一株耐低溫、產(chǎn)香特性突出的冰酒酵母及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株耐低溫、產(chǎn)香特性突出的冰酒酵母及其應(yīng)用，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。該菌株篩選自桓仁產(chǎn)區(qū)的威代爾葡萄16℃條件下自然發(fā)酵過程，是經(jīng)過分子生物學(xué)方法鑒定以及小型發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)優(yōu)選得到的在低溫發(fā)酵條件下具有良好釀造特性和高產(chǎn)酯類特性的冰酒釀酒酵母。本發(fā)明優(yōu)選出的高產(chǎn)酯類的冰酒釀酒酵母CGMCC NO.12350能夠用于冰酒釀造工業(yè)，利用本發(fā)明的冰酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)冰酒，可以在滿足冰葡萄酒生產(chǎn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的同時(shí)顯著提高酯類等香氣化合物的含量，對(duì)提高冰酒品質(zhì)，發(fā)揮葡萄產(chǎn)地優(yōu)勢(shì)可發(fā)揮重要的作用。CGMCC NO.1235020160418
【專利說明】
一株耐低溫、產(chǎn)香特性突出的冰酒酵母及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一株耐低溫、產(chǎn)香特性突出的冰酒酵母及其應(yīng)用，屬于食品生物技術(shù) 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 冰酒是用自然冰凍的葡萄釀造的濃甜葡萄酒，冰葡萄汁一般含有35~42° Brix的 可溶性固形物(糖、酸、含氮化合物）。我國(guó)《中國(guó)葡萄酒釀酒技術(shù)規(guī)范》中對(duì)冰酒的定義是： 推遲葡萄的采收期，當(dāng)氣溫低于-7°C以下，使葡萄在樹枝上保持一定時(shí)間，結(jié)冰，然后采摘、 壓榨，用此葡萄汁釀成的酒(《中國(guó)葡萄酒釀酒技術(shù)規(guī)范》，2002)。
[0003] 決定葡萄酒品質(zhì)特征的優(yōu)劣很大程度上取決于其香氣和口感。其中葡萄酒香氣的 產(chǎn)生是多種化合物相互作用的結(jié)果，其主要來源有三個(gè):葡萄果實(shí)本身的品種香氣，發(fā)酵期 間由微生物代謝而產(chǎn)生的發(fā)酵香氣以及在陳釀期間經(jīng)過橡木桶等處理所產(chǎn)生的陳釀香氣。 其中發(fā)酵香氣的產(chǎn)生是一個(gè)極其復(fù)雜也極為重要的過程，在這個(gè)過程中，有多種酵母菌株 參與，包括釀酒酵母和非釀酒酵母。其中酵母菌在冰酒釀造中起著關(guān)鍵性的作用，負(fù)責(zé)在這 種高糖和高滲環(huán)境中將糖轉(zhuǎn)化成酒精，最終獲得一款香氣濃郁，口感獨(dú)特的濃甜葡萄酒。在 發(fā)酵香氣中，酯類賦予了葡萄酒獨(dú)特而又復(fù)雜的果香味，是其香氣構(gòu)成的關(guān)鍵成分。主要分 為醋酸酯類化合物和乙酯類化合物。醋酸酯類主要有乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸異丁酯、 2-苯乙酸乙酯等，其中乙酸乙酯賦予葡萄酒水果香味，乙酸異戊酯賦予葡萄酒類似香蕉味， 它們因相對(duì)含量較高，對(duì)葡萄酒香氣影響最大。乙酯類碳鏈長(zhǎng)度一般在C4~C10之間，它們 使葡萄酒具有迷人的果香味，如丁酸乙酯賦予葡萄酒類似草莓味，己酸乙酯賦予葡萄酒類 似青蘋果味。葡萄酒中存在的各種酯類化合物，構(gòu)成比例協(xié)調(diào)，對(duì)香氣的形成有協(xié)同增效作 用，單一的酯含量過高或者過低對(duì)葡萄酒品質(zhì)均有不利影響。
[0004] 冰酒與普通干紅葡萄酒等相比，其發(fā)酵具有原料高糖，高酸環(huán)境且發(fā)酵過程要求 低溫等特殊環(huán)境，高糖環(huán)境給酵母菌發(fā)酵帶來了種種困難:酵母需要更長(zhǎng)的時(shí)間來適應(yīng)環(huán) 境使得發(fā)酵變得遲緩(通常達(dá)到目標(biāo)酒度可能需要一個(gè)多月的時(shí)間）；高滲透壓使酵母細(xì)胞 失水收縮;酵母生物量減少、生長(zhǎng)緩慢、糖的代謝率下降。因此，在這種特殊環(huán)境下為保證生 產(chǎn)出品質(zhì)優(yōu)良的冰酒，對(duì)酵母菌株的選擇提出的要求也更加嚴(yán)格，以期能在適量產(chǎn)酸的情 況下，有優(yōu)良的產(chǎn)香能力并且能保證完成發(fā)酵，達(dá)到相應(yīng)的酒精度。