一種含擴增內(nèi)標的犬巴貝斯蟲pcr檢測試劑盒及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種檢測患病犬是否感染巴貝斯蟲的檢測試劑盒，特別是含擴增內(nèi)標的犬巴貝斯蟲PCR檢測試劑盒。該檢測試劑盒包括上下游引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，擴增內(nèi)標質(zhì)粒pMD?IAC，標準陽性模板質(zhì)粒pMD?18S rRNA，標準陰性模板，空白模板，PCR反應液2×Taq PCR Mix，無菌水。該試劑盒的主要特點是在犬巴貝斯蟲PCR檢測體系中加入擴增內(nèi)標，可以用來指示假陰性現(xiàn)象，排除因反應體系中存在抑制劑，PCR儀器故障，反應體系錯誤，聚合酶失活等原因造成的假陰性結(jié)果，進一步提高檢測結(jié)果的準確性。
【專利說明】
-種含擴増內(nèi)標的犬己貝斯蟲PCR檢測試劑盒及使用方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及一種檢測患病犬是否感染己貝斯蟲的檢測試劑盒，特別是含擴增內(nèi)標 的犬己貝斯蟲PCR檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 犬己貝斯蟲病是由梨形蟲目、己貝斯科、己貝斯屬的蟲體寄生于犬的紅細胞內(nèi)引 起的一種犬嚴重的血液原蟲疾病，由婢叮咬吸血傳播。犬己貝斯蟲病常規(guī)的病原學診斷是 血液涂片染色鏡檢，是作出診斷的主要依據(jù)。但是急性感染或初次感染己貝斯蟲后，自然康 復或通過藥物治療后康復的犬，此時血液中的原蟲血癥太低W致于不能在光學顯微鏡下檢 測到蟲體，PCR技術為準確地診斷感染早期的病犬和帶蟲犬提供了敏感性高、特異性好的診 斷方法。而且PCR技術具有操作簡便，試劑容易獲得，檢測速度快的優(yōu)點，結(jié)合序列分析，限 制性酶切片段長度多態(tài)性分析或嵌套式PCR可W對蟲體種類進行鑒定。在PCR檢測過程中為 了防止假陽性結(jié)果的產(chǎn)生，在檢測樣品的同時設置陰性對照、空白對照，檢測假陽性結(jié)果。 在防止假陰性結(jié)果的產(chǎn)生方面通常設置陽性對照。然而許多假陰性結(jié)果的產(chǎn)生是體系中存 在PCR抑制劑，PCR儀器故障，反應體系錯誤，聚合酶失活造成的，單純的靠陽性對照發(fā)現(xiàn)不 了運些問題的存在。
[0003] 擴增內(nèi)標（internal amplification control,IAC)是添加到PCR反應體系中和目 標基因非同源的但可W同時擴增的一段人工構(gòu)建的DNA序列或者是一段看家基因序列，可 W用來指示假陰性現(xiàn)象。如果反應體系中沒有IAC，檢測到陰性結(jié)果可能是由于反應體系中 沒有目標基因，也可能是由于反應體系中存在抑制劑，PCR儀器故障，反應體系錯誤，聚合酶 失活等原因造成的假陰性結(jié)果。如果反應體系中加入IAC，無論在反應體系中有無目標基因 出現(xiàn)，擴增內(nèi)標的信號總會出現(xiàn)，如果擴增內(nèi)標無信號說明PCR反應失敗，因此加入IAC可W 有效的解決假陰性的現(xiàn)象。
[0004] 本發(fā)明在犬己貝斯蟲PCR反應體系中加入擴增內(nèi)標，能夠有效的避免假陰性現(xiàn)象 的產(chǎn)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種檢測患病犬是否感染己貝斯蟲的檢測試劑盒，特別是含擴增內(nèi)標 的犬己貝斯蟲PCR檢測試劑盒。本發(fā)明所要解決的技術問題是能夠避免犬己貝斯PCR檢測過 程中的假陰性結(jié)果。
[0006] 本發(fā)明通過W下方案實現(xiàn)：
[0007] 1.一種含擴增內(nèi)標的犬己貝斯蟲PCR檢測試劑盒，包括上下游引物SEQ ID NO: 1和 569 10顯:2，擴增內(nèi)標質(zhì)粒口10-14(：，標準陽性模板質(zhì)?？?0-185誠酷，標準陰性模板，空 白模板，PCR反應液2X化q PCR Mix,無菌水。
