從馬錢子中提取番木鱉堿氮氧化物的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及中藥提取技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種從馬錢子中提取番木整堿氮氧化物 的方法，W及該化合物制備抗肝癌、抗肺癌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 番木整堿氮氧化物是中藥馬錢子中的一種有抗癌活性的化合物，結(jié)構(gòu)式如下所 示：
[0003]
[0004] 現(xiàn)今對(duì)番木整堿氮氧化物的分離提取受傳統(tǒng)中藥非機(jī)械化的操作方式所限制，步 驟繁瑣，耗時(shí)，耗力，得到的化合物量少且批次間差異大，難W進(jìn)行臨床研究。
[0005] 另外對(duì)于番木整堿氮氧化物而言，它的應(yīng)用也很少有人研究，因此其潛在作用有 待開發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)W上現(xiàn)有技術(shù)問題，提供一種從中藥馬錢子中 提取番木整堿氮氧化物的方法，該方法采用高效液相色譜進(jìn)行分離純化，分離方法穩(wěn)定，重 復(fù)性高，制備量大，操作簡(jiǎn)單省時(shí)。
[0007] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：
[000引一種從馬錢子中提取番木整堿氮氧化物的方法，該方法包括W下步驟：
[0009] (I)W馬錢子子實(shí)體為原料，磨成粉末狀后，用乙醇浸泡或者回流提取，過濾，所得 濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用甲醇體積分?jǐn)?shù)為50-70 %的甲醇-水二元混合溶劑溶解，得到固 含量50-200mg/mL的提取液；
[0010] (2)對(duì)得到的提取液進(jìn)行一維液相色譜分離:采用的色譜柱為C18色譜柱，流動(dòng)相 為二元混合液相，其中A相為水、B相為甲醇；進(jìn)樣量為50-200mL/針；流動(dòng)相流速為100-lOOOmL/min;檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)200-260nm;洗脫方式為B相濃度25 %等度洗脫 10min、B相濃度35%等度洗脫20min、B相濃度100%等度洗脫IOmin;根據(jù)紫外吸收光譜收集 11.5-13.5min洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到一維液相組分；
[0011] (3)用甲醇體積分?jǐn)?shù)為50-70 %的甲醇-水二元混合溶劑溶解一維液相組分，溶解 至固含量為50-100mg/mL
[0012] (4)進(jìn)行二維液相色譜分離:采用的色譜柱為C18色譜柱，流動(dòng)相為二元混合液相， 其中A相為水、B相為甲醇;進(jìn)樣量為500-2000化/針;流動(dòng)相流速為10-30mL/min;檢測(cè)器為 紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)200-260nm;洗脫方式為B相濃度30 %等度洗脫15-30min;根據(jù)紫外吸 收光譜收集9.7-10.5min洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得本發(fā)明化合物番木整堿氮氧化物。
[0013] 所述步驟(1)中回流提取可重復(fù)進(jìn)行1-3次，每次1-化。
[0014] 所述步驟(1)、（3)中甲醇-水二元混合溶劑含0.1% (質(zhì)量百分比）乙酸。
[0015] 所述步驟(2)、（4)中二元混合液相的A相含0.1% (質(zhì)量百分比）乙酸。
[0016] 所述步驟（2)中C18色譜柱具體為反相C18軸向加壓色譜柱（150 X 250mm， 100 A;)，使用時(shí)柱溫為室溫或25-40°C。
[0017] 所述步驟(4)中C18色譜柱具體為華譜C18色譜柱（20X250mm，5皿，100A)，使用時(shí) 柱溫為室溫或25-40°C。
