用于精子分選的系統(tǒng)和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于分選精子的系統(tǒng)和方法。所述系統(tǒng)包括殼體和由殼體支撐的微流體系統(tǒng)。所述系統(tǒng)還包括入口和出口，所述入口提供通往微流體系統(tǒng)的路徑以將精子輸送至微流體系統(tǒng)，所述出口提供通往微流體系統(tǒng)的路徑以從微流體系統(tǒng)收集被分選的精子。所述微流體系統(tǒng)提供精子從入口到出口的流通通路，且包括至少一個(gè)從入口延伸至出口的通道，以使通過(guò)入口被輸送至微流體系統(tǒng)的精子沿著流通通路向出口流動(dòng)。所述微流體系統(tǒng)還包括過(guò)濾器，所述過(guò)濾器包含第一多微孔且設(shè)置在入口和出口之間的流通通路中，以使沿著流通通路轉(zhuǎn)移的精子移動(dòng)穿過(guò)過(guò)濾器并克服重力以到達(dá)出口。
【專利說(shuō)明】用于精子分選的系統(tǒng)和方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本發(fā)明基于2013年11月20日提交且標(biāo)題為"SYSTEM AND METHOD FOR SPERM S0RTING(用于精子分選的系統(tǒng)和方法)"的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/906，740并要求其優(yōu)先權(quán)，其 通過(guò)引用全文納入本文用于所有目的。
[0003] 關(guān)于聯(lián)邦資助研究/開(kāi)發(fā)的聲明
[0004] 不適用
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 本發(fā)明一般涉及用于精子分選的系統(tǒng)和方法。
[0007] 根據(jù)估計(jì)，全世界有7000萬(wàn)以上的不孕夫婦。每4對(duì)不孕夫婦中大約有1對(duì)尋求臨 床治療，其中，根據(jù)數(shù)據(jù)來(lái)源，不孕病例中大約50%可能是由男性因素導(dǎo)致的。在生殖臨床 上通常采用輔助生育技術(shù)(ARTs)來(lái)治療不孕夫婦，所述輔助生育技術(shù)例如有體外受精 (IVF)、卵細(xì)胞胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)和宮腔內(nèi)人工授精（IUI)。隨著由環(huán)境和生理環(huán)境 導(dǎo)致的男性不育的概率的增加，在生殖臨床上存在不斷增長(zhǎng)的使用ARTs的需求。對(duì)最具活 動(dòng)力且形態(tài)正常的精子進(jìn)行分離是常用的IVF/ICSI方法的不可或缺的步驟。從未經(jīng)處理的 精液(儲(chǔ)備精子）中選擇健康的精子是重要的，原因在于其需要選擇的精子不僅是高度活動(dòng) 的，而且具有正常形態(tài)，成熟的核，并具有較少的反應(yīng)性氧物質(zhì)（R0S)產(chǎn)生。盡管目前IVF/ ICSI操作帶來(lái)大約50%的成功受孕，但是如果選擇的精子異常，則結(jié)果可受到顯著的損害。
[0008] 目前，更廣為人知的ART技術(shù)采用基于離心的精子上游（swim-up)、密度梯度分離 方法，以及基于微流體的方法，使用/不使用化學(xué)趨向性來(lái)分選精子。這些技術(shù)在如同IVF/ ICSI那樣精密的方法的使用中時(shí)存在潛在的缺陷和限制。值得注意的是基于離心的精子分 選技術(shù)(例如上游），在重復(fù)的離心步驟中會(huì)犧牲精子質(zhì)量。精子樣品質(zhì)量在上游技術(shù)過(guò)程 中會(huì)由于R0S的產(chǎn)生而下降。暴露于R0S能極大地?fù)p害看似活動(dòng)且健康的精子的DNA。進(jìn)一 步，基于離心的精子分選技術(shù)是勞動(dòng)密集型的，且結(jié)果會(huì)隨著技術(shù)員的變化而變化。
[0009] 基于微流體的精子分選技術(shù)具有優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槠淠軌蚓_地對(duì)小體積的精子樣品進(jìn) 行操作。另一方面，基于微流體的精子分選裝置具有極低的處理量，且僅能處理少量的精液 (例如2μ1-50μ1)，這限制了它們?cè)谏撑R床上的應(yīng)用，其中正常精子樣品的體積可為1.5ml 以上。
[0010] 在臨床ICSI操作中，胚胎學(xué)家平均需要20個(gè)卵母細(xì)胞，能夠在四個(gè)皮氏培養(yǎng)皿進(jìn) 行操作，且需要20個(gè)精子。胚胎學(xué)家希望在少精子癥樣品中從數(shù)百個(gè)精子中選擇這20個(gè)精 子。這種情形下會(huì)需要對(duì)單個(gè)精子進(jìn)行即時(shí)監(jiān)控，并在20個(gè)精子到達(dá)出口時(shí)從出口對(duì)精子 進(jìn)行收集，這在使用現(xiàn)有臨床或微流體技術(shù)時(shí)是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。在第二種操作中，胚胎學(xué)家操 作健康的樣品，使用懸浮在5_20μ1懸液中的將會(huì)導(dǎo)入卵母細(xì)胞的50萬(wàn)個(gè)健康的精子實(shí)施體 外受精。然而，如上所述的現(xiàn)有分選系統(tǒng)不能提供滿足這些標(biāo)準(zhǔn)所需的處理量。
[0011] 以往，使用光學(xué)顯微鏡對(duì)精子進(jìn)行成像以用于計(jì)算機(jī)輔助精子分析(CASA)和用于 ARTs的精子活動(dòng)力的人工鑒定。該傳統(tǒng)的方法由于其視野(field of view，F(xiàn)0V)小而在同 時(shí)追蹤大量精子的情況中存在限制。另外，精子追蹤和活動(dòng)力分析在分選之后實(shí)施。目前不 存在能夠同時(shí)分選和分析精子的系統(tǒng)。
[0012] 因此需要提供用于處理(包括例如分選)精子的系統(tǒng)和方法，所述系統(tǒng)和方法不損 傷精子或?qū)⒕又糜跐撛趽p傷環(huán)境。進(jìn)一步，需要提供能夠分析精子但是高效且能夠規(guī)模 化(scale)的系統(tǒng)和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明通過(guò)提供系統(tǒng)和方法來(lái)克服上述的缺陷，所述系統(tǒng)和方法整合微流體和宏 流體(macro-fluidics)，以高效選擇有利地適合受精的精子的方式對(duì)精子進(jìn)行分選。具體 而言，本發(fā)明認(rèn)識(shí)到最需要的是適于受精的精子，且能夠使用本發(fā)明的系統(tǒng)以及與受精過(guò) 程中相似的環(huán)境來(lái)對(duì)所述精子進(jìn)行選擇和分選。對(duì)此，提供一種系統(tǒng)，其中大型貯藏室通過(guò) 微孔連接以模擬女性生殖道。提供一種系統(tǒng)和方法，從而最具活動(dòng)力、形態(tài)正常、成熟和功 能性的精子克服重力選擇性地穿過(guò)微孔，留下死亡或功能性較弱的精子。本發(fā)明是無(wú)化學(xué) 品、不使用離心和液流的技術(shù)，其中以高回收率從未經(jīng)處理的精液樣品中分離功能性精子。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供用于分選精子的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括殼體以及由殼 體支撐的微流體系統(tǒng)。所述系統(tǒng)還包括入口和出口，所述入口在微流體系統(tǒng)中提供路徑以 將精子輸送至微流體系統(tǒng)，所述出口提供通往微流體系統(tǒng)的路徑以從微流體系統(tǒng)收集被分 選的精子。