管鱗癌細胞系ZEC-134細胞，經(jīng)胰酶消化后制成細胞懸液， 并計數(shù)。將細胞懸液以500,1500,4500個細胞每孔接種于6孔板中。將6孔板置于培養(yǎng)箱中， 靜置培養(yǎng)2周，每周換液2次。2周后，棄去細胞培養(yǎng)液，用PBS漂洗后，無水甲醇固定lOmin，然 后用0.1%結(jié)晶紫染色lOmin，洗去染色液，室溫干燥，并拍照記錄。如圖6所示，人食管鱗癌 細胞系ZEC-134細胞的克隆形成率與接種密度有關(guān)系，接種密度為4500個細胞時的細胞克 隆形成能力較強。
[0047] 實施例8
[0048]取生長狀態(tài)良好的人食管鱗癌細胞系ZEC-134細胞，經(jīng)胰酶消化后制成細胞懸液， 并計數(shù)。將細胞懸液以1000萬個細胞分別接種到5只裸鼠（裸小鼠）腋下，連續(xù)觀察。試驗結(jié) 果如圖7所示，接種后2周后可觸及到腫塊，隨時間的增加，腫塊增大。
【主權(quán)項】
1. 食管癌細胞系，其特征在于，命名為人食管鱗癌細胞系ZEC-134,保藏號為：CCTCC N0：C2016108〇2. 如權(quán)利要求1所述的食管癌細胞系的子代細胞。3. 如權(quán)利要求1所述的食管癌細胞系在作為食管癌發(fā)生機理研究的細胞模型中的應 用。4. 如權(quán)利要求1所述的食管癌細胞系在建立哺乳動物食管癌模型中的應用。5. 如權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于，所述的哺乳動物為裸小鼠或裸大鼠。6. 如權(quán)利要求1所述的食管癌細胞系在提取食管癌特異性腫瘤標志物中的應用。7. 如權(quán)利要求1所述的食管癌細胞系在篩選或評估治療食管癌藥物中的應用。8. 如權(quán)利要求1所述的食管癌細胞系在開發(fā)食管癌檢測試劑盒中的應用。
【文檔編號】C12N5/09GK105969734SQ201610593841
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月22日
【發(fā)明人】蘇丹, 熊磊, 毛偉敏, 裘國勤, 應莉莎, 謝正華, 吳軍舟
【申請人】浙江省腫瘤醫(yī)院, 埃提斯生物技術(shù)（上海）有限公司