通過測量代謝的質(zhì)譜法抗藥性測定的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種使用質(zhì)譜法測定微生物對抗生素的抗藥性的方法。通過質(zhì)譜法確定含有抗生素的培養(yǎng)基中微生物引起的具體營養(yǎng)成分的減少或改性，從而確定微生物的代謝。因此，并不是對微生物進(jìn)行質(zhì)譜分析，而是對培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)譜分析。接受質(zhì)譜觀察的特殊營養(yǎng)成分是存在抗生素的培養(yǎng)基中微生物代謝的指示劑，因此也是其敏感性或抗藥性的指示劑。
【專利說明】
通過測量代謝的質(zhì)譜法抗藥性測定
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種使用質(zhì)譜法測定微生物對抗生素的抗藥性的方法。
[0002]定義
[0003]本文使用“道爾頓”，而非法定的“統(tǒng)一的原子質(zhì)量單位”(u)，“道爾頓”在國際計(jì)量局上一版(第八版，2006年)“國際單位制(SI)”文件中添加，與統(tǒng)一的原子質(zhì)量單位處于同等地位。如已經(jīng)注意到的，這樣做主要是為了允許使用千道爾頓和毫道爾頓等類似單位。
[0004]為簡單起見，本中只使用了術(shù)語“肽”，但相關(guān)分子也可稱為蛋白質(zhì)。在現(xiàn)有技術(shù)中，從較輕的肽到較重的蛋白質(zhì)過渡并不固定，沒有明確定義。
[0005]此處使用的術(shù)語微生物(microorganisms)在下文中也稱為細(xì)菌和微生物(microbes)，其是指用顯微鏡下看見的小生物體，例如，包括細(xì)菌、單細(xì)胞真菌(例如酵母菌)、顯微藻類和原生動物等。單數(shù)形式的“微生物”(microorganism)或“微生物” (microbe)用于單個(gè)微生物細(xì)胞以及微生物株系或基因相同微生物細(xì)胞的分離物。復(fù)數(shù)形式的“微生物” (microbes)通常表示待分析的多個(gè)微生物細(xì)胞。
[0006]通常按照一般說法，術(shù)語“抗生素”是指用于治療微生物感染性疾病的藥理學(xué)活性物質(zhì)。
【背景技術(shù)】
[0007]自從首次使用青霉素作為藥理學(xué)抗生素以來，微生物株系對各種抗生素逐漸產(chǎn)生各種抗藥性，或從其他微生物獲得抗藥性，即微生物獲得能夠削弱抗生物質(zhì)的效力，或使其徹底失效的特性。而遺憾的是，與此同時(shí)，抗藥性非常普遍;現(xiàn)在醫(yī)院中的微生物大多具有抗藥性。某些情況下，可以預(yù)測在醫(yī)院內(nèi)傳播的微生物對醫(yī)院常用抗生素的抗藥性，然而，這并不適用于在醫(yī)院外獲得的感染。測定抗藥性的商用方法在含有抗生素的培養(yǎng)基上檢測細(xì)菌生長區(qū)，或檢測含有抗生素的液體培養(yǎng)物中與生長相關(guān)的不透明度變化，這非常耗時(shí)，通常需要一個(gè)工作日以上;但快速測定微生物樣本或微生物分離物抗生素抗藥性卻極其重要?？焖俟庾V測定法正在研發(fā)中。
[0008]專利說明書DE10 2006 021 493 B4(V.M.Govorun和J.Franzen，2006，對應(yīng)于GB2438066 B,US 8,293,496 B2，下文稱為“Govorun”)披露了用于測定微生物抗藥性的質(zhì)譜法，其中，在添加和未添加抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，然后通過質(zhì)譜法測量并比較微生物的蛋白質(zhì)分布曲線。
[0009]特別是為了檢測對β-內(nèi)酰胺酶(青霉素和相關(guān)物質(zhì))的抗藥性，人們已經(jīng)開發(fā)出質(zhì)譜法，這在文件DE 10 2010 023 452 B4(M.Kostrzewa等人)和DE 10 2011 012 060 Al中有所披露。這些方法基于測量位于微生物附近的具體基質(zhì)的分解，這些基質(zhì)與抗生素相似。
[0010]在申請文件EP 13002450.8(K.Sparbier 等人)和 EP 13002699.0(K.Sparbier 和C.Lange)中，描述了測定抗藥性的更多質(zhì)譜測定方法，通過測量存在抗生素時(shí)同位素標(biāo)記營養(yǎng)成分的吸收或微生物量增加實(shí)現(xiàn):吸收同位素標(biāo)記營養(yǎng)成分或生物量增加則表明存在抗藥性。這些方法并不限于具體類型的抗藥性，因此不僅是表明對內(nèi)酰胺酶的抗藥性。因此本文以引用的形式包含這兩份申請文件。這些文獻(xiàn)中還大體介紹了抗藥性的問題并具體介紹了質(zhì)譜法測定抗藥性的問題，還說明了快速抗藥性測定的重要性。