所述微流體系統(tǒng)提供精子從入口到出口的流通通路，且包括至少一個(gè)從入口延 伸至出口的通道，以使通過(guò)入口被輸送至微流體系統(tǒng)的精子沿著流通通路向出口流動(dòng)。所 述微流體系統(tǒng)還包括過(guò)濾器，所述過(guò)濾器包含多個(gè)微孔，且設(shè)置在入口和出口之間的流通 通路中，以使沿著流通通路運(yùn)行的精子移動(dòng)穿過(guò)過(guò)濾器并克服重力而到達(dá)出口。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，公開(kāi)了用于分選精子的方法，所述方法包括:將精子樣 品輸送至與微流體系統(tǒng)連接的入口；使精子樣品中的精子沿流通通路運(yùn)行穿過(guò)微流體系統(tǒng) 朝向出口，所述出口提供通往微流體系統(tǒng)的路徑以從微流體系統(tǒng)收集被分選的精子。所述 方法還包括:在到達(dá)出口之前利用具有多個(gè)微孔的過(guò)濾器以及重力對(duì)精子進(jìn)行過(guò)濾，以限 制精子移動(dòng)穿過(guò)所述過(guò)濾器。所述方法進(jìn)一步包括：穿過(guò)所述過(guò)濾器并克服重力之后對(duì)運(yùn) 行至所述出口的精子進(jìn)行收集。
[0016] 通過(guò)以下描述可以清楚地了解本發(fā)明的上述和其他方面和優(yōu)勢(shì)。在以下說(shuō)明書(shū) 中，參照構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分的附圖，其中以說(shuō)明性方式顯示了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。這 類實(shí)施方式不必然代表本發(fā)明的全部范圍，而是因此對(duì)權(quán)利要求進(jìn)行說(shuō)明并在本文中解釋 本發(fā)明的范圍。
[0017] 附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0018] 圖1A是根據(jù)本發(fā)明的精子分選系統(tǒng)的俯視圖。
[0019] 圖1B是圖1A所示系統(tǒng)的截面視圖。
[0020] 圖1C是具有收集腔室以濃縮被分選的精子的多通道系統(tǒng)的示意圖。
[0021] 圖1D是具有收集/濃縮腔室以及與入口連接的多通道的多空腔系統(tǒng)的示意圖。 [0022]圖2A是根據(jù)本發(fā)明的精子分選和成像系統(tǒng)的剖視截面視圖。
[0023]圖2B是圖1A或2A所示微流體系統(tǒng)的詳細(xì)透視圖。
[0024]圖2C是根據(jù)本發(fā)明的多通道微流體系統(tǒng)的示意圖。
[0025]圖2D是根據(jù)本發(fā)明的精子分選和成像系統(tǒng)的系統(tǒng)整體的截面視圖。
[0026] 圖3是根據(jù)本發(fā)明的用于精子分選的原型系統(tǒng)的透視圖。
[0027] 圖4是使用本發(fā)明而獲得的一系列精子的圖像。
[0028] 圖5A是說(shuō)明使用不同孔徑的過(guò)濾器并在不同時(shí)間點(diǎn)回收的人類精子的活性的圖。
[0029] 圖5B是說(shuō)明使用不同芯片的被分選精子的回收率的圖。
[0030] 圖6A、6B和6C分別是說(shuō)明使用3、5和8μπι的麗SS芯片的儲(chǔ)備精子和分選精子的曲線 速度(VCL)、直線速度(VSL)和平均通路速度(VAP)的圖。
[0031] 圖7是顯示儲(chǔ)備精子和分選精子的正常形態(tài)（％ )的圖。
[0032] 圖8是顯示計(jì)算出的儲(chǔ)備精子和分選精子的成熟精子百分比的圖。
[0033]圖9Α是顯示使用3、5和8μπι過(guò)濾器裝置分選的精子的圖，其與上游方法和洗滌方法 比較，呈現(xiàn)了顯著更少的R0S產(chǎn)生。
[0034]圖9B-9G是反應(yīng)性氧物質(zhì)(R0S)產(chǎn)生的圖，其中分別如下：（Β)精液樣品，（C)洗滌過(guò) 的精子、（D)使用上游方法分選的精子(R0S區(qū)域用圓標(biāo)出）、（Ε)使用3μπι的MMSS芯片分選的 精子、（F)使用5μπι的麗SS芯片分選的精子，以及(G)使用8μπι的麗SS芯片分選的精子。
[0035]圖10Α是顯示使用5和8μπι的MMSS芯片分選的精子的圖，其與上游和未分選的精液 樣品相比，呈現(xiàn)了顯著更少的DNA片段化。
[0036] 圖10B-10F是DNA片段化散點(diǎn)圖，其中分別如下：（Β)精液樣品，（C)使用上游方法分 選的精子、（D)使用3μπι的麗SS芯片分選的精子、（Ε)使用5μπι的麗SS芯片分選的精子，以及 (F)使用8μπι的MMSS芯片分選的精子。
[0037] 圖11是列出了根據(jù)本發(fā)明的一些步驟的一個(gè)示例的流程圖。
[0038] 發(fā)明詳述
[0039] 本發(fā)明認(rèn)識(shí)到，陰道粘液變?yōu)樗疇畈⑿纬晌⑿〉奈⑼ǖ?，所述微通道幫助將精?引導(dǎo)至卵子。本發(fā)明認(rèn)識(shí)到排空是分選精子的機(jī)理，并使用粗粒度多尺度模擬已從實(shí)驗(yàn)上 和理論上說(shuō)明了利用排空來(lái)對(duì)健康的精子進(jìn)行分選。具體地，本發(fā)明提供宏-微流體精子分 選(MMSS)系統(tǒng)以高效、可靠并成功地對(duì)精子進(jìn)行分選。如所要闡述的，健康的活動(dòng)精子在分 選后于出口被完整收集。該系統(tǒng)以最小的干擾提高精子選擇過(guò)程的效率，從而抑制DNA片段 化、碎片的累積以及R0S的產(chǎn)生。
[0040] 另外，本發(fā)明可同時(shí)分選、監(jiān)控和評(píng)價(jià)精子。特別地，本發(fā)明的系統(tǒng)能夠獨(dú)立地評(píng) 價(jià)各個(gè)精子，例如，基于速度響應(yīng)，使用寬視野(F0V)無(wú)透鏡成像技術(shù)。所述系統(tǒng)提供利用陰 影成像的基于微芯片的寬-F0V的無(wú)透鏡技術(shù)。另外，本發(fā)明能夠用于收集形態(tài)度量學(xué)信息， 它是男性能育性的可靠指標(biāo)。
[0041] 參照?qǐng)D1A說(shuō)明了精子分選系統(tǒng)10。系統(tǒng)10可基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)、基于聚 甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或其它微流體系統(tǒng)。系統(tǒng)10包括殼體12和收集腔室16,所述殼體具 有入口 14,所述收集腔室中設(shè)置有過(guò)濾器18。過(guò)濾器18可以是聚碳酸酯過(guò)濾器或其他具有 合適材料性質(zhì)的過(guò)濾器，所述性質(zhì)例如有將要描述的孔或通道尺寸。根據(jù)圖1B，入口 14和收 集腔室16通過(guò)沿著微流體芯片22延伸的通道或流通通路20被連接。如將要描述的，微流體 芯片22可包括微芯片，所述微芯片可以是一次性的并操作未經(jīng)處理的精液樣品（新鮮或冷 凍的，處理過(guò)的或未處理的），例如l〇yl-3ml的精液樣品，并且快速分選精子(例如少于30分 鐘)而不需要復(fù)雜的儀器或受過(guò)培訓(xùn)的操作人員。
[0042]流通通路20從入口 14延伸至收集腔室16。在收集腔室16中，第一或底部腔室24位 于靠近微流體芯片22的位置，第二或頂部腔室26在第一或底部腔室24上方，位于微流體芯 片22的遠(yuǎn)端位置。如上所述，設(shè)計(jì)第一腔室24以收集入口 14處的樣品精液(新鮮或冷凍的， 處理的或未處理的），設(shè)計(jì)第二腔室26以過(guò)濾活動(dòng)精子。