[000引 2.擴增內(nèi)標質(zhì)粒pMD-IAC，是在PMD19-T Simple Vector載體中插入雞的基因片段 IAC。其構(gòu)建方法是:采用引物SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4W雞的基因組DNA為模板進行PCR 擴增。然后再W得到的PCR產(chǎn)物為模板，采用SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6進行PCR擴增，擴增 產(chǎn)物為IAC。引物SEQ ID N0:5 5^品含有SEQ ID N0:1序列，3^品含有SEQ ID N0:3部分序 列，引物SEQ ID NO:6 5/端含有SEQ ID NO:2序列，3/端含有SEQ ID NO:4部分序列。W擴增 內(nèi)標質(zhì)粒pMD-IAC為模板，利用SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物的大小 為150bp。
[0009] 3.標準陽性模板為質(zhì)粒pMD-lSS rRNA，是在PMD19-T Simple Vector載體中插入 犬己貝斯蟲18S rRNA基因序列。W標準陽性模板為質(zhì)粒PMD-18S rRNA為模板，利用SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物的大小為339bp。
[0010] 4.標準陰性模板為健康犬基因組DM。
[00川 5.空白模板為無菌水。
[001 ^ 6.含擴增內(nèi)標的犬己貝斯蟲PCR檢巧聯(lián)劑盒的使用方法為：
[0013] 設立4個反應體系①待檢樣品PCR反應體系：2X化q PCR Mix 12.加 L，上下游引物 SEQ ID N0:1 和SEQ ID N0:2各0.5uL，擴增內(nèi)標質(zhì)粒pMD-IAC(105copies/uL)luL，樣品 DNA加 L，補加水至25uL。②陽性對照PCR反應體系：2X化q PCR Mix 12.加 L，上下游引物SEQ ID N0:1 和沈Q ID N0:2各0.加 L，標準陽性模板質(zhì)粒PMD-18S rRNA(105copies/uL)luL，補 加水至25化。③陰性對照PCR反應體系：2X化q PCR Mix 12.加 L，上下游引物沈Q ID N0:1 和SEQ ID NO: 2各0 .加 L，標準陰性模板加 L，補加水至25化。④空白對照PCR反應體系：2 X hq PCR Mix 12.加 L，上下游引物沈Q ID N0:1和沈Q ID N0:2各0.加 L，補加水至25uL。
[0014] 取PCR擴增產(chǎn)物化L，采用質(zhì)量比2.0%的瓊脂糖凝膠含0.005%G0LDView，0.5 X TBE電泳緩沖液，120V恒壓電泳40min，紫外燈下觀察電泳結(jié)果。
[0015] 結(jié)果判斷:①陽性對照泳道中含有2個條帶，一個條帶大小為339bp，另一個條帶大 小為15化P;陰性對照泳道中含有1個條帶，大小為15化P;空白對照泳道中沒有條帶。陽性對 照，陰性對照，空白對照不符合上述結(jié)果判斷檢測結(jié)果無效，重新進行檢測。②上述陽性對 照，陰性對照，空白對照結(jié)果正常的情況下，待檢樣品泳道中只有15化P的條帶判斷為陰性； 有2個條帶，一個條帶大小為339bp，另一個條帶大小為15化P判斷為陽性;沒有15化P的條帶 判斷為無效，重新進行檢測。
[0016] 本發(fā)明在犬己貝斯蟲PCR檢測體系中加入擴增內(nèi)標，可W用來指示假陰性現(xiàn)象，排 除因反應體系中存在抑制劑，PCR儀器故障，反應體系錯誤，聚合酶失活等原因造成的假陰 性結(jié)果，進一步提高檢測結(jié)果的準確性。
【附圖說明】
[0017] 附圖1?犬己貝斯蟲基因組DNA為模板，沈Q ID N0:1和沈Q ID N0:2為引物PCR擴 增結(jié)果。泳道1為空白對照；泳道2為SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2擴增結(jié)果，339bp;泳道3為 DNA Marker(2000bp，1000 bp，750bp，500bp，250bp，IOObp)。