[0011]迄今為止，人們發(fā)現(xiàn)，這兩份申請文件中的方法對不同微生物和不同抗生素均能產(chǎn)生優(yōu)異的結(jié)果;但通常的情況是，目前(還)沒有普遍適用的方法。因此明確需要更多測定抗藥性的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]發(fā)明目的
[0013]本發(fā)明的目的是提供一種質(zhì)譜法和合適的合成培養(yǎng)基，從而能夠以可靠、低成本以及(最重要的)快速的方式測定微生物對一種或多種抗生素的抗藥性。對于生長快速，因而也特別危險(xiǎn)的病原體而言，如果可能，抗藥性的測定應(yīng)低于一小時(shí)。
[0014]發(fā)明簡述
[0015]本發(fā)明提供了一種使用質(zhì)譜法測定微生物對抗生素抗藥性的方法，其中，所述微生物在含有特定濃度抗生素的培養(yǎng)基中生長。本方法的特征在于，其涉及采用質(zhì)譜法確定培養(yǎng)期間培養(yǎng)基的至少一種營養(yǎng)成分是否減少，或者是否有新出現(xiàn)并增加的營養(yǎng)成分的化學(xué)改性變體。營養(yǎng)成分的減少或營養(yǎng)成分化學(xué)改性變體的增加表明在這一特定濃度下對抗生素有抗藥性?？赏ㄟ^甲基化、?；⒁阴；⒀趸蛳嗨品磻?yīng)產(chǎn)生化學(xué)改性變體，但具體來說通過營養(yǎng)成分的分解產(chǎn)生化學(xué)改性變體。新物質(zhì)的出現(xiàn)及增加通常比已存在營養(yǎng)成分的減少更易于測量。
[0016]優(yōu)選的營養(yǎng)成分是肽，測定其減少或化學(xué)改性。具體而言，使用具有D-氨基酸核心的肽，通過質(zhì)譜法測定僅包含此核心多肽的形成和增加。還可使用由同位素標(biāo)記氨基酸構(gòu)成的肽，其中，通過質(zhì)譜法測定培養(yǎng)基中長度縮短的同位素標(biāo)記肽的形成?？山柚谝詼y定劑量添加的參考物質(zhì)，來測定營養(yǎng)成分的減少或化學(xué)改性變體的增加?；瘜W(xué)改性變體的測量通常不需要參考物質(zhì)，但也可通過與未改性營養(yǎng)成分比較來完成測量?？稍谂囵B(yǎng)完成后，以測定劑量添加一種或多種參考物質(zhì)。參考物質(zhì)優(yōu)選為D-氨基酸組成的肽。
[0017]在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物在包含抗生素的第一培養(yǎng)基中經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)，然后經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的微生物在第二培養(yǎng)基中進(jìn)一步生長。然后通過質(zhì)譜法測量第二培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的分解或營養(yǎng)成分化學(xué)改性變體的增加。
[0018]在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物在存在抗生素的情況下經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)，然后添加另一種營養(yǎng)成分。通過質(zhì)譜法測量這種營養(yǎng)成分的分解或這種營養(yǎng)成分化學(xué)改性變體的增加。另一種營養(yǎng)成分優(yōu)選為肽，添加這種營養(yǎng)成分之后，緊接著向培養(yǎng)基添加分泌性肽酶的抑制劑。
[0019]可以將待分析的微生物均分，均分后的部分在不含抗生素的第一培養(yǎng)基和包含抗生素的第二培養(yǎng)基中同時(shí)生長。優(yōu)選讓待分析的微生物在含不同濃度抗生素的多個(gè)培養(yǎng)基中生長，以確定抗藥性強(qiáng)度。還可以將微生物分成更多份數(shù)，然后讓其在相應(yīng)數(shù)量的培養(yǎng)基中同時(shí)生長，一個(gè)培養(yǎng)基不含任何抗生素，其他培養(yǎng)基分別含不同濃度的不同類型抗生素。
[0020]本發(fā)明還提供了一種合成培養(yǎng)基，其包含根據(jù)本發(fā)明的方法所需的適當(dāng)營養(yǎng)成分，特別是含有D-氨基酸核心的肽。
[0021]因此本發(fā)明提供的方法與上文引用的兩個(gè)申請文件不同，并不基于Govorun的方法;本發(fā)明的目的是，在微生物培養(yǎng)基存在抗生素的情況下，例如通過酶分解等方法測定微生物周圍環(huán)境中特殊營養(yǎng)成分的減少或具體營養(yǎng)成分化學(xué)改性變體的增加，從而通過質(zhì)譜法測定存活微生物的代謝。因此，并非對微生物進(jìn)行質(zhì)譜分析，而是對培養(yǎng)基的成分進(jìn)行質(zhì)譜分析。在本文中，通過質(zhì)譜觀察到的具體營養(yǎng)成分和改性產(chǎn)物稱為“指示劑”。它們是培養(yǎng)基中的微生物在存在抗生素時(shí)完整或受損代謝的指示劑。