[0043]參照?qǐng)D1C，可對(duì)上述圖1B的系統(tǒng)進(jìn)行修改，以包括額外的收集或"濃縮"腔室25,所 述腔室25通過(guò)流體連接件27與頂部腔室連接。即，在這種情況下，可在收集腔室25中對(duì)精子 進(jìn)行濃縮，以更容易地收集精子。
[0044]在另一種配置中，如圖1D所示，收集腔室25可與多個(gè)通道28連通，所述通道各自具 有與濃縮腔室25相對(duì)的入口 29。這種情況下，來(lái)自圖1C中多個(gè)流通通路20或來(lái)自多個(gè)收集 腔室16的精子可被輸送至公用的濃縮腔室25。上述設(shè)計(jì)中的這種變化可有助于使用多個(gè)過(guò) 濾器和多個(gè)通道，以操作更大體積或更高處理量的應(yīng)用。
[0045] 參照?qǐng)D2A，說(shuō)明了系統(tǒng)10的一種選擇性配置的剖視圖，所述系統(tǒng)10包括整合的成 像系統(tǒng)。所述成像系統(tǒng)可形成無(wú)透鏡的寬視野成像平臺(tái)。在該視角中，整合的成像系統(tǒng)的組 件，例如光源30、成像傳感器31、玻璃保護(hù)層32與上述系統(tǒng)10結(jié)合。在運(yùn)行過(guò)程中，光源30照 亮精子34,所述精子通過(guò)入口 14導(dǎo)入微流體芯片22。被照亮的精子34可通過(guò)成像傳感器31 進(jìn)行成像，所述成像傳感器可以是電荷耦合裝置(CCD)、互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(CMOS)或其 他成像裝置。更具體而言，根據(jù)圖2,在運(yùn)行過(guò)程中，可使用例如移液管36將精子和精液34導(dǎo) 入出口 14。精子沿著微流體芯片22穿過(guò)介質(zhì)38,所述微流體芯片可包括前述的玻璃32和 PMMA或其他材料層40,以及設(shè)置在兩者之間的雙面粘性(DSA)層42,以將玻璃32和PMMA層40 粘附在一起。最終，精子34穿過(guò)微流體芯片22到達(dá)出口 16,其中可發(fā)現(xiàn)礦物油44。具體而言， 可將一層薄的無(wú)菌、胚胎測(cè)試過(guò)的礦物油置于入口 14和出口 16中的介質(zhì)38的頂部，以避免 介質(zhì)的蒸發(fā)。
[0046] 如所述，可使用或選擇不同的通道長(zhǎng)度以有效地分選精子。進(jìn)一步，根據(jù)圖2C，可 采用多通道設(shè)計(jì)，其中入口 14和收集腔室16通過(guò)多通道46連接。如所述，可包括PBS收集緩 沖液48，以用于例如洗滌。進(jìn)一步，容納通道的芯片基板可以是一次性的。
[0047]根據(jù)圖2A和2B，如果包括無(wú)透鏡成像，則其可用于將各個(gè)單獨(dú)精子34的陰影圖像 記錄在光電傳感器陣列板31上。該系統(tǒng)10的目的為檢測(cè)/計(jì)數(shù)細(xì)胞，或以超寬F0V實(shí)時(shí)監(jiān)控 芯片上成百上千個(gè)單獨(dú)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)位置，所述超寬F0V例如是寬度為數(shù)厘米的F0V。該技術(shù) 提供復(fù)雜程度降低和易于微型化的這些特性。
[0048]具有成像能力的系統(tǒng)10的一個(gè)具體示例在圖2D中進(jìn)行說(shuō)明。標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡無(wú)法監(jiān)控 整個(gè)微流體分選芯片并實(shí)時(shí)分析精子?？赏ㄟ^(guò)整合無(wú)透鏡成像技術(shù)來(lái)解決該挑戰(zhàn)，其中使 用微通道提供并行的芯片上的監(jiān)控和精子計(jì)數(shù)。所述設(shè)計(jì)使得該技術(shù)能夠微型化，從而使 其合適用于胚胎學(xué)/臨床實(shí)驗(yàn)室和定點(diǎn)看護(hù)(p〇int-〇f-care)裝置。
[0049]圖2D示例中的系統(tǒng)10包括光源30，其通過(guò)孔隙50 (例如50μπι的孔隙）照入殼體12， 以向微流體芯片22聚集單色光52，如上所述，精子34穿過(guò)所述微流體芯片22。系統(tǒng)10可與計(jì) 算機(jī)系統(tǒng)54、可充電電池或其他電源58耦聯(lián)，所述系統(tǒng)10與所述計(jì)算機(jī)系統(tǒng)54通過(guò)數(shù)據(jù)連 接56連接，所述數(shù)據(jù)連接可以是有線或無(wú)線的，所述系統(tǒng)10與可充電電池或其他電源58通 過(guò)電源連接60連接，以向成像功能提供可操作的功率。
[0050] 在一種配置中，采用厚度為1.5mm的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和厚度為50μπι的雙 面粘性(DSA)膜的組合產(chǎn)生微通道。可使用激光切割器將DSA膜切斷以產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的微通 道，長(zhǎng)度范圍為5mm-40mm。入口和出口的端口延伸穿過(guò)PMMA，直徑分別為Ο · 65mm和2mm。然后 直接將DSA膜置于PMMA上，以將兩者有效結(jié)合。將玻璃載片置于DSA膜的另一面，從而通道的 高度取決于粘性層的厚度。特別設(shè)計(jì)更大的出口尺寸是為了能夠容易地用移液管將分選的 精子從通道容易地抽取而出。通道的長(zhǎng)度取決于入口和出口之間的距離。通道的長(zhǎng)度定義 為入口和出口之間的距離。
[0051]為了增加出口處的活動(dòng)細(xì)胞和用于高容量處理的細(xì)胞的百分比，可將聚碳酸酯過(guò) 濾器整合入這些微芯片。該基于過(guò)濾器的裝置可通過(guò)下述方式進(jìn)行設(shè)計(jì):使用3mm厚的PMMA 并切成50mm X 30mm的面積大小，將另一個(gè)切成30mm X 30mm的面積大小。直徑20mm的圓柱可 被切成這兩種PMMA組件，并可使用150μηι的DSA相互之間縱向?qū)R。在1 Omm的距離處，0.6mm 的精液注射入口也被切為更大的裝置組件?？墒褂梦挥趦蓚€(gè)PMMA組件之間的沃特曼核孔 (whatman nucleopore)過(guò)濾器組裝該系統(tǒng)。
[0052]參照?qǐng)D1A-2D，系統(tǒng)10能夠用于大規(guī)模的精液處理。照此，通過(guò)入口 14將精子34導(dǎo) 入，之后將置于微流體芯片22中。在該移動(dòng)過(guò)程中，可使用光源30和成像傳感器31對(duì)精子34 進(jìn)行成像。精子34朝向出口 16移動(dòng)。該出口 /收集腔室具有兩個(gè)腔室24和26。第一腔室24包 括一個(gè)具有微孔的過(guò)濾器，第二腔室26包括另一個(gè)具有微孔的過(guò)濾器。對(duì)此，系統(tǒng)10具有大 型貯藏室14和16，它們通過(guò)微孔連接以模擬女性生殖道。其中，精子34之間產(chǎn)生自然的相互 影響，整體沿著介質(zhì)38向出口 16移動(dòng)。最具活動(dòng)力、形態(tài)正常、成熟和功能性的精子克服重 力選擇性地穿過(guò)微孔，在第一腔室24中留下死亡或功能性較弱的精子。即，精子頭部是球形 的且尺寸約為3μπι χ4.5μπι。精子尾部長(zhǎng)度約為45-50μπι。如果微孔直徑大于精子頭部的過(guò)濾 器位于第一腔室24和第二腔室26,則僅有活動(dòng)的精子可穿過(guò)微孔，但是死亡的、垂死的或損 傷的精子由于它們長(zhǎng)的尾部而不能穿過(guò)微孔。這些死亡、垂死和/或損傷的精子受制于重力 并停留在第一腔室24中。