[0018] 本發(fā)明進(jìn)一步提供上述提取得到的馬錢子番木整堿氮氧化物在制備抗肺癌藥物 中的應(yīng)用。該馬錢子番木整堿氮氧化物作為有效成分，按常規(guī)方法如口服、注射，與藥學(xué)上 的可接受載體或賦形劑，制成適合口服、注射等給藥方式的劑型，如:片劑、膠囊劑、散劑、顆 粒劑、丸劑、溶液劑、懸浮液、糖漿、口腔含片、舌下含片、注射劑、軟膏劑、栓劑、吸入劑等多 種劑型。
[0019] 本發(fā)明還進(jìn)一步提供上述提取得到的馬錢子番木整堿氮氧化物在制備抗肝癌藥 物中的應(yīng)用。該馬錢子番木整堿氮氧化物作為有效成分，按常規(guī)方法如口服、注射，與藥學(xué) 上的可接受載體或賦形劑，制成適合口服、注射等給藥方式的劑型，如:片劑、膠囊劑、散劑、 顆粒劑、丸劑、溶液劑、懸浮液、糖漿、口腔含片、舌下含片、注射劑、軟膏劑、栓劑、吸入劑等 多種劑型。
[0020] 本發(fā)明選用二維高效液相色譜技術(shù)從天然產(chǎn)物馬錢子子實(shí)體中提取番木整堿氮 氧化物，通過合理選擇色譜柱、溶解液、流動(dòng)相等，結(jié)合對(duì)流速、洗脫方式、收集區(qū)段等工藝 條件的摸索，使得整個(gè)分離純化方法切實(shí)可行，操作簡(jiǎn)便，制備周期短，儀器自動(dòng)化程度高， 試劑耗費(fèi)量小，常溫常壓下就可進(jìn)行，制備量大，重復(fù)性高，得到純度達(dá)99 %的番木整堿氮 氧化物單體化合物，且批次之間一致性高，可操作性好，可控度高，可直接運(yùn)用于工業(yè)生產(chǎn)。
[0021] 本發(fā)明得到的番木整堿氮氧化物單體化合物性質(zhì)穩(wěn)定，通過細(xì)胞在線實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的 方法觀測(cè)其在體外的抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)該化合物對(duì)肺癌A549細(xì)胞和肝癌化p-g2細(xì)胞具有較 強(qiáng)抑制作用，即體外實(shí)驗(yàn)抗腫瘤作用明顯，具有良好的抗癌藥物開發(fā)潛力，可用于研發(fā)制備 抗腫瘤藥物中，為抗癌天然藥物的開發(fā)提供了新的原料來源和理論依據(jù)。
【附圖說明】
[0022] 圖1所示的是本發(fā)明從馬錢子中提取番木整堿氮氧化物的方法的一維色譜分離 圖；
[0023] 圖2所示的是本發(fā)明從馬錢子中提取番木整堿氮氧化物的方法的二維色譜分離 圖；
[0024] 圖3所示的是本發(fā)明提取得到的目的產(chǎn)物的HPlX驗(yàn)純圖；
[0025] 圖4所示的是本發(fā)明提取得到的目的產(chǎn)物的tfNMR核磁圖；
[0026] 圖5所示的是本發(fā)明提取得到的目的產(chǎn)物的Ci3NMR核磁圖；
[0027] 圖6所示的是本發(fā)明目的產(chǎn)物番木整堿氮氧化物單體化合物抑制人肺癌A549細(xì)胞 生長(zhǎng)的細(xì)胞實(shí)時(shí)檢測(cè)圖；
[0028] 圖7所示的是本發(fā)明目的產(chǎn)物番木整堿氮氧化物單體化合物抑制人肝癌化P-G2細(xì) 胞生長(zhǎng)的的細(xì)胞實(shí)時(shí)檢測(cè)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] W下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體描述。應(yīng)該指出，W下具體說明都是例示 性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的說明。除非另有說明，本發(fā)明使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語 具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。
[0030] 1、原料、材料：
[0031] 原料馬錢子子實(shí)體采摘自河北并經(jīng)過鑒定;A549細(xì)胞、Hep-G2細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科 學(xué)院血液病醫(yī)院提供。