[0022]微生物從其環(huán)境中吸收營養(yǎng)成分，這些營養(yǎng)成分的一部分產(chǎn)生能量，一部分合成用于微生物內(nèi)部結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。蛋白質(zhì)、脂肪，尤其是碳水化合物，用作微生物的營養(yǎng)成分。借助不同機(jī)制，較小的分子可直接通過細(xì)胞壁吸收，對于較大分子，可使用更復(fù)雜的方法，包括通過分泌酶進(jìn)行體外消化。當(dāng)代謝完整時(shí)，還可通過氧化、?；?、甲基化或乙酰化來改變營養(yǎng)成分。
[0023]只要微生物在存在抗生素的培養(yǎng)基中仍然具有完整的代謝，則培養(yǎng)基中的至少某些營養(yǎng)成分將減少或者以改性形式出現(xiàn);因此可將適當(dāng)選擇的營養(yǎng)成分作為微生物代謝正?；虍惓５闹甘緞⒃谙鄳?yīng)組成的培養(yǎng)基中通過質(zhì)譜法對其進(jìn)行觀察。當(dāng)抗生素使代謝機(jī)能停止，因而使生命機(jī)能停止時(shí)，至少如果之前分泌的酶不能繼續(xù)作為催化劑，則指示劑的減少或改性基本停止。可測量之前分泌的酶。如果存在抗生素時(shí)，指示劑未繼續(xù)減少，并且如果改性形式不再增加，則表明微生物對這種抗生素敏感。本發(fā)明基于使用質(zhì)譜法測量培養(yǎng)基中這些指示劑的減少或這些指示劑改性形式的出現(xiàn)。
[0024]指示劑應(yīng)該易于電離，在質(zhì)譜中可清晰識別，優(yōu)選作為營養(yǎng)物被微生物吸收，并且存在的量不是很大，從而可定量跟蹤其減少。應(yīng)當(dāng)還可以容易地檢測指示劑的化學(xué)改性形式。指示劑的吸收或改性不能受易于吸收的過剩營養(yǎng)所限制。例如，如果將肽用作指示劑，則培養(yǎng)基不應(yīng)包含易于吸收的氨基酸成分。
[0025]可通過同位素標(biāo)記增強(qiáng)指示劑的可檢測性，尤其在使用能夠進(jìn)行碎片離子分析的質(zhì)譜儀時(shí)。如果使用同位素標(biāo)記指示劑，則通過質(zhì)譜法還可有效地觀察到指示劑的外部酶解。還可合成指示劑，該指示劑提供無法進(jìn)一步分解的預(yù)定降解產(chǎn)物并作為質(zhì)譜的特殊指示劑。
[0026]為了量化指示劑的減少，以精確的量添加合適的參考物質(zhì)。本身無法被微生物分解或吸收的物質(zhì)可用作參考物質(zhì)。例如，與指示劑相似但比指示劑長或短一個(gè)氨基酸并且僅包含D-氨基酸而不是天然L-氨基酸的肽，可用作參考物質(zhì)。這意味著，天然肽酶無法攻擊它們。此外，優(yōu)選僅在培養(yǎng)完成后添加參考物質(zhì)，以避免任何消化。還可用同位素標(biāo)記參考物質(zhì)。與參考物質(zhì)相比，指示劑以預(yù)期的程度減少，或指示劑的化學(xué)改性變體出現(xiàn)，表明待分析微生物對所使用濃度的抗生素有抗藥性;當(dāng)抗生素的濃度高于最低抑菌濃度(MIC)時(shí)，敏感微生物不會表現(xiàn)出指示劑減少。
[0027]用作指示劑的最佳營養(yǎng)成分取決于微生物種，但這些種通常已知，因?yàn)榭顾幮缘臏y定通常在微生物種的鑒定之后。
[0028]也可使用基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI)和相關(guān)方法以及電噴射電離(ESI)或其他類型的電離作為電離方法。對于MALDI，在制備期間，在適當(dāng)?shù)臉颖据d板上干燥培養(yǎng)基的成分以及基質(zhì)。通過ESI，噴射液態(tài)培養(yǎng)基?？墒褂门鋫溥@些類型電離的離子源的所有質(zhì)譜儀。
[0029]為了至少粗略估計(jì)抗藥性強(qiáng)度，可使用添加了不同濃度抗生素的培養(yǎng)基。為測試對多種抗生素的抗藥性，可以同時(shí)制備含有多種抗生素以及多種抗生素混合物的多個(gè)培養(yǎng)基，如有必要，甚至每個(gè)培養(yǎng)基都具有不同濃度的抗生素。
[0030]還可提供具有合適指示劑和不同抗生素的現(xiàn)成培養(yǎng)基，以及參考物質(zhì)溶液。如果用帶樣本點(diǎn)的市售樣本載板進(jìn)行MALDI電離，其具有預(yù)制的薄層基質(zhì)，這些薄層可能已經(jīng)包含測定量的參考物質(zhì)。
【附圖說明】
[0031]圖1示出了根據(jù)本發(fā)明鑒定微生物并測定其對(此處)兩種抗生素ABl和AB2的抗藥性的方法流程圖的實(shí)例。
【具體實(shí)施方式】