優(yōu)良的葡萄酒酵母應(yīng)具 有如下指標(biāo)：（1)快速啟動(dòng)發(fā)酵和酵母生長(zhǎng)速度快，有較高的發(fā)酵能力，能將糖分發(fā)酵完全； (2)耐酒精能力；（3)耐二氧化硫性能:在酒精發(fā)酵啟動(dòng)前，需要加入60mg/L左右的二氧化硫 以抑制雜菌生長(zhǎng)；（4)高級(jí)醇類的生成：葡萄酒中的高級(jí)醇是酒精發(fā)酵的副產(chǎn)物，其含量過 高，飲用容易"上頭"，含量過低，則醇香味不足。適量的高級(jí)醇含量是優(yōu)選酵母的一個(gè)重要 指標(biāo)。除了以上因素，冰酒酵母還應(yīng)具有以下特性：（1)酵母的耐滲透壓能力較高：只有耐滲 透壓的酵母才能在含糖量高于30%以上的葡萄汁中較快的開始發(fā)酵，并產(chǎn)生10%~13% (v/V)的酒度；（2)對(duì)低溫的耐受性能:葡萄酒的風(fēng)味化合物在室溫條件下比較容易揮發(fā)。在 這些化合物中，酯類物質(zhì)賦予了葡萄酒花香和水果香味。在正常的發(fā)酵溫度范圍內(nèi)，發(fā)酵溫 度越低，風(fēng)味物質(zhì)的損失越少；（3)產(chǎn)揮發(fā)酸水平低:揮發(fā)酸是酒精發(fā)酵過程中的不良代謝 副產(chǎn)物，揮發(fā)酸含量過高會(huì)影響葡萄酒的口感。冰酒在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的揮發(fā)酸常會(huì)超過 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，選擇低產(chǎn)揮發(fā)酸能力的酵母則顯得至關(guān)重要(李記明等，2010)。
[0005] 目前，雖然歐洲葡萄酒生產(chǎn)國(guó)的一些酒莊仍采用自然發(fā)酵法釀造葡萄酒，但是這 種發(fā)酵方式具有起酵慢，產(chǎn)品質(zhì)量不易控制以及不適宜大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)等缺點(diǎn)。因此，近些 年，許多葡萄酒生產(chǎn)國(guó)家，如澳大利亞、南非、美國(guó)都改變了傳統(tǒng)的自然發(fā)酵方法，開始利用 篩選的酵母進(jìn)行純種發(fā)酵，這樣不但可以提高生產(chǎn)效率并且使酒的釀造便于控制，保證安 全高效生產(chǎn)，更為重要的是這些本土酵母菌株能夠產(chǎn)生一些凸顯產(chǎn)地葡萄酒獨(dú)特感官特征 的風(fēng)味物質(zhì)，從而賦予當(dāng)?shù)仄咸丫篇?dú)特的質(zhì)量和風(fēng)格。
[0006] 我國(guó)在葡萄酒酵母的研究利用方面還處于起步階段，我國(guó)葡萄酒廠廣泛采用活性 干酵母進(jìn)行接種發(fā)酵，釀造冰酒的酵母大多從國(guó)外引進(jìn)，而且多是一些廣適性的商業(yè)釀酒 酵母，缺乏適應(yīng)品種與產(chǎn)地特色的冰酒專用酵母。這不僅是對(duì)本土酵母資源的漠視，更為重 要的是長(zhǎng)期使用活性干酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵，會(huì)對(duì)本土酵母生物多樣性產(chǎn)生負(fù)面影響，最終 導(dǎo)致產(chǎn)品同質(zhì)化，缺乏地域特征。隨著我國(guó)葡萄酒產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，加強(qiáng)我國(guó)釀酒酵母資源 的開發(fā)與利用已迫在眉睫。著眼于當(dāng)?shù)匾吧N資源，篩選出具有獨(dú)特發(fā)酵特性的酵母，以 期開發(fā)出更多的體現(xiàn)區(qū)域特色的酵母菌株已成為當(dāng)今葡萄酒產(chǎn)業(yè)的趨勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的，旨在填補(bǔ)我國(guó)冰酒專用酵母資源研究的空白，提供一株產(chǎn)香能力 強(qiáng)，發(fā)酵活性高，特別是高產(chǎn)酯類的野生型冰酒酵母及其在冰酒生產(chǎn)中的應(yīng)用，采用的技術(shù) 方案如下：
[0008] 本發(fā)明提供的高產(chǎn)酯類的釀酒酵母(Saccharomyces cere vis iae)，具體為CGMCC NO. 12350,已于2016年4月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地 址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。