[0032] 2、試劑：
[0033] 色譜級(jí)甲醇、乙酸、乙醇購(gòu)自天津市康科德科技有限公司；環(huán)憐酷胺購(gòu)自天津金世 制藥有限公司；DMSO購(gòu)自Sigma公司；F-12K培養(yǎng)基購(gòu)自Life Technologies Coloration; MEM培養(yǎng)基購(gòu)自Life Technologies Coloration。
[0034] 3、儀器設(shè)備：
[0035] 超微粉碎機(jī)購(gòu)自山東S清不誘鋼設(shè)備有限公司；臺(tái)式冷凍離屯、機(jī)購(gòu)自化ermo公 司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自上海亞容生化儀器廠；反相C18軸向加壓色譜柱（150 X 250mm，10M1， 1備A)購(gòu)自江蘇漢邦科技有限公司；華譜C18色譜柱（20 X 250mm，5WI1，100 A )購(gòu)自上海華 譜技術(shù)服務(wù)中屯、；制備型高效液相色譜儀購(gòu)自江蘇漢邦科技有限公司；細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)儀購(gòu) 自艾森生物(杭州)有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自立德泰劇(上海)科學(xué)儀器有限公司。
[0036] 實(shí)施例1:馬錢子中番木整堿氮氧化物的提取
[0037] W馬錢子子實(shí)體為原料，磨成粉末狀后用乙醇回流提取1.化，過濾，取沉淀重復(fù)提 取2次，合并所得濾液，旋蒸得到干燥的馬錢子粗粉后稱取lOg，溶于IOOmL 55%的甲醇-水 (0.1 %乙酸)溶液，制得馬錢子提取物溶液，濃度為1 OOmg/mL，過0.45皿微孔濾膜，進(jìn)行一維 液相色譜制備。一維液相色譜采用Innovel C18 150 X 250mm，10皿，1嘶A，流動(dòng)相采用的為 二元液相的混合，其中二元液相A相是水（含0.1 %乙酸）、B相是甲醇，洗脫方式：B相濃度 25%等度10min、B相濃度35%等度20min、B相濃度100%等度lOmin。采用紫外檢測(cè)器，選擇 210nm吸收波長(zhǎng)，制備溫度為室溫，進(jìn)樣量為150mL/針，流動(dòng)相流速為600mL/min，收集11.5-13.5分鐘（圖1中2號(hào)峰）的饋分，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，為一維制備粗品。用50%的甲醇-水(0.1 %乙酸)溶液溶解一維制備粗品，濃度為50mg/mL，經(jīng)微孔濾膜過濾，進(jìn)行二維液相色 譜制備，色譜柱為華譜C18 20X250mm，5皿，100 A，流動(dòng)相采用的為二元液相的混合，其中 二元液相A相是水(0.1%乙酸）、B相是甲醇，采用30%B相等度洗脫15分鐘。采用紫外檢測(cè) 器，選擇210nm吸收波長(zhǎng)，制備溫度為室溫，進(jìn)樣量為2000化/針，流動(dòng)相流速為16mL/min，收 集9.7-10.5分鐘（圖2中M-Et-2-2峰)的饋分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到目的M-Et-2-2組分。
[0038] 對(duì)得到的目的組分進(jìn)行HPLC純度分析，經(jīng)高效液相檢測(cè)純度達(dá)到99%，為單一化 合物，HPlX譜圖見圖3。
[0039] 對(duì)得到的組分進(jìn)行NMR氨譜、醒R碳譜等鑒定，結(jié)果如圖4、5所示，顯示M-化-2-2組 分為番木整堿氮氧化物。
[0040] 實(shí)施例2:馬錢子中番木整堿氮氧化物的提取
[0041] W馬錢子子實(shí)體為原料，磨成粉末狀后用乙醇回流提取化，過濾，取沉淀重復(fù)提取 2次，合并所得濾液，旋蒸得到干燥的馬錢子粗粉后稱取15g，溶于IOOmL 50%的甲醇-水 (0.1 %乙酸)溶液，制得馬錢子提取物溶液，濃度為150mg/mL，過0.45皿微孔濾膜，進(jìn)行一維 液相色譜制備。一維液相色譜采用Innovel C18 150 X 250m，10皿，100 A，流動(dòng)相采用的為 二元液相的