[0032]如上所述，本發(fā)明提供的方法不基于Govorun的方法，與上文引用的兩篇申請文件不同。本發(fā)明的目的在于測定存在抗生素的微生物培養(yǎng)基中特殊營養(yǎng)成分的減少或特殊營養(yǎng)成分化學(xué)改性變體(例如通過酶反應(yīng))的出現(xiàn)或增加，這種特殊營養(yǎng)成分在本文中稱為“指示劑”。這樣就可通過質(zhì)譜法測定存活微生物的代謝。因而并不是對微生物或其成分進(jìn)行質(zhì)譜分析，而是優(yōu)選僅對培養(yǎng)基的成分進(jìn)行質(zhì)譜分析，例如，通過重力使液體中的微生物沉淀后，或通過離心或過濾除去微生物后。
[0033]微生物可通過不同方式從它們的周圍吸收營養(yǎng)成分。營養(yǎng)成分的一部分用來產(chǎn)生能量，一部分通過合成物質(zhì)的合成來構(gòu)建微生物的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物都可以作為微生物的營養(yǎng)成分。營養(yǎng)成分的吸收有不同的方式，有時(shí)非常復(fù)雜，包括營養(yǎng)成分的化學(xué)改性或酶解，這通常在微生物細(xì)胞外進(jìn)行。
[0034]古細(xì)菌、酵母菌、革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁具有非常不同的結(jié)構(gòu)，但通常均具有硬質(zhì)彈性壁結(jié)構(gòu)(對于細(xì)菌而言，該結(jié)構(gòu)包含肽聚糖，一種多糖和四肽的相對多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu))。此外，它們還具有外膜和內(nèi)膜，內(nèi)含嵌入式蛋白質(zhì)(例如孔蛋白)，該蛋白的用途有很多，主要用于運(yùn)輸分子穿過細(xì)胞壁，尤其是細(xì)胞膜。在自然情況下，微生物的細(xì)胞壁只能透過氣體和重量低于幾百道爾頓非常小的中性分子。除非借助幫助，否則對于離子和多數(shù)生物活性物質(zhì)而言，它們是不可逾越的屏障。然而，所有生命過程和具體細(xì)胞功能均取決于參與物質(zhì)或粒子選擇性交換的細(xì)胞及其環(huán)境。因此，存在可讓分子通過細(xì)胞壁的極具選擇性的機(jī)制，例如通道或所謂的載體。
[0035]對于真核微生物而言，內(nèi)吞作用是運(yùn)輸大分子到較小粒子的特殊運(yùn)輸過程。內(nèi)吞作用是細(xì)胞壁內(nèi)陷過程的術(shù)語，其中，單個(gè)細(xì)胞或區(qū)室吞沒液滴，液滴中溶解了某些物質(zhì):大分子或較大營養(yǎng)粒子到其他較小細(xì)胞。在內(nèi)陷過程結(jié)束時(shí)，所謂的內(nèi)體被夾斷或被夾斷且被推入細(xì)胞內(nèi)部，并成為內(nèi)膜系統(tǒng)的一部分。因此，該細(xì)胞將一部分周圍培養(yǎng)基吸收到其內(nèi)部。同樣重要的是受體介導(dǎo)的(或受體控制的)內(nèi)吞作用，其中，細(xì)胞表面上的特殊受體負(fù)責(zé)辨別要吸收的粒子。內(nèi)吞作用與胞吐作用相反，后者則是將諸如代謝物等不再需要的物質(zhì)釋放到細(xì)胞外。只要細(xì)胞壁面積大小保持相同，則內(nèi)吞作用和胞吐作用通常處于平衡狀
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[0036]尤其對于細(xì)菌和酵母菌而言，通過分泌酶(“胞外酶”)也可在外部分解較大的分子，或通過氧化、酰化、乙?；蚣谆瘜⑤^大的分子改性，從而讓這些分子可以穿過細(xì)胞壁運(yùn)輸。這些改性產(chǎn)生的分子也適合作為完整或受損代謝的指示劑。
[0037]如果微生物能在培養(yǎng)基中存活并且具有完整的代謝，那么無論營養(yǎng)究竟怎樣被吸收，被吸收的營養(yǎng)都會使培養(yǎng)基中某些營養(yǎng)成分的濃度降低;可通過質(zhì)譜法觀察這些營養(yǎng)成分，將其作為微生物代謝正?；虍惓５闹甘緞?。如果減少基于化學(xué)改性(例如酶解)，則還會出現(xiàn)分解或改性產(chǎn)物，并且也能夠通過質(zhì)譜法觀察它們。當(dāng)抗生素引起代謝機(jī)能停止，并因此使生命機(jī)能也停止時(shí)，指示劑向微生物細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸也會停止。除非通過之前分泌的酶繼續(xù)催化這些過程，否則指示劑的降解和分解產(chǎn)物的形成也會停止。因此，如果在存在抗生素的一小段時(shí)間后，營養(yǎng)成分未進(jìn)一步減少，或分解和改性產(chǎn)物不再增加，則說明微生物對這種抗生素敏感。本發(fā)明基于使用質(zhì)譜法測量培養(yǎng)基中這些指示劑的減少或改性。
