構(gòu)建靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物miRNA-122敲除模型的方法、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物肝癌模型及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種構(gòu)建靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物肝癌模型的方法、動(dòng)物肝癌模型及用該模型篩選 藥物的方法。特別涉及用表達(dá)于肝臟的miRNA miR-122構(gòu)建猴肝癌模型的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝細(xì)胞癌是最常見(jiàn)的肝臟腫瘤，在世界范圍內(nèi)腫瘤相關(guān)性死亡因素中排名第三， 全球每年有超過(guò)50萬(wàn)新患者。2012年美國(guó)預(yù)期有超過(guò)2. 87萬(wàn)新增病例，20, 550預(yù)計(jì)會(huì)死 于這一惡性腫瘤。肝細(xì)胞癌的主要風(fēng)險(xiǎn)因子包括乙型和丙型肝炎病毒感染以及飲酒造成的 肝損傷。如果發(fā)現(xiàn)及時(shí)尚有治愈的希望，但大多數(shù)病例在確診時(shí)均已至晚期無(wú)法醫(yī)治的階 段。
[0003] 2012年，來(lái)自俄亥俄州立大學(xué)綜合癌癥中心的研究人員證實(shí)一種稱(chēng)作 microRNA-122 (miR-122)的小分子在防止肝細(xì)胞癌變的過(guò)程中發(fā)揮了重要的"剎車(chē)"功能， 喪失這一小RNA分子有可能導(dǎo)致肝癌發(fā)生，修復(fù)該分子則可能減慢腫瘤生長(zhǎng)，從而為治療 該疾病指明了一條新的途徑。相關(guān)研究發(fā)表在《臨床研究期刊》（Journal of Clinical Investigation)上。
[0004] 研究者開(kāi)始開(kāi)發(fā)出一種缺失miR-122的小鼠品系，通過(guò)初始的脂肪肝沉積，隨后 的炎癥和肝癌一系列事件，小鼠形成了肝細(xì)胞癌。研究人員隨后利用了第二種小鼠品系，由 于過(guò)表達(dá)致癌基因 MYC這些小鼠會(huì)自發(fā)形成肝癌。研究人員在腫瘤形成過(guò)程中將miR-122 傳遞到動(dòng)物肝癌內(nèi)。三周后，這些用分子治療的小鼠腫瘤既小且少?？茖W(xué)家利用這些研究 開(kāi)發(fā)的模型來(lái)了解肝臟生物學(xué)，也可以用于測(cè)試新開(kāi)發(fā)藥物對(duì)抗包括HCC在內(nèi)的肝臟疾病 的治療效應(yīng)。
[0005] 然而，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，肝臟特異的分子miR-122在人和其它非靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物 中調(diào)控的基因不一樣。導(dǎo)致的結(jié)果是，老鼠肝癌模型不適于人類(lèi)肝癌機(jī)制的研究，也不適用 于肝癌藥物的篩選，只有靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物才能作為有效的肝癌動(dòng)物模型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 原發(fā)性肝癌是全球第五最常被診斷的癌癥，同時(shí)也是癌癥死亡的第二大誘因5' 6。 許多文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道了 TGF0信號(hào)通路在肝腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要的作用7'8。我們首 先估計(jì)了 miR-122在三種肝細(xì)胞系中對(duì)內(nèi)源TGFf3 1水平的影響，其中HepG2和Huh7是人 的肝癌細(xì)胞系，ifepal-6是小鼠的肝癌細(xì)胞系。！fepG2含有較低水平的miR-122,而Huh7和 !fepal-6有較高的miR-122表達(dá)（見(jiàn)圖7)。當(dāng)用miR-122過(guò)表達(dá)載體處理Η印G2細(xì)胞時(shí)，細(xì) 胞表達(dá)的TGFf3 1下降了 54% (圖la和圖8)。同時(shí)，當(dāng)用miR-122海綿轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞時(shí)， 其TGFI3 1的量上升了 2倍。然而，沉默Η印al-6細(xì)胞的miR-122表達(dá)并不能引起TGF0 1 的變化，但有趣的是，TGF β R1的表達(dá)卻上升了 2倍。與此相對(duì)，人肝癌細(xì)胞系的TGF β R1表 達(dá)量在miR-122或者其海綿作用下并無(wú)變化。除此之外，我們發(fā)現(xiàn)miR-122的這種正交作 用并不僅僅局限于肝細(xì)胞（圖9)。