[0053]從而，提供基于微芯片的系統(tǒng)，將其設(shè)計(jì)成不需要任何離心步驟而回收健康、活動(dòng) 的且形態(tài)正常的精子的形式，且具有最少的R0S產(chǎn)生。該裝置設(shè)計(jì)使得精子分選步驟更為廉 價(jià)且不再勞動(dòng)力密集。該系統(tǒng)組合利用了空間受限的通道中的排空作為精子分選的機(jī)理。 該系統(tǒng)可將活動(dòng)且形態(tài)正常的精子分離而不需要任何離心步驟。從而，精子活動(dòng)力的現(xiàn)有 粗粒度模型用于在三個(gè)維度上模擬基于過(guò)濾器的微流體裝置，帶來(lái)如下效果:其協(xié)同產(chǎn)生 自精子、通道壁、以及過(guò)濾器表面和孔洞之間的流體動(dòng)力學(xué)相互作用。該模型允許使得能夠 設(shè)計(jì)裝置參數(shù)，例如微孔尺寸和培養(yǎng)時(shí)間。
[0054] 上述系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和操作可進(jìn)一步根據(jù)下述的對(duì)系統(tǒng)的示例、這種系統(tǒng)的配置以及 這種系統(tǒng)的測(cè)試結(jié)果的討論來(lái)進(jìn)行理解。這僅僅是一種示例，且在本質(zhì)上不限制可采用的 以及落入本發(fā)明范圍的多種配置、設(shè)計(jì)以及操作。 實(shí)施例
[0055] MMSS芯片的組裝
[0056]使用激光切割器（亞利桑那州斯科茨代爾的維薩激*TM( Versa Laser?， Scottsdale，AZ))將聚甲基丙稀酸甲酯（PMMA，3mm厚；佐治亞州亞特蘭大的MMC公司 (McMaster Carr，At lanta，GA))和雙面粘附劑（DSA，120μηι厚，明尼蘇達(dá)州圣保羅市 (St.Paul，ΜΝ))切割。芯片的設(shè)計(jì)在Coral Draw4上進(jìn)行，在USLE Engrave軟件上實(shí)施以進(jìn) 行切割。MMSS芯片的主要組件包括一個(gè)3mm的面積為50mm x30mm的PMMA切片(底部腔室）和 另一個(gè)面積為30mm x30mm的切片（頂部腔室）。距離腔室5mm處，還在底部PMMA片材上切出 0.6mm的注射點(diǎn)。直徑20mm的圓柱被切割成兩個(gè)PMMA組件。首先使用DSA將底部PMMA腔室結(jié) 合在玻璃載片上。使用DSA將頂部PMMA腔室與底部腔室對(duì)齊并結(jié)合。在芯片組裝過(guò)程中，將 核孔?"(Nuclepore?)徑跡蝕刻聚碳酸酯膜過(guò)濾器(沃特曼公司(Whatman Ltd)，25mm直徑，3 μηι，5μηι，8μηι)夾入兩個(gè)PMMA腔室之間。從而，認(rèn)為Ιμπι以上且低于ΙΟμηι可以是有利的孔徑范 圍。組裝芯片的透視圖示于圖3。
[0057]使用MMSS芯片進(jìn)行精子分選
[0058]將解凍的、未經(jīng)處理的精液樣品（儲(chǔ)備精子)注射入MMSS芯片的入口，直至其充滿 第一 /底部腔室。將第一 /底部腔室設(shè)計(jì)成能夠容納560μ1精液樣品的形式。試驗(yàn)的另一組 中，注射入MMSS芯片中之前，在人類輸卵管液(HTF)中使用1%牛血清白蛋白（BSA)將儲(chǔ)備精 液樣品稀釋4倍。注射之后，第一 /上部腔室被560μ1的1 % BSA (HTF中）充滿。然后在保溫箱中 以37 °C將芯片保存15、30、45和60分鐘，之后將頂部腔室中的流體收集在艾本德 (eppendorph)管中用于分析。
[0059]濃度和活動(dòng)力分析
[0060] 使用光學(xué)顯微鏡和標(biāo)準(zhǔn)Makler血細(xì)胞計(jì)數(shù)器分析精子樣品的濃度和活動(dòng)力。簡(jiǎn)而 言之，將?μL的精子樣品移取至Makler血細(xì)胞計(jì)數(shù)器，并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的蓋罩將其覆 蓋。熟悉使用點(diǎn)擊計(jì)數(shù)器方法的人員對(duì)精子進(jìn)行至少三次計(jì)數(shù)。認(rèn)為向前移動(dòng)的精子是具 有活動(dòng)力的。
[0061] 存活力分析
[0062] 使用UVE/DEAD?精子存活力試劑盒(L-7011，分子探針(MolecularProbes⑧）） 對(duì)精子樣品的存活力進(jìn)行分析。使用SYBR 14染料對(duì)存活精子進(jìn)行染色，使用碘化丙啶(PI) 對(duì)死亡精子進(jìn)行染色。根據(jù)生產(chǎn)商的規(guī)程對(duì)樣品進(jìn)行染色。簡(jiǎn)而言之，首先將SYBR 14染料 加入精子樣品，使最終濃度為l〇〇nM。以37°C將樣品保存5分鐘。為了將死亡精子染色，將PI 染料加入樣品，使最終濃度為1〇μΜ，并額外保存5分鐘。將精子樣品涂抹在玻璃蓋玻片上，使 用Zeiss Axio Observer.Ζ1熒光顯微鏡進(jìn)行成像。分別對(duì)SYBR 14和ΡΙ使用綠色和紅色發(fā) 射濾光片。
[0063] 速度測(cè)量
[0064] 使用用于精子分析的WHO實(shí)驗(yàn)室指南所描述的方法對(duì)精子樣品進(jìn)行了分析。簡(jiǎn)而 言之，在30分鐘后從MMSS芯片（3μπι，5μπι，8μπι)回收精子。通過(guò)如下方式制備了載片：在玻璃 載片上放置6μ1的精子樣品，并使用18Χ 18mm的蓋片覆蓋樣品，使樣品的厚度為20.7μπι。為 避免樣品的干燥，載片是分批制作的，而不是同時(shí)制作的。使用光學(xué)顯微鏡以20 X的倍率 (Carl Zeiss)對(duì)各個(gè)載片進(jìn)行分析，樣品的實(shí)時(shí)圖像被投影在計(jì)算機(jī)顯示器上。使用視頻 抓取軟件（31^81七，1^(^51^〖11公司），在隨機(jī)位置對(duì)精子樣品的運(yùn)動(dòng)抓取5秒。使用 Videotojpeg軟件以lOOfps的幀率將視頻轉(zhuǎn)換為圖像序列。將所述圖像序列輸入ImageJ(國(guó) 立衛(wèi)生研究院（National Institute of Health),http://rsbweb.nih.gov/ij/)用于分 析，使用CASA插件監(jiān)控精子速度參數(shù)，即直線速度(VSL)、曲線速度(VCL)和平均通路速度 (VAP)〇
[0065] 精子形態(tài)評(píng)價(jià)
[0066] 30分鐘后，收集從5μπι和8μπι的MMSS芯片中回收的精子懸液。從3μπι的MMSS芯片中回 收的精子未用于分析精子形態(tài)，因?yàn)榫訚舛冗^(guò)低而不能用于形態(tài)分析。取i〇yL的精子懸 液并置于清潔和消毒過(guò)的顯微鏡載片上，制備了薄涂片。在空氣中將涂片干燥以固定。之后 使用與FertiPro類似的Spermac染色規(guī)程對(duì)精子進(jìn)行染色，以進(jìn)行形態(tài)評(píng)價(jià)。簡(jiǎn)而言之，在 Spermac固定液中將干燥的涂片浸沒(méi)至少5分鐘，然后使用DI水進(jìn)行清洗。將染色劑A移取至 載片的一個(gè)邊緣，使其流過(guò)整個(gè)涂片。然后將載片置于平坦的表面，使染色劑浸漬1分鐘。之 后使用DI水將載片洗滌兩次。接著，與染色劑A類似地施用染色劑B，并使之滲透精子1分鐘。 然后使用DI水進(jìn)行一次清洗。最后，將染色劑C移取至涂片上，使其穩(wěn)定1分鐘，然后使用DI 水進(jìn)行清洗。此時(shí)，使用油浸和100X物鏡對(duì)至少100個(gè)精子進(jìn)行了成像(N(重復(fù)次數(shù)）=3)。 如果精子落入WHO形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)(頭部:球形頭部;頂體覆蓋40-70 %的頭部面積;頭部長(zhǎng)度3.7- 4.7μπι;頭部寬度2.5-3.2μπι;長(zhǎng)寬比1.3-1.8; 2個(gè)以下的小液泡;頂體后部區(qū)域不應(yīng)包含任 何液泡。中段：中段無(wú)殘留細(xì)胞質(zhì)；中段長(zhǎng)度應(yīng)當(dāng)與頭部長(zhǎng)度大致相同；無(wú)斷裂的頸部。主 段:無(wú)表明尾部折斷的尖銳的角或彎曲；薄于中段，主段長(zhǎng)度應(yīng)當(dāng)為頭部長(zhǎng)度的大約10倍）， 則認(rèn)為精子是形態(tài)正常的。