[001引附圖2W擴增內(nèi)標質(zhì)粒pMD-IAC為模板，SEQIDN0:l和SEQIDN0:2為引物PCR擴 增結(jié)果。泳道I 為DNA Marker (2000bp，1000 bp，750bp，500bp，250bp，IOObp);泳道2為空白對 照；；泳道3為沈Q ID N0:1和沈Q ID N0:2擴增結(jié)果，150bp。
[0019] 附圖3W犬己貝斯蟲基因組DNA為模板，沈Q ID N0:7和沈Q ID N0:8為引物PCR擴 增結(jié)果。泳道1為空白對照;泳道2為SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8擴增結(jié)果，17(K)bp;泳道3為 DNA Marker(2000bp，1000 bp，750bp，500bp，250bp，lOObp)。
[0020] 附圖4^標準陽性模板質(zhì)粒口]\?)-185誠酷為模板，569 10^:1和569 10^:2為 引物PCR擴增結(jié)果。泳道I為DNA Marker (2000bp，1000 bp，750bp，500bp，250bp，IOObp);泳道 2為沈Q ID NO :1和沈Q ID NO :2擴增結(jié)果，339bp;泳道3為空白對照。
[0021] 附圖5試劑盒實際待檢樣品檢測結(jié)果。第1泳道待樣品檢測結(jié)果為陰性;第2泳道待 檢樣品檢測結(jié)果為陽性;第3泳道為空白對照;第4泳道為標準陰性對照;第5泳道為標準陽 性對照;第6泳道為DNA Marker (2000bp，1000 bp，750bp，500bp，250bp，IOObp)。
【具體實施方式】
[0022] W下實施例中應用的儀器與試藥包括：
[0023] 血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒，純度質(zhì)粒小提試劑盒，普通瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒，DH5a感受態(tài)細胞，2XTaq PCR Mix,購自天根生化科技（北京）有限公司； PMD19-T Simple Vector購自寶生物工程(大連)有限公司。
[0024] 實施例1:犬己貝斯蟲PCR檢測引物
[002引針對犬己貝斯蟲18S rRNA基因序列設計引物：上游引物：SEQ ID N0:15/-邑tctt邑taatt邑邑aat邑at邑邑t邑ac-3' ;了貧字弓1?:SEQ ID NO:25'-at邑cccccaacc邑ttcctatta- 3/，該引物對能夠W犬己貝斯蟲基因組DNA為模板，擴增出339bp的PCR片段。2加 L PCR反應 體系；SXhq PCR Mix 12.加 L，上下游引物沈Q ID N0:1和沈Q ID N0:2各0.加 L，樣品DNA 加 L，補加水至25uLePCR反應程序:預變性94°C，3min。變性94°C，15s;退火65°C，15s，每個循 環(huán)降rC ;延伸72 °C，30s ; 10個循環(huán)。變性94°C，15s;退火55°C，15s ;延伸72 °C，30s; 25個循 環(huán)。最后延伸72°C，5min。取PCR擴增產(chǎn)物7iiL，采用質(zhì)量比2.0%的瓊脂糖凝膠含0.005% GOLDView，0.5 X TBE電泳緩沖液，120V恒壓電泳40min，紫外燈下觀察電泳結(jié)果，泳道中能看 到339bp的電泳條帶(如附圖1所示）。
[0026] 實施例2:擴增內(nèi)標質(zhì)粒pMD-IAC構(gòu)建
[0027] 無菌采集雞血液，邸TA抗凝。按照血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書提 取雞基因組0臟。設計上游引物沈9 10側(cè):35'-176〇：7^66曰。1邑1曰曰邑-3'和569 10側(cè):45'-CCTCTATCAGcatccatc-3/，W提取的雞基因組DNA為模板，擴增的PCR產(chǎn)物長度為103bp，PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收103bp的PCR片段。設計引 物SEQ ID NO:日 5'-gtcttgtaattggaatgatggtgac-TTGCCTTAGG-3'和SEQ ID N0:65'-atgcccccaaccgttcc化tta-CCTCTATCAG-3'。引物沈Q ID N0:5 5'端含有沈Q ID N0:1 序列， 3/端含有SEQ ID NO:3部分序列，引物SEQ ID NO:6 5/端含有SEQ ID NO: 2序列，3/端含有 沈Q ID N0:4部分序列。沈Q ID N0:5和SEQ ID N0:6能夠Wl03bp的PCR產(chǎn)物為模板進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物為IAC，片段長度為15化P。將擴增產(chǎn)物IAC進行瓊脂糖凝膠電泳，用普通瓊脂 糖凝膠DNA回收試劑盒回收IAC。