[0038]如上所述，由于酶解會在培養(yǎng)基中產(chǎn)生之前不存在的分解產(chǎn)物，因此還可通過質(zhì)譜法觀察指示劑的酶解，從而能夠測定抗藥性。如果指示劑已進(jìn)行同位素標(biāo)記，則可以找到指示劑進(jìn)行同位素標(biāo)記的部分。詳細(xì)而言，指示劑可具有特殊結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可釋放能夠被輕松識別的分解產(chǎn)物。舉例來說，作為指示劑的肽可具有這樣的結(jié)構(gòu):其中，中間部分具有大約六到十個(gè)D-氨基酸核心，至少在一端接有幾個(gè)L-氨基酸。因?yàn)榉置谛缘鞍酌竷H可降解L-氨基酸，所以包含D-氨基酸的核心不會被消化。之后，這個(gè)核心肽在質(zhì)譜中就會以一種之前未檢測到的新物質(zhì)(隨著時(shí)間推移)出現(xiàn)。很多不同的肽均可作為指示劑，只要所有在所述肽具有相同的D-氨基酸核心，并且在其末端具有微生物需要的不同L-氨基酸即可。之后可通過質(zhì)譜法檢測D-氨基酸的核心并測量它的增加。在本文中，不管肽是在細(xì)胞外被分解，還是在微生物細(xì)胞內(nèi)被分解并再次分泌難消化的分解產(chǎn)物，都是不重要的。
[0039]根據(jù)本發(fā)明方法的細(xì)菌培養(yǎng)最好在完全合成的培養(yǎng)基中進(jìn)行，這種合成培養(yǎng)基的質(zhì)譜非常干凈，沒有太多化學(xué)背景噪聲。合成培養(yǎng)基通常在一升水中含有大約10克葡萄糖，作為能量來源和合成的原材料。原則上，細(xì)菌可以通過消化葡萄糖自己合成內(nèi)源性蛋白質(zhì)和肽；因此必須添加大約0.58的1(2即04作為鉀和磷的來源，添加大約Ig的NH4Cl作為氨基酸中氮的來源，添加0.2g的MgSO4作為酶的硫和鎂的來源，以及必須添加幾種微量元素。然而，該合成過程會消耗大量能量;如果培養(yǎng)基中已經(jīng)存在氨基酸、可消化的肽或蛋白質(zhì)或其他可消化的營養(yǎng)物質(zhì)，則微生物會避免這一過程。例如，如果只有少量肽，但沒有個(gè)別氨基酸，則可以將該肽作為指示劑。包含大約八到十二個(gè)氨基酸的肽是特別優(yōu)選的；這對應(yīng)于大約1000到1400道爾頓的質(zhì)量。例如，如果分別具有十個(gè)氨基酸的兩種肽均可作為指示劑，則應(yīng)選擇包含所有20個(gè)氨基酸的肽?；蛘呖梢允褂萌N或多種肽，它們以微生物中主要存在的比例包含所有氨基酸?？墒褂靡环N肽作為指示劑，也可同時(shí)使用多種肽作為指示劑，因?yàn)樵谂囵B(yǎng)基的質(zhì)譜中可同時(shí)檢測到它們。
[0040]為了獲得高的質(zhì)譜靈敏度，還可使用磷脂，盡管這些磷脂不包含任何氨基酸。還可添加衍生化后易于電離因而使質(zhì)譜鑒定靈敏度較高的肽。
[0041 ]此外，很多細(xì)菌需要生物素(維生素H;質(zhì)量m=244Da)、煙酸(維生素B7;m =123Da)、硫胺素(維生素BI ;m=335Da)、對氨基苯甲酸(m= 137Da)、泛酸(維生素B5 ;m =219Da)、吡哆胺(維生素B6;m=168Da)和氰鈷維生素(維生素B12;m=1355Da)的維生素混合物。這些維生素也可用作指示劑。
[0042]用作指示劑的最佳營養(yǎng)成分取決于微生物種，但微生物種通常已知，因?yàn)榭顾幮缘臏y定通常在微生物種的鑒定之后。
[0043]作為指示劑添加的化合物，其濃度應(yīng)該較低，這樣即使存在少量微生物，并產(chǎn)生少量代謝回轉(zhuǎn)(turnover)，也可輕松檢測到這些化合物的減少。出于同樣原因，由于微生物是在瓊脂中通常以菌落的形式培養(yǎng)以進(jìn)行鑒定，因此微生物通常以相同的形式存在，所以應(yīng)在盡可能少量的液體培養(yǎng)基(只有幾微升)中添加微生物。但是，這些量必須精確測量，以添加參考物質(zhì)。還可以收集相同微生物種的幾個(gè)菌落并將其添加到培養(yǎng)物中。
[0044]為了量化指示劑的減少，精確測定劑量添加合適的參考物質(zhì)。本身無法被微生物分解或吸收的物質(zhì)(例如由于保護(hù)基團(tuán))可用作參考物質(zhì)。尤其合適的是僅由D-氨基酸構(gòu)成的肽。盡管這些物質(zhì)難以消化，但卻幾乎無法阻止微生物吸收這些物質(zhì)，因此僅在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)添加參考物質(zhì)是有利的，這樣可避免培養(yǎng)基中這些參考物質(zhì)的濃度降低。通過參考物質(zhì)測量到指示劑以預(yù)期的程度減少，或降解產(chǎn)物以預(yù)期的程度增加，表明被分析的微生物對所使用濃度的抗生素具有抗藥性;如果抗生素的濃度高于最低抑菌濃度(MIC)，則敏感微生物不會表現(xiàn)出指示劑減少。如圖1的流程圖所示，在此處有利的是還準(zhǔn)備不含任何抗生素的培養(yǎng)基，用以測量微生物引起的指示劑的自然減少或變化，以便進(jìn)行比較。