[0007] 接下來(lái)我們研究了 miR-122對(duì)下游信號(hào)通路組分的抑制作用。在!fepG2細(xì)胞 中過(guò)表達(dá)miR-122形成一個(gè)穩(wěn)定的細(xì)胞系，稱(chēng)作！fepG2-122。蛋白質(zhì)印跡分析表明了在 !fepG2-122細(xì)胞中p-Smad2轉(zhuǎn)變成Smad2的比率下降了 50%。在Η印G2-122細(xì)胞中過(guò)表達(dá) TGFi3 1之后，該轉(zhuǎn)變比率又回復(fù)到較高的水平（圖lb)。類(lèi)似地，當(dāng)miR-122在ΝΙΤ-1細(xì)胞 中過(guò)表達(dá)時(shí)，P-Smad2轉(zhuǎn)變成Smad2的比率下降了。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)miR-122的抑制效果特 異于TGF β 1 (圖10)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明了 miR-122在人體中能夠抑制TGF β 1，但在 小鼠中卻是抑制TGF0R1。
[0008] 為了驗(yàn)證miR-122是否直接調(diào)控人體內(nèi)的TGF0 1或小鼠中的TGF0R1，我們構(gòu) 建了一組雙熒光報(bào)告體系，每一組都含有人或者小鼠的3' UTR(圖11)。因?yàn)槿薚GFi3 1的 3' UTR含有多個(gè)亞型，我們?nèi)坎捎米铋L(zhǎng)的亞型進(jìn)行熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)9'1(]。轉(zhuǎn)染含有人 的TGFi3 1或者小鼠的TGFi3 R1 3' UTR的載體會(huì)使得熒光量顯著下降，但是轉(zhuǎn)入含有人的 TGFi3 R1或者小鼠的TGFi3 1 3' UTR的報(bào)告載體則不會(huì)引起變化，這些說(shuō)明了它們的3' UTR 上沒(méi)有靶點(diǎn)位置。（圖Id和le)。
[0009] 因?yàn)閙iR-122的序列是脊椎動(dòng)物中相同的，我們開(kāi)始研究在不同物種中的 miR-122作用于TGFi3 1/TGF0 R1的靶點(diǎn)的保守程度。首先，我們實(shí)驗(yàn)測(cè)定了在恒河猴、豬、 大鼠中miR-122是否靶向于TGFi3 1/TGF0 R1，我們克隆了它們的3'UTR并分別構(gòu)建入熒光 素酶報(bào)告載體中（圖11)。令人意外的是，我們并沒(méi)有在這3個(gè)物種中的TGFi3 1/TGFi3Rl 3' UTR中發(fā)現(xiàn)任何的miR-122的靶點(diǎn)（圖ld，le)。然而，蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)卻顯示miR-122 能夠在大鼠和豬的細(xì)胞系中抑制TGF0R1的表達(dá)水平。所以，我們將研究的方向轉(zhuǎn)到了 TGF0 1/TGF0 R1 5' UTR 和編碼區(qū)區(qū)域（CDS)。
[0010] 我們將5個(gè)物種的5'UTR全長(zhǎng)克隆并構(gòu)建成熒光素酶報(bào)告載體（圖12)。其中僅 含有人和恒河猴TGF β 1 5'UTR的報(bào)告載體的熒光亮度能夠被miR-122顯著降低（圖2a和 圖13)。為了確定精確的靶點(diǎn)位置，我們構(gòu)建了一系列含有人TGF0 1 5'UTR截?cái)鄥^(qū)域的熒 光報(bào)告載體，發(fā)現(xiàn)當(dāng)這些載體中含有第4部分片段或者第7部分片段時(shí)，能夠被miR-122沉 默（圖2b)。出人意料地，含有第6部分片段的報(bào)告載體不受miR-122的影響。我們假設(shè) 因?yàn)榈?部分片段有很高的GC比例導(dǎo)致了其形成了比較穩(wěn)定的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，而接下來(lái)的 互換與突變實(shí)驗(yàn)很好地證明了這點(diǎn)（圖14)。序列比對(duì)分析和隨后的突變實(shí)驗(yàn)最終確定了 精確的靶點(diǎn)位置，miR-122的3'端能夠以一種非經(jīng)典的方式在該位置形成一個(gè)很強(qiáng)的堿基 互補(bǔ)配對(duì)（圖2c)。
[0011] 然后我們對(duì)動(dòng)物系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上的有代表性物種的該靶點(diǎn)位置進(jìn)行了基因組序列 分析。miR-122能夠顯著的抑制含有海牛TGF β 1 5'UTR的報(bào)告載體的熒光，而該保守5'UTR 對(duì)應(yīng)區(qū)域的第一位C堿基變成Τ堿基（圖2c，2d，圖15)。該保守序列中的第21位的C堿 基變成T堿基，同時(shí)如果伴隨著在第11位和第12位堿基之間插入一個(gè)或多個(gè)堿基，都會(huì) 或多或少地影響miR-122對(duì)該部分的抑制效果，例如在小鼠、大鼠、狗和豬等物種中。另外 在早期的脊椎動(dòng)物的TGFi3 1 5' UTR中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這些同源的序列，比如鳥(niǎo)或者魚(yú)，說(shuō)明該 miR-122的靶點(diǎn)位置是在非洲獸類(lèi)和靈長(zhǎng)類(lèi)的共同祖先時(shí)獲得的。