[0009] 所述的釀酒酵母CGMCC N0.12350是由遼寧省桓仁縣葡萄原產(chǎn)區(qū)的威代爾(Vidal) 葡萄16°C條件下自然發(fā)酵篩選得到。該冰酒酵母具有耐低溫、產(chǎn)香特性突出的特性。
[0010]所述釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)CGMCC N0.12350經(jīng)過48h固體YEF*D培 養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落為圓形、乳白色、有光澤，其邊緣整齊，菌體粘稠，易挑起;在WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂 培養(yǎng)基上菌落特征為奶油色帶綠色，菌落球形突起，表面光滑、不透明，奶油狀。
[0011] 本發(fā)明選用產(chǎn)自桓仁地區(qū)的威代爾冰葡萄汁在低溫下（16°C)自然發(fā)酵過程中，在 發(fā)酵不同階段取樣，稀釋分離后涂布平板，獲得大量葡萄酒酵母單菌落。從中選取數(shù)株酵母 進(jìn)一步篩選、鑒定并進(jìn)行小型發(fā)酵罐試驗(yàn)對(duì)比得到一株發(fā)酵性能良好，產(chǎn)香能力強(qiáng)(酯類物 質(zhì)含量高）的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)編號(hào)為CGMCC N0.12350。
[0012] 所述的冰酒酵母在葡萄酒及冰葡萄酒釀造中的應(yīng)用。尤其是在威代爾冰葡萄酒低 溫釀造過程中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明有益效果：
[0014] 利用本發(fā)明提供的釀酒酵母生產(chǎn)出的冰葡萄酒優(yōu)點(diǎn)在于，與商業(yè)的活性干酵母 DV10(DV10,法國(guó)拉曼公司生產(chǎn)，常用于冰酒釀造)相比，其在低溫發(fā)酵條件下（16°C)啟動(dòng)發(fā) 酵所用的時(shí)間短，發(fā)酵速度較快，在高糖的環(huán)境下仍能保證產(chǎn)乙酸量在1.6g/L以下，降低了 高糖發(fā)酵條件下?lián)]發(fā)酸的產(chǎn)生量，提高了冰酒的質(zhì)量，與此同時(shí)，CGMCC NO. 12350具有更強(qiáng) 的產(chǎn)香能力，特別是各種酯類物質(zhì)，由該酵母產(chǎn)生的酯類物質(zhì)的總含量達(dá)到144.2mg/L，比 對(duì)照商業(yè)酵母高出近40mg/L，其中乳酸乙酯，辛酸乙酯，乙酸乙酯，癸酸乙酯和十二酸乙酯 明顯高于商業(yè)對(duì)照，賦予了冰酒更加豐富的果香味。
【附圖說明】
[0015] 圖 1 為釀酒酵母菌株（Saccharomyces cerevisiae)CGMCC N0.12350號(hào)在YEF*D營(yíng)養(yǎng) 瓊脂上的菌落形態(tài)。
[0016] 圖2為釀酒酵母菌株（Saccharomyces cerevisiae)CGMCC N0.12350號(hào)在WL營(yíng)養(yǎng)瓊 脂上的菌落形態(tài)。
[0017] 圖3為自篩菌株CGMCC N0.12350與商業(yè)酵母DV10細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
[0018] 圖4為自篩菌株CGMCC N0.12350與商業(yè)酵母DV10糖消耗曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。
[0020] 下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0021] 下述實(shí)施例中YEPD固體培養(yǎng)基配方如下：葡萄糖，20g/1000mL;蛋白胨，20g/ 1 OOOrnL;酵母提取物，10g/1 OOOrnL;瓊脂，20g/1 OOOrnL;自然pH值，121°C，滅菌 15min。
[0022] 下述實(shí)施例中WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方如下：
[0023]酵母抽提物，4g/1000mL;胰蛋白胨，lg/1000mL;葡萄糖，50g/1000mL;KH2P04， 0.550g/1000mL；KCl,0.425g/1000mL；CaC12,0.125g/1000mL；MgS04,0.125g/1000mL； FeC13，0 ? 0025g/1000mL; MnS04，0 ? 0025g/1000mL;溴甲酚綠，0 ? 022g/1000mL; pH=6 ? 5。