[0045]上文已經(jīng)提到，事實(shí)上存在一個(gè)過渡期。即使抗生素的濃度遠(yuǎn)高于最高抑制濃度，含有抗生素的培養(yǎng)基中的細(xì)菌不會立即停止所有代謝。它們通常必須先吸收抗生素或者讓抗生素以其他方式起作用。為了避免指示劑在這一階段降解或改性，可以利用抗生素進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，且之后僅添加指示劑。這種預(yù)培養(yǎng)的最佳持續(xù)時(shí)間必須通過實(shí)驗(yàn)方法確定。
[0046]但取決于培養(yǎng)基的成分，也可能在此預(yù)培養(yǎng)時(shí)已經(jīng)分泌蛋白酶，并在添加指示劑后以催化的方式分解指示劑，因而(至少暫時(shí))給人以代謝完整的印象。在這種情況下，有益的是，在預(yù)培養(yǎng)后使用抗生素沖洗微生物并將其放進(jìn)具有指示劑和抗生素的新鮮培養(yǎng)基中。可以通過已知的方法仔細(xì)離心或過濾進(jìn)行沖洗。
[0047]還可在預(yù)培養(yǎng)后添加分泌性蛋白酶的抑制劑，以使其失效。必須對抑制劑的劑量進(jìn)行測量，從而確保抑制劑不會同時(shí)阻止存活微生物繼續(xù)分泌蛋白酶。也可在之后通過反過來抑制抑制劑的物質(zhì)來中和任何過量的抑制劑。
[0048]指示劑和參考物質(zhì)均應(yīng)易于電離，并且在質(zhì)譜中具有能夠輕松識別的峰值。正如上文所述，磷脂具有極高的質(zhì)譜靈敏度。通過參考物質(zhì)，還可覆蓋較大的濃度范圍。例如，可使用比例為100:10:1或25:5:1的三種參考物質(zhì)。這對測量濃度從零向上增加的分解產(chǎn)物尤其有利。
[0049]電離較大有機(jī)分子的所有方法均可用作電離方法，尤其是基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI)和相關(guān)方法以及電噴霧電離(ESI)。對于MALDI，在制備期間，在適當(dāng)?shù)臉颖据d板上干燥少量培養(yǎng)基以及基質(zhì)物質(zhì)。對于ES I，噴射液態(tài)培養(yǎng)基，例如，通過所謂的納米ES I從小毛細(xì)管尖端噴射。配備這些類型電離的離子源的所有質(zhì)譜儀均可使用。
[0050]在微生物徹底抗藥性和徹底敏感性之間存在一個(gè)中間階段;在這一階段，生長受到影響，但未被徹底抑制。為了估算出微生物抗藥性的強(qiáng)度，可以測量抗生素的實(shí)際抑菌濃度?？股氐腗IC值(完全敏感微生物在多小時(shí)暴露后的最低抑菌濃度)在很大程度是已知的;但實(shí)際抑菌濃度可能與該值有所偏離，因?yàn)椴豢赡艿鹊娇股刈饔眠_(dá)到平衡，這需要幾個(gè)小時(shí);而且隨著抗藥性強(qiáng)度的增加，MIC值也增加。要測量實(shí)際抑菌濃度，可使用添加各種濃度抗生素的培養(yǎng)基，例如濃度對應(yīng)于已知MIC值的I XMIC、10 XMIC和100 XMIC。經(jīng)驗(yàn)表明，使用所述方法，如果微生物為完全敏感，則僅在濃度為I XMIC時(shí)即可觀察到對微生物生長的抑制。如果抗藥性較弱，僅在10XMIC濃度以上即可抑制微生物，但如果抗藥性非常強(qiáng)，即使在100XMIC濃度下仍可檢測到生長?？筛鶕?jù)指示劑的減少或變化看出這種效果。這意味著對于中間抗藥性，在不同抗生素濃度下存在不同的生長。
[0051 ]如果不以漸增濃度實(shí)施本方法，據(jù)發(fā)現(xiàn)10 XMIC濃度特別合適。
[0052]為了測定抗藥性，優(yōu)選具有含優(yōu)選指示劑的現(xiàn)成合成培養(yǎng)基。它們之中已經(jīng)添加了不同類型的抗生素。也可提供含有參考物質(zhì)的現(xiàn)成溶液。若用帶樣本點(diǎn)的市售樣本載板進(jìn)行MALDI電離，其具有預(yù)制的薄層基質(zhì)，這些薄層可能已經(jīng)包含測定量的參考物質(zhì)。然后必須放入測定量的培養(yǎng)基。以小瓶市售的預(yù)制量基質(zhì)可能也已經(jīng)包含參考物質(zhì)。
[0053]這種方法非常快速。微生物通常需要大約20分鐘的滯后時(shí)間來對培養(yǎng)基做出調(diào)整，如果微生物是抗藥性的，則再過20分鐘即可觀察到指示劑的顯著減少或分解產(chǎn)物的增加。通常由倍增時(shí)間只有20分鐘左右生長快速的微生物引發(fā)危險(xiǎn)感染。
[0054]為了測試對多種抗生素的抗藥性，可以制備具有多種抗生素的多個(gè)培養(yǎng)基。如有必要，甚至每種抗生素均具有不同濃度。準(zhǔn)備和測量來自多個(gè)培養(yǎng)基的樣本所需的額外時(shí)間幾乎對培養(yǎng)時(shí)間本身沒有任何影響。
[0055]對于多重抗藥性細(xì)菌(例如:MRSA，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)的快速測試來說，可提供含有多種類型抗生素混合物的培養(yǎng)基。如果微生物在此混合物中生長，說明具有多重抗藥性。