[0028] 將IAC片段連接至PMD19-T Simple Vector,構(gòu)建成標準陽性模板質(zhì)粒pMD-IAC，然 后轉(zhuǎn)化D冊a感受態(tài)細胞，涂布LB/Amp/X-Gal/IPTG培養(yǎng)基平板（內(nèi)含411191^11116〇.1111邑《 mレl，X-Gal0.04mg?mレl，IPTG 0.024mg?mレl)，挑選白色菌落進行采用引物SEQID NO: 1和SEQ ID NO:2進行PCR鑒定。將含有pMD-IAC質(zhì)粒的陽性克隆接種LB液體培養(yǎng)基（內(nèi)含 Ampiciline 0.1mg/mU，37°C培養(yǎng)過夜，采用高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，TE溶解后用 Nano化op測定DM濃度，計算質(zhì)粒的拷貝數(shù)，分裝后-70°C保存?zhèn)溆谩?br>[00巧]采用沈Q ID NO: 1和SEQ ID NO:2W擴增內(nèi)標質(zhì)粒pMD-IAC為模板，進行PCR擴增， 能擴增出15化P的PCR片段，電泳結(jié)果如附圖2所示。
[0030] 實施例3:標準陽性模板質(zhì)粒PMD-18S rRNA
[00川針對犬己貝斯蟲18S rRNA基因序列設計引物：上游引物：SEQ ID N0:7 5/-aacct 邑邑 tt 邑 atcct 邑 cca 邑 ta 邑 tcat - 3'; 了 貧字弓 I 串勿：SEQ ID N 0 ： 8 5' - gaatgatccttccgcaggttcacctac-3'，該引物對能夠W犬己貝斯蟲基因組DNA為模板，擴增出 1700bp的PCR片段。反應體系和反應程序基本同實施例1，將實施例1中"延伸72°C，30s"改為 "延伸72°C ,90s"。電泳結(jié)果如附圖3所示。
[0032] 無菌采集犬己貝斯蟲病病犬的血液，邸TA抗凝。按照血液/細胞/組織基因組DNA提 取試劑盒說明書提取血液中總的DNA。采用SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8進行PCR擴增，PCR產(chǎn) 物進行瓊脂糖凝膠電泳，用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收1700bp的PCR產(chǎn)物。然后將 1700bp的PCR產(chǎn)物連接至PMD19-T Simple Vector,構(gòu)建成標準陽性模板質(zhì)粒pMD-18SrRNA， 然后轉(zhuǎn)化D冊a感受態(tài)細胞，涂布LB/Amp/X-Gal/IPTG培養(yǎng)基平板（內(nèi)含411191別11116〇.1111邑-mレl，X-Gal0.04mg?mレl，IPTG 0.024mg?mレl)，挑選白色菌落進行采用引物SEQID NO: 1和SEQ ID N0:2進行PCR鑒定。將含有PMD-18S rRNA質(zhì)粒的陽性克隆接種LB液體培養(yǎng)基 (內(nèi)含Ampiciline 0.1mg/mU，37°C培養(yǎng)過夜，采用高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，TE溶 解后用Nano化OP測定DNA濃度，計算質(zhì)粒的拷貝數(shù)，分裝后-70°C保存?zhèn)溆谩?br>[0033] 采用SEQ ID NO: 1和沈Q ID NO:2W標準陽性模板質(zhì)粒PMD-18S rRNA為模板，進行 PCR擴增，能擴增出339bp的PCR片段，電泳結(jié)果如附圖4所示。
[0034] 實施例4:標準陰性模板的制備