[0067]精子成熟度評(píng)價(jià)
[0068] 30分鐘后，收集從5μπι和8μπι的MMSS芯片中回收的精子懸液。從3μπι的MMSS芯片中回 收的精子未用于核成熟度分析，因?yàn)榫訚舛冗^(guò)低而不能用于該分析。在Spermac固定液中 將干燥的涂片固定5分鐘，然后用DI水清洗。制備了 5 %苯胺藍(lán)(4 %乙酸溶液中）并傾倒在涂 片上。在染色溶液中將涂片浸漬5分鐘，然后用DI水清洗。使用油浸100 X物鏡對(duì)至少100個(gè) 精子進(jìn)行評(píng)價(jià)(N(重復(fù)次數(shù)）=3)。頭部被染成深藍(lán)色的精子被認(rèn)定為不成熟的，未被染色 的精子則被認(rèn)定為成熟的。
[0069] R0S 檢測(cè)
[0070] 精子清洗:從冷凍保存箱中取出1ml的精液，在37 °C的暖浴中解凍15分鐘。通過(guò)下 述方式制備了清洗的精液樣品：在lml的精液中加入9ml的HTF+1 %BSA介質(zhì)，以500Xg離心5 分鐘并移除上清液，同時(shí)將精子微粒留在試管底部。將該步驟重復(fù)三次。將HTF介質(zhì)加入精 子微粒，對(duì)樣品染色進(jìn)行R0S研究。
[0071] 上游方法:從冷凍保存箱中取出1ml的精液，在37 °C的暖浴中解凍15分鐘。使用9ml 的HTF+1%BSA對(duì)精液進(jìn)行稀釋。然后，以500Xg對(duì)稀釋的精子懸液離心5分鐘。之后，移除上 清液并丟棄。通過(guò)以500Xg離心樣品5分鐘的方式再次對(duì)剩余的微粒進(jìn)行清洗。再次移除上 清液并丟棄。最后，沿著離心管的側(cè)壁添加500yL的介質(zhì)，同時(shí)避免破壞微粒。然后將樣品置 于保溫箱中，用30分鐘使活動(dòng)精子向上游出微粒。將微粒留下，收集了活動(dòng)精子。將MMSS芯 片保溫30分鐘，回收精子懸液用于R0S研究。
[0072] 染色以進(jìn)行R0S檢測(cè):使用流式細(xì)胞術(shù)和兩種熒光染料(二氫乙啡啶(DHE)和SYT0X 綠)對(duì)R0S產(chǎn)生進(jìn)行了檢查。DHE與超氧陰離子反應(yīng)并產(chǎn)生兩種熒光物質(zhì)，所述熒光物質(zhì)與精 子DNA結(jié)合并產(chǎn)生紅色熒光。同時(shí)SYT0X綠指示細(xì)胞存活力，當(dāng)細(xì)胞死亡時(shí)其產(chǎn)生綠色熒光。 針對(duì)該試驗(yàn)，制備了四組對(duì)照樣品，其均由200yL的回收精子懸液和20yL的過(guò)氧化氫混合而 成。隨后以37°C的溫度保存30分鐘。將染料加入樣品；陰性對(duì)照中不添加染料，在第二樣品 中加入5μΜ的DHE，在第三樣品中加入50nM的SYT0X綠，第四樣品中含有5μΜ的DHE和50nM的 SYT0X。將染料保存15分鐘，然后在測(cè)試樣品15分鐘之前轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞儀。在試驗(yàn)中使用 FACSCalibur流式細(xì)胞儀（加利福尼亞州圣何塞的BD公司（Becton Dickinson, San Jose， CA))。分別對(duì)FL1和FL2使用530/30帶通(綠)和585/42帶通(紅)濾光片，將488nm的氬激光激 發(fā)與發(fā)射測(cè)量結(jié)合。非精子物質(zhì)被排出，且檢查了至少1〇,〇〇〇個(gè)細(xì)胞。作為測(cè)試樣品，從解 凍的精液、上游懸液以及3、5和8μπι過(guò)濾器孔徑芯片收集了 500yL的樣品。將5μΜ的DHE和50nM 的SYT0X分別加入各個(gè)樣品并保存15分鐘。將樣品取至流式細(xì)胞儀用于測(cè)量。
[0073] DNA片段化
[0074]使用TUNEL試驗(yàn)試劑盒（原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒，熒光素，羅氏應(yīng)用科學(xué)公司 (Roche Applied Science))，對(duì)未經(jīng)處理的精液、上游精子、以及從3、5和8μηι孔徑過(guò)濾器微 芯片裝置回收的精子群的DNA片段化進(jìn)行了量化。所有這些樣品均來(lái)自前述的R0S檢測(cè)環(huán) 節(jié)。首先，通過(guò)使用PBS和1%BSA以500Xg離心5分鐘的方式將所有的精子懸液清洗兩次。一 旦進(jìn)行清洗，則精子細(xì)胞的濃度被調(diào)整為2X106細(xì)胞/ml。然后用4%多聚甲醛在PBS(每100 yL的細(xì)胞懸液使用200yL)中以室溫將精子懸液固定30分鐘。用roS和1%BSA以500Xg離心6 分鐘的方式將精子細(xì)胞清洗兩次，并用0.1 %曲通X(〇.l%檸檬酸鈉中）在冰中/上進(jìn)行透 化。將精子清洗兩次，然后用5yL的酶(TdT)溶液和45yL的標(biāo)記(dUTP-熒光素)溶液以37 °C保 存1小時(shí)。類似地制備了陰性和陽(yáng)性對(duì)照樣品。但是，在染色之前，使用DNA酶以37°C將陽(yáng)性 對(duì)照樣品保存40分鐘。在染色過(guò)程中，僅用標(biāo)記溶液(無(wú)酶溶液)保存陰性對(duì)照樣品。在染色 后，使用和1%BSA將樣品清洗兩次，并再次懸浮于PBS中（Muratori等，2000)。使用流式 細(xì)胞儀對(duì)DNA片段化細(xì)胞的熒光發(fā)射進(jìn)行評(píng)價(jià)，并使用FL-1檢測(cè)器(521nm)進(jìn)行檢測(cè)?？偣?得到了5000個(gè)物質(zhì)。將精子群從數(shù)據(jù)中輸出，以消除任何來(lái)自碎片的信號(hào)。試驗(yàn)重復(fù)6次(N =6)〇
[0075]結(jié)果和討論
[0076]為了發(fā)展不需化學(xué)品和離心、高處理量的垂直精子分選裝置，如上所述制作并組 裝了MMSS芯片。簡(jiǎn)而言之，所述芯片是兩腔室芯片，兩個(gè)腔室被具有各種直徑（例如3、5、8μ m)的聚碳酸酯過(guò)濾器分隔。將精子樣品注入底部腔室并從頂部回收腔室收集被分選的活 動(dòng)/健康精子。將過(guò)濾器(例如在兩個(gè)腔室之間具有尺寸均勻的孔)設(shè)計(jì)成大部分活動(dòng)和健 康精子能夠轉(zhuǎn)移通過(guò)過(guò)濾器孔的形式。如圖4所示，用于精子分選的聚碳酸酯過(guò)濾器的掃描 電子顯微鏡(SEM)圖像呈現(xiàn)均勻的孔徑。具有不同微孔徑（υ3μπι，?)5μπι和iii)8ym)的聚碳 酸酯核孔徑跡蝕刻膜過(guò)濾器的SEM圖像。比例尺為ΙΟμπι。這些圖像示出了各種過(guò)濾器孔和精 子的對(duì)比尺寸。
[0077] 精子頭部是球形的且尺寸約為3μπιΧ4.5μπι。精子尾部長(zhǎng)度約為45_50μπι。如果直徑 大于精子頭部的過(guò)濾器位于該兩腔室芯片中，則僅有活動(dòng)的精子可穿過(guò)微孔，但是死亡的/ 垂死的精子由于它們長(zhǎng)的尾部而不能穿過(guò)微孔。
[0078]精子活動(dòng)力和回收率