[0024] 實(shí)施例1:釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)CGMCC NO. 12350菌株分離、純化 及其鑒定
[0025] 將來自桓仁產(chǎn)區(qū)的威代爾冰葡萄汁在低溫下（16°C)發(fā)酵，在發(fā)酵不同階段取樣， 稀釋分離后涂布平板，獲得大量葡萄酒酵母單菌落，根據(jù)形態(tài)特征從中挑選出116株。對(duì)獲 得的菌株進(jìn)行菌落形態(tài)以及分子生物學(xué)鑒定（5.8S-rDNA ITS方法），共鑒定出21株釀酒酵 母和26株非釀酒酵母。對(duì)其中10株釀酒酵母的釀造特性進(jìn)行研究，在500ml三角瓶中進(jìn)行發(fā) 酵初篩，將10株釀酒酵母分別在冰葡萄汁中以lX106CFU/mL的接種量接種，16°C發(fā)酵靜置 培養(yǎng)30~40d，對(duì)其發(fā)酵能力及香氣物質(zhì)等指標(biāo)進(jìn)行了監(jiān)測(cè)和測(cè)定，篩選出發(fā)酵能力較強(qiáng)的 一株釀酒酵母，編號(hào)為CGMCC N0.12350。
[0026] 該菌株經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察、5.8S-ITS rDNA基因擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的RFLP分析和26s rDNA D1/D2區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，后對(duì)所有鑒定結(jié)果綜合分析后。具體鑒定結(jié)果如下：
[0027] (1)形態(tài)學(xué)觀察方法和結(jié)果:經(jīng)過48h培養(yǎng)，CGMCC N0.12350號(hào)菌株在YEDP固體培 養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落為乳白色，圓形，有光澤，邊緣整齊，粘稠，易挑起(如圖1所示）；在WL營(yíng)養(yǎng) 瓊脂培養(yǎng)基上菌落特征為奶油色帶綠色，菌落球形突起，表面光滑、不透明，奶油狀(如圖2 所示）。
[0028] (2)5.8S-ITS rDNA PCR-RFLP和5.8S-ITS rDNA序列分析鑒定方法和結(jié)果：
[0029] 酵母的核糖體5.8S rDNA及兩側(cè)的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer, ITS)具有顯著的種間差異性，可作為鑒別酵母菌種的分類依據(jù)，采用5.8S-ITS rDNA PCR-RFLP和5.8S-ITS rDNA序列分析兩種分子生物學(xué)方法對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。具體方法如下：
[0030] ①酵母菌基因組DNA的提取:首先采用酵母菌基因組DNA提取試劑盒提取酵母菌的 基因組DNA。
[0031] ②酵母菌株5.8S-ITS rDNA的PCR擴(kuò)增:PCR擴(kuò)增所用引物為ITS1(5'-T C C G T A GGTGAACCTGCG G-3，）（SEQ ID N0.1)和ITS4(5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，） (SEQ ID勵(lì).2)，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;？0財(cái)廣增條件為951€\51^11;941€ X lmin，55 ? 5°C X 2min，72°C X 2min，35個(gè)循環(huán);72°C X lOmin; PCR擴(kuò)增體系（50yL)的組成 為：模板DNA 3-5yL，10XPCR反應(yīng)緩沖液5.0yL，10yM引物0.5yL，10mM dNTPs lyL，Taq DNA 聚合酶1U，ddH20補(bǔ)充體系至50yl，混勻。隨后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)：取10yL PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物點(diǎn)樣于1 %瓊脂糖凝膠上，電泳緩沖液為1 X TAE，120V電壓下，電泳40min，溴化乙錠(EB) 染色后，由凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳圖譜拍照并進(jìn)行分析，采用D200DNA Marker判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物的大小。