[0035] 無菌采集健康犬的血液，邸TA抗凝。按照血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒說 明書提取血液中總的DNA。采用SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2進行PCR擴增，無 PCR擴增產(chǎn)物。
[0036] 實施例5:擴增內(nèi)標質(zhì)粒pMD-IAC添加量的優(yōu)化
[0037] 在25uL的PCR反應體系中加入2 Xhq PCR Mix 12.加 L，上下游引物SEQ ID NO: 1 和SEQ ID N0:2各0.加 L，不同拷貝數(shù)的標準陽性模板質(zhì)粒PMD-18S rRNA和擴增內(nèi)標質(zhì)粒 pMD-IAC，補加水至25uL。標準陽性模板質(zhì)粒PMD-18S rRNA的拷貝數(shù)分別為：108-10^25uL反 應體系和擴增內(nèi)標質(zhì)粒pMD-IAC拷貝數(shù)分別為：10 8-104/25uL反應體系，二者進行全面試驗 優(yōu)化，共計25個PCR反應條件優(yōu)化。確定不影響標準陽性模板質(zhì)粒PMD-18S rRNA PCR擴增的 情況下擴增內(nèi)標質(zhì)粒pMD-IAC的最佳添加量。結(jié)果顯示擴增內(nèi)標質(zhì)粒pMD-IAC的添加量為 10^25uL反應體系，105/2加 L反應體系，104/2加 L反應體系均不影響標準陽性模板質(zhì)粒pMD-18S rRNA的PCR擴增。
[0038] 實施例6:試劑盒進行犬己貝斯蟲PCR檢測
[0039] 采集臨床上可疑犬血液0.5mL，取0 . ImL血液按照血液/細胞/組織基因組DNA提取 試劑盒說明書提取DNA，最終用50uL的水溶解DNA。
[0040] 待檢樣品PCR反應體系JXhq PCR Mix 12.加 L，上下游引物SEQ ID N0:1和沈Q ID NO: 2各0.加 L，擴增內(nèi)標質(zhì)粒pMD-IAC( l〇5copies/uL) IuL，樣品DNA加 L，補加水至化UL。 [0041 ] 陽性對照PCR反應體系JXhq PCR Mix 12.加 L，上下游引物SEQ ID N0:1和沈Q ID NO: 2各0.加 L，標準陽性模板質(zhì)粒PMD-18S rRNA( l〇5copies/uL) luL，補加水至化uL。
[0042] 陰性對照PCR反應體系JXhq PCR Mix 12.加 L，上下游引物SEQ ID N0:1和沈Q ID NO: 2各0.加 L，標準陰性模板加 L，補加水至25uL。
[0043] 空白對照PCR反應體系JXhq PCR Mix 12.加 L，上下游引物SEQ ID N0:1和沈Q ID N0:2各0.加 L，補加水至25uL。
[0044] PCR反應程序同實施例1，反應結(jié)束后取PCR擴增產(chǎn)物化L，采用質(zhì)量比2.0 %的瓊脂 糖凝膠含0.005%G0LDView，0.5 X T肥電泳緩沖液，120V恒壓電泳40min，紫外燈下觀察電泳 結(jié)果。
[0045] 結(jié)果判斷:①標準陽性對照泳道中含有2個條帶，一個條帶大小為339bp，另一個條 帶大小為15化P;標準陰性對照泳道中含有1個條帶，大小為15化P;空白對照泳道中沒有條 帶。陽性對照，陰性對照，空白對照不符合上述結(jié)果判斷檢測結(jié)果無效，重新進行檢測。②上 述標準陽性對照，標準陰性對照，空白對照結(jié)果正常的情況下，待檢樣品泳道中只有15化P 的條帶判斷為陰性;有2個條帶，一個條帶大小為339bp，另一個條帶大小為15化P判斷為陽 性;沒有15化P的條帶判斷為無效，重新進行檢測。
【主權項】