[0079]為調(diào)查被分選精子的活動(dòng)力，本發(fā)明人分析了從3個(gè)MMSS芯片(3、5和8μπι直徑的過(guò) 濾器芯片）的頂部回收腔室收集的精子。如圖5Α所示，結(jié)果表明，與儲(chǔ)備精子樣品相比，用 MMSS芯片分選的精子呈現(xiàn)了顯著更高的精子活動(dòng)力。具體而言，3、5和8μπι過(guò)濾器芯片的精 子活動(dòng)力分別為95± 10%以上、90.4± 1.8%以上、85.9± 1.5%以上，其顯著高于儲(chǔ)備精子 活動(dòng)力(39 · 8 ± 1 · 9 % )。本發(fā)明人進(jìn)一步考察了保存時(shí)間對(duì)精子活動(dòng)力的影響。在15、30、45 和60分鐘后對(duì)精子進(jìn)行收集。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在更長(zhǎng)的時(shí)間后收集精子樣品時(shí)，回收的精 子的活動(dòng)力增加;60分鐘時(shí)間點(diǎn)處的活動(dòng)力最高，然而15分鐘時(shí)間點(diǎn)處的活動(dòng)力最低，如圖 5A所示。在三種芯片中均觀察到了該活動(dòng)力的增加。在各個(gè)試驗(yàn)的起始階段將HTF+1%BSA 移取至MMSS芯片的頂部腔室時(shí)，會(huì)因兩種液體的混合而在精子樣品中產(chǎn)生輕微的擾動(dòng);儲(chǔ) 備精子樣品和HTF+1%BSA介質(zhì)。該精子樣品中的擾動(dòng)可能是試驗(yàn)起始階段(15分鐘后)的精 子活動(dòng)力比之后的時(shí)間點(diǎn)（30、45和60分鐘后)更低的原因。另外，本發(fā)明人計(jì)算了不同時(shí)間 點(diǎn)的精子回收率，即，從儲(chǔ)備精子中回收的健康精子的百分比（％ )。對(duì)任何精子分選裝置而 言，回收率是重要的參數(shù)，特別是在精子樣品具有低精子密度的數(shù)量的情況下(精子少的試 樣和無(wú)精子的試樣）。麗SS芯片中，在一個(gè)時(shí)間段內(nèi)分析了精子回收率；15、30、45和60分鐘 時(shí)間點(diǎn)在圖5B中進(jìn)行了說(shuō)明。在30分鐘時(shí)間點(diǎn)收集的樣品具有最高的精子回收率(3、5和8μ m的MMSS芯片分別為3.08 ±0.42%、23.75 ± 3.96%和28.58± 2.81 % )。本發(fā)明人將該30分 鐘時(shí)間點(diǎn)稱作飽和時(shí)間點(diǎn)，因?yàn)槿绻麑悠繁４娉^(guò)30分鐘則精子回收率降低，如圖5B所 示。本發(fā)明人相信在30分鐘后一些精子可能穿過(guò)過(guò)濾器而移動(dòng)返回至底部腔室。
[0080] 精子存活力
[0081] 認(rèn)為活動(dòng)的精子是存活的精子。為了證實(shí)分選的精子是存活的，本發(fā)明人對(duì)30分 鐘時(shí)間點(diǎn)分選的精子實(shí)施了存活/死亡染色。分選精子的存活力顯著高于儲(chǔ)備精子樣品； 41.0±0.45%(儲(chǔ)備精子），91.32±3.43%(3以111]\^55芯片），89.83±5.82%(54111]\^55芯 片），91·59±4·44%(3μπι MMSS芯片）。
[0082]樣品稀釋對(duì)精子活動(dòng)力和回收的影響
[0083]為了考察精子樣品稀釋對(duì)活動(dòng)力和回收率的影響，本發(fā)明人在使用MMSS芯片處理 之前，使用HTF+1 %BSA以1:4的比例將儲(chǔ)備精子樣品稀釋。分選精子的活動(dòng)力在四個(gè)時(shí)間點(diǎn) (15、30、45和60分鐘）均顯著高于儲(chǔ)備精子樣品；45.8±1.5%(儲(chǔ)備精子），彡95.0±5.0% (3μπι MMSS芯片），彡93·7±4·7%(5μπι MMSS芯片），彡90·7±2·5%(8μπι MMSS芯片），其與使 用未稀釋精子樣品的情況沒(méi)有區(qū)別，如圖5A所示。然而，如果使用稀釋的精子樣品替代未稀 釋的儲(chǔ)備精子，則精子回收率增加，如圖5B所示。發(fā)現(xiàn)30分鐘時(shí)間點(diǎn)后的8μπι芯片具有最高 的精子回收率，為52.68±4.97%。在稀釋的樣品中，精子在碰到另一個(gè)精子之前的平均自 由程得到增加。該現(xiàn)象可能有助于精子更快地到達(dá)并穿過(guò)過(guò)濾器微孔。第二，過(guò)濾器具有固 定數(shù)量的孔（<14%的孔隙率）。由于稀釋樣品中嘗試通過(guò)過(guò)濾器孔的精子數(shù)量更少，對(duì)各 個(gè)精子而言，發(fā)現(xiàn)空余的孔并轉(zhuǎn)移通過(guò)該孔的可能性更高。
[0084]精子速度分析
[0085]分析了各種精子速度參數(shù)，即曲線速度（VCL)、直線速度（VSL)和平均通路速度 (VAP)。顯示這些速度定義的精子徑跡的代表性圖像示于補(bǔ)充圖3。給出原始精子視頻作為 補(bǔ)充影像1，其中產(chǎn)生有圖3的徑跡。使用MMSS芯片分選的精子呈現(xiàn)了顯著高于儲(chǔ)備精子樣 品的精子速度，如圖6所示。具體而言，平均精子VCL由52.7 ± 6. Ομπι/秒(儲(chǔ)備精子)分別增加 至59 · 9 ± 3 · 5μπι/秒（3μπι的MMSS芯片），75 · 3 ± 3 · Ιμπι/秒（5μπι的MMSS芯片），和75 · 6 ± 4 · 5μπι/ 秒(8μπι的MMSS芯片），如圖6Α所示。平均精子VSL由44 · 4 ± 5 · 6μπι/秒(儲(chǔ)備精子)分別增加至 52 · 1 ± 3 · 5μπι/秒（3μπι的芯片），63 · 4 ± 3 · 5μπι/秒（5μπι的芯片），和64 · 1 ± 3 · 9μπι/秒(8μπι的芯 片），如圖6Β所示。平均精子VAP由48.4± 5.8μπι/秒(儲(chǔ)備精子)分別增加至54.1 ± 3.4μπι/秒 (3μπι的芯片），68 · 0 ± 2 · 9μπι/秒(5μπι的芯片），和67 · 5 ±4 · Ιμπι/秒(8μπι的芯片），如圖6C所示。 更高的精子速度表明分選精子比儲(chǔ)備精子更為健康。當(dāng)本發(fā)明人比較使用三種不同的MMSS 芯片分選的精子的速度時(shí)，發(fā)現(xiàn)使用5和8μπι MMSS芯片分選的精子比使用3μπι過(guò)濾器芯片分 選的精子具有更高的VCL、VSL和VAP速度。這可能是由于大部分未成熟精子的頭部尺寸小于 3微米且能夠穿過(guò)3μηι微孔。這種情況的唯一例外在于，其中2個(gè)或多個(gè)3μηι孔結(jié)合在一起形 成了更大的孔的過(guò)濾器區(qū)域。
[0086]精子形態(tài)分析
[0087]用Spermac染色劑對(duì)精子染色，以進(jìn)行形態(tài)分析?；赪HO定義的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)定精 子的形態(tài)正常。認(rèn)為任何具有>4%的形態(tài)正常精子的精子樣品是正常的。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使 用5μπι的MMSS芯片分選的精子在整體形態(tài)上未提高精子的質(zhì)量，即使分選的精子是活動(dòng)的。 相對(duì)于儲(chǔ)備精子和使用5μπι的MMSS芯片分選的精子，使用8μπι的MMSS芯片分選的精子呈現(xiàn)了 顯著改善的形態(tài)；30·0±7·6%(8μπι MMSS芯片），17·0±3·2%(5μπι MMSS芯片）和 17.6土 〇.5%(儲(chǔ)備精子）。
[0088]精子核成熟度分析
[0089] 使用苯胺藍(lán)將精子染色并用于分析核成熟度。苯胺藍(lán)染色可區(qū)別未成熟精子的富 賴氨酸核以及成熟精子的富精氨酸/半胱氨酸核。未成熟精子的核被苯胺藍(lán)染色并在核與 頂體之間呈現(xiàn)對(duì)比色。被苯胺藍(lán)染色的精子的代表性圖像以及它們的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)示于圖7。使 用5μπι芯片分選的精子相對(duì)于儲(chǔ)備精子在核成熟度方面未呈現(xiàn)任何改進(jìn)。然而，使用8μπι過(guò) 濾器芯片分選的精子呈現(xiàn)比儲(chǔ)備精子樣品更高的核成熟度，如圖8所示;40.8±5.1%(8μπι MMSS芯片），25±4·6%(5μπι MMSS芯片）和26·9±5·8%(儲(chǔ)備精子）。