[0032] ③酵母菌株5.8S-ITS rDNA的RFLP分析：5.8S-ITS rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂 糖凝膠回收試劑盒純化后，分別用CfoI、HaeHI和HinfI(Fermentas，American)三種限制性 內(nèi)切酶37°C酶切1.5h; 12yL的酶切體系內(nèi)含10yL PCR純化產(chǎn)物，lyL 10 X Buffer和lyL內(nèi)切 酶；加1.2yL 10 X loading Buffer終止酶切，之后取10此酶切產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠，IX TAE緩沖液中，100V電壓下電泳45min，EB染色后，凝膠照相，最后與標(biāo)準(zhǔn)酶切圖譜對(duì)照，在種 的水平上鑒定待測(cè)酵母菌株。
[0033] 引物：ITSl(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'） (SEQ ID N0.1)
[0034] ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'） (SEQ ID NO.2)
[0035]使用以上引物對(duì)分離的代表性菌株的5.8S-ITS rDNA區(qū)擴(kuò)增，所得的產(chǎn)物大多為 450~880bp之間。使用CfoI、HaeIII和Hinfl進(jìn)行酶切，所得酶切圖譜共有20個(gè)類型，將酶切 圖譜與Guillamon和Esteve-Zarzoao等人建立的標(biāo)準(zhǔn)酶切圖譜進(jìn)行對(duì)照鑒定。酵母菌株 CGMCC N0.12350號(hào)的5.8S-ITS rDNA-RFLP方法鑒定的酵母菌株的酶切數(shù)據(jù)如表1所示。與 對(duì)照菌DV10菌株的5.8S-ITS rDNA-RFLP酶切圖譜進(jìn)行比較，證明CGMCC N0.12350號(hào)為釀酒 酵母。
[0036] 表1酵母菌株5.8S-ITS rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小及限制性內(nèi)切酶酶切圖譜
[0038] (3)26s rDNA D1/D2區(qū)擴(kuò)增測(cè)序分析鑒定方法和結(jié)果：
[0039] ①酵母菌基因組DNA的提?。和稀?br>[0040] ②酵母菌株26s rDNA D1/D2的PCR擴(kuò)增：26s rDNA D1/D2擴(kuò)增引物使用引物為NL1 (5-G CATATCAATAAGCGGAGGAAAA G-3)(SEQ ID N0.3)和NL4(5-G G TCCGTGTTTCAAGACG G-3)(SEQ ID N0.4)，PCR 循環(huán)為 95°C 預(yù)變性 5min，94 。(:變性 lmin，52°C 退火 lmin，72°C 延伸 lmin20s;循環(huán) 36 次;72°C 保溫 SmiruPCR 反應(yīng)體系(50y L體系）；10XPCR buffer 5yL，25mM MgCh 6yL;10mM dNTPs 1此；10虛引物各2.5yL;Taq酶 2. OU，模板DNA lyL;加ddH20至50yL。隨后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)：取5yL PCR擴(kuò)增原 液點(diǎn)樣于1 %瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后在紫外燈照射下初步確定是否擴(kuò)出所要片段。擴(kuò)增 成功后，進(jìn)行測(cè)序。
[0041]由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物同PCR引物NL1和NL4;測(cè)序 結(jié)果與國(guó)家生物技術(shù)信息中心上的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列對(duì)比，與釀酒酵母標(biāo)準(zhǔn)菌Y1-33同源性 為100%。測(cè)定得到的序列(NG_16017)如下（SEQ ID N0.5):
[0043]采用三種分類鑒定方法對(duì)CGMCC NO. 12350號(hào)菌株進(jìn)行鑒定，其鑒定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)對(duì) 照菌株相似度達(dá)99%以上，故可將CGMCC N0.12350號(hào)鑒定為釀酒酵母新菌株。
[0044]實(shí)施例2:釀酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC NO. 12350號(hào)與商業(yè) 酵母DV10釀酒效果對(duì)比實(shí)驗(yàn)