1. 一種含擴增內(nèi)標的犬巴貝斯蟲PCR檢測試劑盒，包括上下游引物SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2，擴增內(nèi)標質(zhì)粒pMD-IAC，標準陽性模板質(zhì)粒pMD-18S rRNA，標準陰性模板，空白模 板，2PCR反應液2XTaq PCR Mix，無菌水。2. 權利要求1所述的含擴增內(nèi)標的犬巴貝斯蟲PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述擴增 內(nèi)標質(zhì)粒PMD-IAC，是在pMD19-T Simple Vector載體中插入雞的基因片段IAC，以擴增內(nèi)標 質(zhì)粒pMD-IAC為模板，利用SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物的大小為 150bp〇3. 權利要求2所述的擴增內(nèi)標質(zhì)粒pMD-IAC，其特征在于，所述的雞的基因片段IAC的獲 得方法為:采用引物SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4以雞的基因組DNA為模板進行PCR擴增。然 后再以得到的PCR產(chǎn)物為模板，采用SEQ ID N0:5和SEQ ID如:6進行?0財廣增，擴增產(chǎn)物為 IAC〇4. 權利要求3所述的雞的基因片段IAC，其特征在于，所述的SEQ ID N0:5的5'端含有 SEQ ID N0:1 序列，3'端含有SEQ ID N0:3部分序列；SEQ ID N0:6的5'端含有SEQ ID N0:2 序列，3'端含有SEQ ID NO :4部分序列。5. 權利要求1所述的含擴增內(nèi)標的犬巴貝斯蟲PCR檢測試劑盒，其特征在于所述標準陽 性模板為質(zhì)粒pMD_18S rRNA，是在pMD19_T Simple Vector載體中插入犬巴貝斯蟲18S rRNA基因序列，以標準陽性模板為質(zhì)粒pMD-18S rRNA為模板，利用SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物的大小為339bp。6. 權利要求1所述的含擴增內(nèi)標的犬巴貝斯蟲PCR檢測試劑盒，其特征在于所述標準陰 性模板為健康犬基因組DNA。7. 權利要求1所述的含擴增內(nèi)標的犬巴貝斯蟲PCR檢測試劑盒，其特征在于所述空白模 板為無菌水。8. 權利要求1所述的含擴增內(nèi)標的犬巴貝斯蟲PCR檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒 的使用方法為： 設立4個反應體系①待檢樣品PCR反應體系：2XTaq PCR Mix 12.5uL，上下游引物SEQ ID N0:1 和SEQ ID N0:2各0.5uL，擴增內(nèi)標質(zhì)粒pMD-IAC(105copies/uL)luL，樣品DNA 5uL， 補加水至25uL。②陽性對照PCR反應體系：2XTaq PCR Mix 12.5uL，上下游引物SEQ ID NO: 1 和SEQ ID N0:2各0.5uL，標準陽性模板質(zhì)粒pMD-18S rRNA(105copies/uL)luL，補加水至 25uL。③陰性對照PCR反應體系：2XTaq PCR Mix 12.5uL，上下游引物SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2各0.5uL，標準陰性模板5uL，補加水至25uL。④空白對照PCR反應體系：2 X Taq PCR Mix 12.5uL，上下游引物SEQ ID N0:1 和SEQ ID N0:2各0.5uL，補加水至25uL。 取PCR擴增產(chǎn)物7yL，采用質(zhì)量比2.0%的瓊脂糖凝膠含0.005%GOLDView，0.5 X TBE電 泳緩沖液，120V恒壓電泳40min，紫外燈下觀察電泳結(jié)果。 結(jié)果判斷:①陽性對照泳道中含有2個條帶，一個條帶大小為339bp，另一個條帶大小為 150bp;陰性對照泳道中含有1個條帶，大小為150bp;空白對照泳道中沒有條帶。陽性對照， 陰性對照，空白對照不符合上述結(jié)果判斷檢測結(jié)果無效，重新進行檢測。②上述陽性對照， 陰性對照，空白對照結(jié)果正常的情況下，待檢樣品泳道中只有150bp的條帶判斷為陰性;有2 個條帶，一個條帶大小為339bp，另一個條帶大小為150bp判斷為陽性;沒有150bp的條帶判 斷為無效，重新進行檢測。
【文檔編號】C12N15/11GK105861651SQ201610209902
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月1日
【發(fā)明人】姚大偉, 楊倫, 楊德吉, 趙艷兵, 肖霞, 許家榮, 洪玉方
【申請人】南京農(nóng)業(yè)大學