[0012] 接下來(lái)，我們?cè)赥GFf3 R1⑶S區(qū)域確定了一組可能為miR-122的靶點(diǎn)，該位置在所 有的脊椎動(dòng)物中高度保守（表S1)11。我們將這些保守的序列分別構(gòu)建入一個(gè)能表達(dá)熒光 素酶一綠色熒光蛋白融合蛋白的載體中間（圖2e)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明了再大鼠和豬 的TGFf3 R1CDS區(qū)域含有miR-122的靶點(diǎn)，但是在人和猴子中卻沒(méi)有，隨后的熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 也證明了這點(diǎn)（圖16)。通過(guò)對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中的代表性物種的miR-122靶點(diǎn)位置的基因組 比較分析，我們模擬追蹤了進(jìn)化軌跡?；诤?jiǎn)單的推理，我們發(fā)現(xiàn)在該靶點(diǎn)的獲得與缺失的 過(guò)程中共發(fā)生了三個(gè)事件（圖2f)。首先，在叢猴與人和狨猴的共同祖先之間出現(xiàn)分化時(shí)， 一個(gè)G變成A的突變（圖2f紅色）出現(xiàn)在人和狨猴的最近的祖先中，然后形成了猴子和其 他靈長(zhǎng)類(lèi)產(chǎn)生了目前保存的等位基因。該位置的突變導(dǎo)致了 miR-122和靶點(diǎn)位置的一個(gè)堿 基配對(duì)的缺失。然后，在人和黑猩猩最近的共同祖先中，第二個(gè)突變（A變成G，圖2f中藍(lán) 色）產(chǎn)生，這個(gè)突變進(jìn)一步降低了 miR-122和其靶點(diǎn)之間的親和力。同時(shí)另一方面，在小 鼠和大鼠最近的共同祖先中，一個(gè)G變成A的突變（圖2f中綠色）產(chǎn)生了一個(gè)和miR-122 的配對(duì)，進(jìn)一步加強(qiáng)了 miR-122和該靶點(diǎn)位置的親和力。因此，這些在進(jìn)化上有力地說(shuō)明了 miR-122在小鼠中靶向于TGF0 R1⑶S區(qū)域而在人中卻轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)GF0 1 5' UTR。
[0013] 基于miR-122是一個(gè)肝臟特異的小分子，TGF0R1的上升水平受肝臟細(xì)胞的局限。 然而，TGF β 1作為一種分泌蛋白，能夠調(diào)控鄰近細(xì)胞的功能。因此，我們假設(shè)miR-122在人 和小鼠中的缺失會(huì)導(dǎo)致不同的病理學(xué)影響，特別是在腫瘤的迀移方面。我們研究了 miR-122 介導(dǎo)的TGFi3 1/TGF0 R1抑制是否會(huì)影響上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變（EMT)，EMT是腫瘤 侵襲的早期表征。培養(yǎng)ifepG2或者Η印G2-122細(xì)胞48h之后，收集培養(yǎng)上清液。用該上清 液或者重組的TGFi3 1蛋白（終濃度為2. 5ng/ml)處理Huh7細(xì)胞。24h后蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)結(jié)果表明，HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清能夠和重組的TGFi3 1蛋白一樣，使huh7細(xì)胞內(nèi)的鈣黏 蛋白含量下降50%，同時(shí)使波形蛋白含量上升2倍（圖3a)。而h印G2-122細(xì)胞的培養(yǎng)上 清卻產(chǎn)生了與上面相反的變化。為了進(jìn)一步確認(rèn)miR-122能夠通過(guò)TGFi3 1調(diào)節(jié)EMT，我們 分別在IfepG2和！fepG2-122細(xì)胞的培養(yǎng)上清中加入了 TGFi3 1的中和抗體（TGFi3 Ι-Ab)和 TGF β 1。然后我們發(fā)現(xiàn)，TGF β Ι-Ab使!1印62細(xì)胞的培養(yǎng)上清的作用顛倒了過(guò)來(lái)，而16叩1 也使Η印G2-122的培養(yǎng)上清作用相反。這些結(jié)果都與免疫熒光結(jié)果一致（圖3b)。
[0014] 對(duì)Hepal-6和過(guò)表達(dá)miR-122海綿的hepal-6細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行上面同樣的處 理，在兩種情況下，鈣黏蛋白和波形蛋白都沒(méi)有展現(xiàn)出差異（圖3c，3d)。為了確認(rèn)小鼠的 TGFf3 1能夠引起人細(xì)胞的EMT，將重組的小鼠 TGFf3 1加到huh7細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)基中時(shí)， 鈣黏蛋白的表達(dá)量下降了 4倍，同時(shí)波形蛋白則上升了 2. 5倍。
[0015] VEGF是另外一個(gè)關(guān)