[0045] 篩選得到的釀酒酵母CGMCC N0.12350和商業(yè)酵母DV10在威代爾冰葡萄汁中的釀 造特性的比較，具體方法如下:將保存于_80°C的自篩野生型釀酒酵母CGMCC N0.12350號(hào)和 商業(yè)釀酒酵母DV10分別在YEH)固體和液體培養(yǎng)基上傳代，從YEH)平板上挑取菌株分別接入 裝有100mL已滅菌液體YEH)培養(yǎng)基的三角瓶中，搖床（180rpm，28 °C)培養(yǎng)24h，作為待接種的 活化種子液。按105CFU/mL接種于3L威代爾冰葡萄汁中（5L發(fā)酵罐），初糖濃度420g/L，二氧 化硫濃度60mg/L，以8層紗布封口，16°C條件下靜置培養(yǎng)30~40d，至每日糖耗<2g/d終止發(fā) 酵，得到最終的冰酒。
[0046]按照下述方法檢測(cè)威代爾冰酒的釀造特性：
[0047]發(fā)酵速率:DNS測(cè)定還原糖，監(jiān)測(cè)糖消耗；
[0048]乙醇:試劑盒法，乙醇測(cè)定試劑盒(Megazyme公司，愛爾蘭）；
[0049] 果糖:試劑盒法，果糖測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所）；
[0050] 乙酸、甘油:液相色譜法(GB/T 15038-2006);
[0051] 酯類、高級(jí)醇、有機(jī)酸等揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量：用Agilent 6890氣相色譜(GC)和 Agilent 5975質(zhì)譜(MS)聯(lián)用儀(Agilent，美國(guó)）檢測(cè)上述獲得的釀造葡萄酒中各種揮發(fā)性 香氣物質(zhì)種類和含量。具體條件為：毛細(xì)管柱HP-INNOWAX Polyethylene Glycol 60mX 0.25mm X 0.25wii(J&W scientific，美國(guó)）載氣為高純氦氣，流速lmL/min;頂空固相微萃取 手動(dòng)進(jìn)樣，采用不分流模式，插入氣相色譜的進(jìn)樣口，進(jìn)樣口溫度250°C，熱解析25min。柱溫 箱的升溫程序是:40°C保持5min，然后以3°C/min的速度升溫至200°C，保持2min。質(zhì)譜接口 溫度為280°C，離子源溫度為230°C，電離方式EI，離子能量70ev，質(zhì)量掃描范圍20-450amu。 [0052] 釀酒酵母CGMCC NO. 12350與商業(yè)酵母DV10細(xì)胞生長(zhǎng)和糖消耗曲線見圖3-4。釀酒 酵母CGMCC N0.12350與商業(yè)酵母DV10在威代爾冰葡萄汁中釀造特性比較結(jié)果見表2及表3。 [0053] 由細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(0D6Q())(圖3)可知，菌株CGMCC勵(lì).12350與商業(yè)菌0￥10在威代爾 高糖葡萄汁低溫（16°C)條件下生長(zhǎng)并沒有很大的差異，當(dāng)進(jìn)入穩(wěn)定期后，CGMCC N0.12350 細(xì)胞量甚至要稍高于DV10,表明CGMCC NO. 12350具有較強(qiáng)的耐低溫發(fā)酵能力。糖消耗速度 的快慢能夠反映細(xì)胞的發(fā)酵活性，由圖4可以看出，菌株CGMCC N0.12350起酵速率和前期發(fā) 酵速度要高于DV10,發(fā)酵結(jié)束時(shí)，CGMCC如.12350酒樣最終糖度為1278/1，高于0￥10酒樣 (110g/L) 〇
[0054]由圖4顯示，CGMCC NO. 12350在發(fā)酵的第四天后就開始呈現(xiàn)出較明顯的糖下降趨 勢(shì)，這種趨勢(shì)明顯快于商業(yè)對(duì)照DV10,證明了其啟動(dòng)發(fā)酵所有的時(shí)間比DV10短。與此同時(shí)， 如表2顯示在相同的發(fā)酵時(shí)間和條件下，在達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，CGMCC N0.12350的乙酸產(chǎn)量為 1.27g/L，比DV10(1.40g/L)低0.23g/L，雖然兩者都滿足了冰酒標(biāo)準(zhǔn)對(duì)乙酸的限定量，但 CGMCC N0.12350這種低產(chǎn)酸的特性無疑可以為進(jìn)一步提升冰酒品質(zhì)做出貢獻(xiàn)。
[0055]兩株菌酒精發(fā)酵后葡萄酒樣的理化指標(biāo)見表2所示。
[0056]表2測(cè)試菌株酒精發(fā)酵后葡萄酒樣的理化指標(biāo)
[0059] 兩株菌發(fā)酵完成后主要揮發(fā)性香氣成分種類和含量的比較，見表3所示。