[0090] R0S產(chǎn)生分析
[0091] 對(duì)分選的精子進(jìn)行R0S產(chǎn)生分析。本發(fā)明人比較了清洗方法、常規(guī)上游方法和MMSS 芯片后的精子中的R0S產(chǎn)生。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，由MMSS芯片分選的精子相比上游和清洗方法產(chǎn) 生明顯更少的R0S (圖9)。精子清洗和上游方法產(chǎn)生分別占精子10.1%±0.3%和10.6%土 1.1 %的R0S，然而使用MMSS芯片分選的精子僅產(chǎn)生占精子0.8% ±0.4% (3ym MMSS芯片）， 0 · 7% ±0 · 1 % (5μπι MMSS芯片）和1 · 0% ±0 · 1 % (8μπι MMSS芯片）的R0S。未分選的精液樣品 產(chǎn)生占精子1.8% ±0.6 %的R0S，其清楚地表明上游方法和清洗方法中增加的R0S產(chǎn)生來(lái)自 離心步驟。
[0092] DNA片段化分析
[0093]精子DNA片段化的分析能夠區(qū)分可育男性和不可育男性，具有更高DNA片段化水平 的精子樣品導(dǎo)致IVF/ICSI中的受精率更低，損害胚胎發(fā)展并降低懷孕率。對(duì)使用MMSS芯片 分選的精子進(jìn)行〇財(cái)片段化分析。0財(cái)片段化（％)為1.1%±0.3%(841111^33)，2.1%± 0.7%(5ym MMSS芯片），3·4%±0·8%(3μπι MMSS芯片），3·7%±1·2%(上游方法)和31.2% ± 1.2% (未分選精液）。使用5μπι和8μπι芯片分選的精子相較于未分選精液樣品和使用上游 方法分選的精子，呈現(xiàn)明顯更低的DNA片段化（％ )(圖10)。
[0094] 討論
[0095]理想的精子分選技術(shù)應(yīng)當(dāng)（i)快速且高性價(jià)比，（i i)勞動(dòng)密集程度更低，（i i i)處 理更大量的精子，（iv)具有更高的回收效率以將活動(dòng)精子與死亡/非活動(dòng)精子分離，（v)分 離具有更快速度的精子，（vi)分離形態(tài)正常和成熟的精子，（vii)通過(guò)略去分離步驟而減少 R0S產(chǎn)生和形態(tài)損傷，（viii)降低精子DNA片段化的百分比。這些參數(shù)在本發(fā)明的任何精子 分選裝置和系統(tǒng)中均為普遍所需的特性，本發(fā)明提供具有這些特性的平臺(tái)。
[0096] 在本文的一個(gè)具體實(shí)施例中，用于制作一枚芯片的材料總成本小于1美元(過(guò)濾器 50美分，PMMA和DSA不到50美分KMMSS芯片迅速(約30分鐘)將活動(dòng)精子與非活動(dòng)精子分離， 相較于上游技術(shù)（<20% )具有更高的回收率(從儲(chǔ)備精子中回收28.58±2.81 %)。通過(guò)使 用稀釋的樣品將回收率進(jìn)一步提高至52.68±4.97% (8μπι過(guò)濾器）。盡管精子稀釋使得健康 精子的回收率更高，但是其降低了能夠一次處理的實(shí)際儲(chǔ)備精子的體積。儲(chǔ)備精子可按需 要進(jìn)行稀釋，然后經(jīng)處理用于（i)低體積射出，和（ii)以極低精子計(jì)數(shù)射出。MMSS芯片設(shè)計(jì) 是高度可擴(kuò)展的，可通過(guò)使用更大的過(guò)濾器來(lái)處理大量的精液(例如多1.5ml)。需要處理大 量的精液樣品以回收足夠的精子用于IVF步驟。進(jìn)一步，高處理容量對(duì)于精子密度低或精子 活動(dòng)力低的樣品而言是非常重要的。
[0097] 具有更高速度參數(shù)的精子能夠增加 ICSI受精率。與儲(chǔ)備精子相比，由MMSS芯片分 選的精子呈現(xiàn)顯著增強(qiáng)的速度參數(shù)(VCL，VSL和VAP)，表明分選的精子具有更高的質(zhì)量。精 子形態(tài)是成功受精的另一個(gè)重要指標(biāo)。形態(tài)正常的精子在IVF步驟中增加受精率。使用8μπι 的MMSS芯片分選精子將精子形態(tài)提高了 1.7倍，這是顯著的提高，如圖7所示。還值得注意的 是精子活動(dòng)力和形態(tài)之間的關(guān)聯(lián)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，形態(tài)正常的精子還呈現(xiàn)更快的速度，其表 明這兩個(gè)功能性參數(shù)(精子速度和形態(tài))之間是相關(guān)的。
[0098]精子核成熟度與男性可育性呈現(xiàn)關(guān)聯(lián)。由核成熟度描述的染色質(zhì)致密性是IVF結(jié) 果的另一個(gè)重要預(yù)測(cè)參數(shù)。使用8μπι的MMSS芯片分選的精子呈現(xiàn)了顯著高于儲(chǔ)備樣品的精 子成熟度，如圖8所示。本發(fā)明人還檢查了人類精子的R0S產(chǎn)生。R0S產(chǎn)生是用于評(píng)價(jià)精子質(zhì) 量及其凋亡狀態(tài)的重要考察工具。存在許多導(dǎo)致精子R0S產(chǎn)生的路徑和原因，例如精子形成 過(guò)程中的分化不良、不良的染色質(zhì)緊密度、暴露于重金屬環(huán)境、熱或電磁輻射、延長(zhǎng)的體外 培養(yǎng)、R0S產(chǎn)生細(xì)胞的附近存在精子。常規(guī)技術(shù)采用離心步驟分選健康的精子是R0S產(chǎn)生的 另一個(gè)原因，因?yàn)檫@些技術(shù)離心精子與R0S產(chǎn)生細(xì)胞(例如白細(xì)胞）。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用三種 MMSS芯片分離的精子呈現(xiàn)顯著低于儲(chǔ)備精子的R0S產(chǎn)生。
[0099] DNA片段化是男性可育性的另一個(gè)非常重要的指標(biāo)。根據(jù)一些報(bào)告，精子DNA完整 度可認(rèn)為是受精的一個(gè)獨(dú)立標(biāo)記。與未分選的精液樣品相比，使用MMSS芯片分選的精子呈 現(xiàn)了顯著改善的DNA片段化，如圖10所示。目前，認(rèn)為精子上游方法是以低DNA片段化分選精 子的標(biāo)準(zhǔn)。值得注意的是，使用5μπι和8μπι的麗SS芯片分選的精子呈現(xiàn)比上游方法更低的DNA 片段化。本發(fā)明人認(rèn)為基于這些功能性評(píng)價(jià)，與傳統(tǒng)方法相比，使用8μπι的MMSS芯片分選的 精子具有更好的質(zhì)量。對(duì)形態(tài)正常、成熟、活動(dòng)且功能性的精子進(jìn)行分選可能改善IVF/ICSI 結(jié)果。
[0100] 現(xiàn)在參照?qǐng)D11，提供了用于分選精子的方法的一些示例步驟100。步驟100起始于 進(jìn)程塊102,包括將精子樣品接收至微流體系統(tǒng)的入口，如上所述。之后，在進(jìn)程塊104中，使 樣品中的精子朝向出口穿過(guò)微流體系統(tǒng)中的流通通路，所述出口提供通往微流體系統(tǒng)的路 徑以從微流體系統(tǒng)收集被分選的精子。進(jìn)程塊106中，在精子到達(dá)出口之前將其供于過(guò)濾 器。如所述，過(guò)濾器具有多個(gè)微孔，并以限制精子利用重力運(yùn)動(dòng)穿過(guò)過(guò)濾器的方式進(jìn)行取 向。因此，進(jìn)程塊108中，將被分選的精子供于出口。分選的精子包括:穿過(guò)所述過(guò)濾器并克 服重力而通過(guò)所述出口的精子。