[0056]通過基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI)電離干燥的培養(yǎng)基成分要求在樣本載板上提前制備薄層基質(zhì)，或制備基質(zhì)溶液。市售基質(zhì)通常具有不使用超聲則難以溶解的缺點(diǎn)。因此，現(xiàn)在市面上有精確測定量的小瓶純化的凍干基質(zhì)。使用這些產(chǎn)品，在添加溶劑后，基質(zhì)立即溶解，并且溶液濃度恰當(dāng)，立等可用。如本發(fā)明中所定義的，可將精確測定量的至少一種參考物質(zhì)添加到這些產(chǎn)品的基質(zhì)中，以便定量指示劑的分解或變化。在用于制備MALDI樣本的設(shè)備中，以精確的測定量，在不產(chǎn)生接觸的情況下，將基質(zhì)溶液施加到培養(yǎng)基的干燥細(xì)胞成分中。帶有基質(zhì)薄層的樣本載板(已有市售)還可包含測定量的參考物質(zhì)。將每個(gè)薄層分別施加到相互間有適當(dāng)間距，且每個(gè)直徑約為兩毫米的小樣本區(qū)。
[0057]圖1示出了測定抗藥性方法順序的一個(gè)典型的實(shí)例。在此處所示方法中，微生物在瓊脂(101)上進(jìn)行培養(yǎng)基。菌落微生物經(jīng)過收集(102)、裂解，然后處理成MALDI樣本(103)。采集質(zhì)譜(104)，通過比較該質(zhì)譜與參考譜(105)鑒定微生物。在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室中，從收集菌落到完成鑒定只需10分鐘至30分鐘，具體時(shí)間取決于要同時(shí)鑒定的微生物樣本數(shù)量。為了測定抗藥性，可同時(shí)收集相同微生物的多個(gè)菌落(106)。這些菌落在培養(yǎng)基中經(jīng)過混合，然后分配至不同種類的培養(yǎng)基(107)。在該圖示中制備三種培養(yǎng)基:一種培養(yǎng)基不含抗生素
(108)，另外兩種培養(yǎng)基分別含有抗生素Abl (109)和Ab2(110)。在該實(shí)例中，培養(yǎng)基已包含指示劑。不言而喻，還可制備含有其他抗生素的其他培養(yǎng)基。如果還要測定抗藥性的強(qiáng)度，也可制備含有不同濃度抗生素的培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基都在最佳溫度下提前制備，以使微生物不會休克，加熱不會導(dǎo)致時(shí)間延遲。培養(yǎng)期持續(xù)時(shí)間取決于微生物的滯后時(shí)間和倍增時(shí)間(世代周期)，它在微生物鑒定后是已知的。培養(yǎng)只需持續(xù)I至3段倍增時(shí)間。對于生長快速的微生物來說，20至40分鐘左右已經(jīng)足夠。
[0058]添加參考物質(zhì)后，將不同培養(yǎng)基中的培養(yǎng)基樣本處理成MALDI樣本，然后采集質(zhì)譜
(111)。使用不含抗生素的微生物培養(yǎng)基的質(zhì)譜(108)來確定指示劑的正常減少或分解產(chǎn)物的增加，這主要取決于未知的已接種微生物的數(shù)量。在添加參考物質(zhì)(111)和制備MALDI樣本(112)后，獲得培養(yǎng)基(109)和(110)的質(zhì)譜(113)。通過這些質(zhì)譜，與不含抗生素的培養(yǎng)基中指示劑的減少比較，推斷出指示劑是否減少。含抗生素的培養(yǎng)基中指示劑減少表明存在抗藥性。
[0059]目前為止，已經(jīng)通過MALDI電離法實(shí)施該方法。MALDI的顯著優(yōu)點(diǎn)是幾乎只形成單電荷分子離子。這意味著，盡管在500至2000道爾頓首選質(zhì)量范圍內(nèi)出現(xiàn)100至300個(gè)峰值，質(zhì)譜也不過載?？蓪ALDI離子源的任何類型質(zhì)譜儀用于此，例如飛行時(shí)間質(zhì)譜儀以及離子阱質(zhì)譜儀。尤其占據(jù)優(yōu)勢的是串聯(lián)質(zhì)譜儀，這種質(zhì)譜儀可破碎所選離子，從而明確檢測指示劑。優(yōu)選將同位素標(biāo)記指示劑用于這些質(zhì)譜儀。
[0060]然而，也可以采用其他類型的電離。盡管電噴霧電離(ESI)或通過電噴霧對固體樣本進(jìn)行直接表面電離(DESI)等噴霧類方法具有形成大量多電荷離子的缺點(diǎn)，容易使質(zhì)譜過載，但是它們可與液相色譜(HPLC)或毛細(xì)管電泳(CE)等分離方法結(jié)合使用，以便通過分離物質(zhì)獲得結(jié)構(gòu)更簡單的質(zhì)譜。