[0060] 表3釀酒酵母CGMCC N0.12350號(hào)和對(duì)照商業(yè)菌株DV10酒精發(fā)酵后香氣物質(zhì)
[0062]經(jīng)過搖瓶發(fā)酵和小型發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)，對(duì)得到的酒樣進(jìn)行了一系列理化成分的檢測(cè)以 及香氣成分種類和含量的測(cè)定，從表2和表3可以看出：除了糖濃度，CGMCC NO. 12350與DV10 在主代謝產(chǎn)物方面差異不大。在40d內(nèi)結(jié)束發(fā)酵，酒精度2 12 % v/v，揮發(fā)酸（乙酸)含量為S 2. lg/L，符合GB/T 25504-2010對(duì)冰葡萄酒釀酒微生物相關(guān)的各項(xiàng)指標(biāo)要求，表明CGMCC N0.12350的釀造特性良好;且由CGMCC N0.12350所釀造得到的酒樣其香氣成分酯類的總含 量明顯高于商業(yè)對(duì)照DV10，總酯的產(chǎn)量為144.2mg/L，比對(duì)照商業(yè)酵母高出近40mg/L，屬于 高產(chǎn)酯類的菌株，特別是其中乳酸乙酯、癸酸乙酯以及辛酸乙酯均顯著高于商業(yè)對(duì)照，乳酸 乙酯具有清甜的、帶有酸味的水果香氣，稀釋后具有乳脂及菠蘿味道，癸酸乙酯具有水果 味，辛酸乙酯具有甜味，果香，奶香并伴有酵母氣息，除此之外絕大多數(shù)的酯類都具有令人 愉快的花香和果香。高級(jí)醇含量CGMCC NO. 12350要低于DV10，這可能是由于轉(zhuǎn)化為酯類物 質(zhì)所致。豐富的酯類物質(zhì)與其它揮發(fā)性組分相配合使得冰酒的整體香氣得到了更好的體 現(xiàn)，同時(shí)也構(gòu)成了冰酒香氣的特殊性。
[0063]由此可見，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選得到的冰酒釀酒酵母CGMCC N0.12350不僅能快速地完成整 個(gè)冰酒的釀造過程使其符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)能夠有效的改善冰酒香氣，增加冰酒的香氣濃 郁性和復(fù)雜性。實(shí)施例3: 5L發(fā)酵罐釀造的葡萄酒感官評(píng)定
[0064] 針對(duì)小型發(fā)酵釀造酒樣進(jìn)行了專業(yè)的專家感官品評(píng)，十三名專家有來自國(guó)家級(jí)葡 萄酒品酒師(一位），來自國(guó)內(nèi)高校多年從事葡萄酒研究的教授、副教授(各兩位），葡萄酒專 業(yè)碩士、博士研究生(八人），具有較高的權(quán)威性和合理性。各位品評(píng)人員對(duì)所試酒樣給出的 評(píng)分(取平均值)結(jié)果見表4所示。
[0065]表4小型發(fā)酵葡萄酒感官評(píng)定評(píng)分結(jié)果(專家盲評(píng)）
[0067]從感官評(píng)定評(píng)分結(jié)果看出，綜合葡萄酒的香氣和口感等各項(xiàng)指標(biāo)的綜合指標(biāo)，十 三位專家給予了由CGMCC N0.12350菌株所釀造的冰葡萄酒更高的評(píng)價(jià)，認(rèn)為其在整體品質(zhì) 上優(yōu)于由商業(yè)對(duì)照DV10。認(rèn)為其充分地體現(xiàn)了威代爾的典型品質(zhì)，適口的同時(shí)香氣更顯濃 郁怡人，給人帶來愉悅的感覺，表現(xiàn)出了良好的釀酒品質(zhì)。
[0068]雖然本發(fā)明已以較佳的實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此 技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明精神和范圍內(nèi)，都可以做各種的改動(dòng)與修飾，因此，本發(fā)明的保 護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株耐低溫、產(chǎn)香特性突出的冰酒酵母，其特征在于，菌種保藏編號(hào)為CGMCC NO. 12350，于2016年4月18日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。2. 權(quán)利要求1所述的冰酒酵母在葡萄酒及冰葡萄酒釀造中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12G1/022GK105820964SQ201610352294
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年5月25日
【發(fā)明人】吳旭高
【申請(qǐng)人】桓仁思帕蒂娜冰酒莊園股份有限公司