[0101] 因此，本公開(kāi)提供用于以下方面的系統(tǒng)和方法：（i)開(kāi)發(fā)無(wú)化學(xué)品和不需流動(dòng)的系 統(tǒng)以分選健康的精子，分析活動(dòng)力、速度和形態(tài)，（ii)分離被分選的健康精子，以及(iii)發(fā) 展對(duì)精子排空（exhaustion)和整體運(yùn)動(dòng)的更好的理解。該平臺(tái)是優(yōu)于現(xiàn)有臨床方法的創(chuàng) 新，例如上游技術(shù)和微滴技術(shù)。針對(duì)已經(jīng)報(bào)告的基于微流體的精子分選裝置而言，該平臺(tái)也 是新型的，因?yàn)槠涫褂昧碎_(kāi)創(chuàng)性的知識(shí)(空間受限通道中的排空)來(lái)分選和分析精子?？紤] 到臨床生殖醫(yī)學(xué)一直以來(lái)是勞動(dòng)密集型的挑戰(zhàn)性的領(lǐng)域，這種易于使用的微芯片能夠帶來(lái) 改善的健康精子的選擇并減少對(duì)操作技能的依賴，推進(jìn)可重復(fù)的和可靠的操作步驟。
[0102]已通過(guò)一個(gè)或多個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式描述了本發(fā)明，但應(yīng)理解除了明確描述的那些 方案之外，許多等同方案、替代方案、變化方案和修改方案是可能實(shí)現(xiàn)的并在本發(fā)明范圍 內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于分選精子的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括： 殼體； 由殼體支撐的微流體系統(tǒng)； 入口，所述入口提供通往微流體系統(tǒng)的路徑以將精子輸送至微流體系統(tǒng)； 出口，所述出口提供通往微流體系統(tǒng)的路徑以從微流體系統(tǒng)收集被分選的精子； 其中，所述微流體系統(tǒng)提供精子從入口到出口的流通通路，其包括： 至少一個(gè)從入口延伸至出口的通道，以使通過(guò)入口被輸送至微流體系統(tǒng)的精子沿著流 通通路向出口流動(dòng);和 過(guò)濾器，所述過(guò)濾器包含多個(gè)微孔且設(shè)置在流通通路中，以使沿著流通通路運(yùn)行的精 子移動(dòng)穿過(guò)過(guò)濾器并克服重力以到達(dá)出口。2. 如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于，對(duì)所述多個(gè)微孔的尺寸進(jìn)行設(shè)置以使精子頭 部能夠穿過(guò)所述微孔。3. 如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述多個(gè)微孔包括尺寸至少為Imi的微孔。4. 如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述多個(gè)微孔包括尺寸低于IOmi的微孔。5. 如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述多個(gè)微孔包括形狀為球形的微孔。6. 如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述過(guò)濾器包括聚碳酸酯過(guò)濾器。7. 如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于，還包括設(shè)置于出口的收集腔室。8. 如權(quán)利要求7所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述收集腔室包括兩個(gè)子腔室。9. 如權(quán)利要求8所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述過(guò)濾器設(shè)置在兩個(gè)子腔室中的一個(gè)內(nèi)。10. 如權(quán)利要求8所述的系統(tǒng)，其特征在于，對(duì)所述兩個(gè)子腔室中的第一個(gè)進(jìn)行配置以 收集締合有精子的新鮮精液，對(duì)所述兩個(gè)子腔室中的第二個(gè)進(jìn)行配置以使活動(dòng)精子輸送至 出口并限制非活動(dòng)精子。11. 如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于，還包括用于對(duì)流通通路中的精子進(jìn)行成像 的成像系統(tǒng)。12. 如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于，還包括成像系統(tǒng)，所述成像系統(tǒng)包括至少一 個(gè)配置成照亮流通通路中的精子的光源和靠近流通通路配置以對(duì)精子進(jìn)行成像的成像傳 感器。13. 如權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述成像傳感器包括電荷耦合裝置(CCD) 或互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(CMOS)成像傳感器中的至少一種。14. 如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述微流體系統(tǒng)包括聚二甲基硅氧烷 (PDMS)基底或聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)基底中的至少一種。15. 如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述至少一個(gè)通道包括多個(gè)通道，所述多個(gè) 通道具有各自不同的通道長(zhǎng)度。16. -種用于分選精子的方法，所述方法包括： 將精子的樣品輸送至與微流體系統(tǒng)連接的入口； 使精子樣品中的精子沿流通通路運(yùn)行穿過(guò)微流體系統(tǒng)朝向出口，所述出口提供通往微 流體系統(tǒng)的路徑以從微流體系統(tǒng)收集被分選的精子； 在到達(dá)出口之前利用具有微孔的過(guò)濾器以及重力對(duì)精子進(jìn)行過(guò)濾，以限制精子移動(dòng)穿 過(guò)所述過(guò)濾器；以及 穿過(guò)所述過(guò)濾器并克服重力之后對(duì)運(yùn)行至所述出口的精子進(jìn)行收集。17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，還包括:利用所述過(guò)濾器和重力來(lái)限制非 活動(dòng)精子到達(dá)出口。18. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，還包括：利用所述過(guò)濾器、另一個(gè)過(guò)濾器、 和重力來(lái)限制非活動(dòng)精子到達(dá)出口。19. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，還包括:對(duì)微流體系統(tǒng)中的精子進(jìn)行成像。20. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，還包括:使用至少一種光學(xué)成像系統(tǒng)對(duì)微 流體系統(tǒng)中的精子進(jìn)行成像。
【文檔編號(hào)】C12Q1/02GK105960463SQ201480073593
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2014年11月19日
【發(fā)明人】U·德米爾奇, W·阿斯加爾
【申請(qǐng)人】布里格姆女子醫(yī)院有限公司