[0061]然而，還有幾乎只產(chǎn)生單電荷離子的其他電離方法，例如化學(xué)電離(Cl)?；瘜W(xué)電離既可與中性噴霧方法，又可與固體樣本激光消融結(jié)合使用，同時(shí)也可與正交離子注入飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(OTOF-MS)結(jié)合使用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種使用質(zhì)譜法測定微生物對抗生素的抗藥性的方法，其中使所述微生物在含有特定濃度抗生素的培養(yǎng)基中生長， 其中，使用質(zhì)譜法確定在培養(yǎng)期間培養(yǎng)基的至少一種營養(yǎng)成分是否減少或營養(yǎng)成分的化學(xué)改性變體是否增加，通過營養(yǎng)成分的減少或營養(yǎng)成分的化學(xué)改性變體增加表明對給定濃度的抗生素存在抗藥性。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過與以測定量添加的至少一種參考物質(zhì)進(jìn)行比較從而確定營養(yǎng)成分的減少或營養(yǎng)成分化學(xué)改性變體的增加。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，參考物質(zhì)是由D-氨基酸組成的肽。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中，在培養(yǎng)完成后以測定量添加所述參考物質(zhì)。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，使所述微生物在含有抗生素的第一培養(yǎng)基中經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)，然后在第二培養(yǎng)基中進(jìn)一步使經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的微生物進(jìn)一步生長，并通過質(zhì)譜法測量第二培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的分解或營養(yǎng)成分化學(xué)改性變體的增加。6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，使所述微生物在含有抗生素的情況下經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)，然后再添加至少一種其他的營養(yǎng)成分，并通過質(zhì)譜法測量所添加營養(yǎng)成分的分解或所添加營養(yǎng)成分的化學(xué)改性變體的增加。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所添加的營養(yǎng)成分為肽，在添加營養(yǎng)成分之后立即添加已經(jīng)分泌的肽酶的抑制劑。8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，將所述微生物均分，均分后的各部分在不含抗生素的第一培養(yǎng)基和包含抗生素的第二培養(yǎng)基中同時(shí)生長。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，使所述微生物在含有不同濃度抗生素的培養(yǎng)基中生長，以確定抗藥性強(qiáng)度。10.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，將所述微生物均分，均分后的各部分在不含抗生素和含有不同類型不同濃度抗生素的多個(gè)培養(yǎng)基中同時(shí)生長。11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基含有至少一種肽作為營養(yǎng)成分，并且確定該肽的減少或該肽的化學(xué)改性變體的增加。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，使用至少一種包含D-氨基酸核心的肽作為營養(yǎng)成分，并且通過質(zhì)譜法測量僅包含該核心的肽的增加。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，使用至少一種包含同位素標(biāo)記氨基酸的肽作為營養(yǎng)成分，并且通過質(zhì)譜法測量培養(yǎng)基中長度縮短的同位素標(biāo)記肽的形成。14.含有合成培養(yǎng)基用物質(zhì)的包，其包含葡萄糖、維生素、鹽和至少一種營養(yǎng)物質(zhì)，所述營養(yǎng)物質(zhì)的減少或變化可指示代謝是否完整。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的包，其中，至少一種營養(yǎng)是肽。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的包，其中，所述肽包含D-氨基酸核心。
【文檔編號】G01N33/68GK105916995SQ201580004915
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2015年1月14日
【發(fā)明人】馬庫斯·科斯切娃, 卡特里·斯帕比爾
【申請人】布魯克道爾頓有限公司