一株唾液乳桿菌xjp2及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明主要涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株唾液乳桿菌XJP2及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 正常情況下，腸道菌群與動(dòng)物機(jī)體保持著平衡關(guān)系，維持機(jī)體的健康狀態(tài):一方面 通過(guò)菌膜屏障或競(jìng)爭(zhēng)排斥作用于進(jìn)入機(jī)體的病原菌爭(zhēng)奪黏膜附著位點(diǎn)，使病原菌無(wú)法定 植，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，降低發(fā)病率;另一方面菌群參與機(jī)體的物質(zhì)代謝，營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化與合成等， 促進(jìn)動(dòng)物健康生長(zhǎng)。乳酸菌是動(dòng)物體內(nèi)的有益菌群之一，是動(dòng)物腸道的正常定植菌群，具有 生物拮抗、改善動(dòng)物腸道生態(tài)環(huán)境、提高動(dòng)物免疫力等多種作用，已被廣泛地應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng) 殖中。
[0003] 目前，乳酸菌的研究與應(yīng)用較多，市場(chǎng)相關(guān)產(chǎn)品種類繁多，但共同的問(wèn)題是乳酸菌 對(duì)酸、膽鹽的耐受性較差，能否定植于腸道黏膜，在腸道中長(zhǎng)期生存并發(fā)揮作用。乳酸菌攝 入后只有在消化道黏膜粘附、定植，才可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性排斥抑制病原菌繁殖，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物或 生理活性物質(zhì)殺滅有害病原微生物，進(jìn)而達(dá)到恢復(fù)宿主抵抗力，修復(fù)腸道菌群屏障，治愈腸 道疾病的作用。所以篩選能在動(dòng)物消化道黏膜上定植的菌種至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一株唾液乳桿菌XJP2及其應(yīng)用，所述唾液乳桿菌XJP2具有較好的酸 耐受性和膽鹽耐受性，可在腸道內(nèi)粘附定植，同時(shí)還可預(yù)防肉雞細(xì)菌性腹瀉，具有調(diào)節(jié)腸道 菌群的作用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
[0006] 本發(fā)明提供了一株唾液乳桿菌XJP2,其分類命名為唾液乳桿菌Lactobacillus salivarius，其保藏編號(hào)為CGMCC No · 11386。
[0007] 進(jìn)一步的:所述唾液乳桿菌XJP2呈革蘭氏陽(yáng)性，菌落圓形，邊緣整齊，乳白色，菌落 光滑平整。
[0008] 進(jìn)一步的:所述唾液乳桿菌XJP2培養(yǎng)20h后L-乳酸產(chǎn)量大于18.2g/L。
[0009] 進(jìn)一步的:所述唾液乳桿菌XJP2對(duì)酸、膽鹽具有較好的耐受性。
[0010] 本發(fā)明還提供了所述的唾液乳桿菌XJP2在制備用于肉雞養(yǎng)殖的微生態(tài)添加劑中 的應(yīng)用。
[0011] 進(jìn)一步的:所述唾液乳桿菌XJP2能顯著提高盲腸中乳酸菌數(shù)量。
[0012] 進(jìn)一步的:所述唾液乳桿菌XJP2能預(yù)防肉仔雞細(xì)菌性腹瀉。
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果:本發(fā)明從健康肉雞盲腸黏膜 中篩選到一株唾液乳桿菌XJP2，可在動(dòng)物腸道粘附定植;對(duì)酸和膽鹽具有較好的耐受性;而 且唾液乳桿菌XJP2體外培養(yǎng)繁殖快，可用于微生態(tài)制劑的開發(fā)，應(yīng)用于肉雞養(yǎng)殖中，具有預(yù) 防細(xì)菌性腹瀉、調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群的功能。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為所述唾液乳桿菌XJP2在MRS平板上的菌落形態(tài)；
[0015] 圖2為所述唾液乳桿菌XJP2生長(zhǎng)曲線；
[0016] 圖3為所述盲腸食糜樣品DGGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 結(jié)合以下具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0018] 實(shí)施例1、唾液乳桿菌的篩選
[0019] 1、唾液乳桿菌XJP2的分離篩選
[0020] 以健康肉雞為樣品，用無(wú)菌載玻片刮取盲腸黏膜于無(wú)菌水中，振蕩混勻進(jìn)行梯度 稀釋，MRS培養(yǎng)基傾注培養(yǎng)篩選"溶鈣圈"明顯的菌落，多次純化后得到單菌落，命名為XJP2， 保存。所述MRS培養(yǎng)基為培養(yǎng)乳酸菌的通用培養(yǎng)基，其配方為:蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L， 酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，吐溫80lml/L，磷酸氫二鉀2g/L，乙酸鈉5g/L，檸檬酸三銨2g/L， 硫酸鎂0 · 58g/L，硫酸錳0 · 25g/L，碳酸鈣5g/L，pH 6 · 2。
[0021] 所述菌株XJP2在MRS平板的菌落形態(tài)如圖1所示，其生物學(xué)特性:革蘭氏陽(yáng)性、鏡檢 為短桿狀;菌落圓形、光滑平整，邊緣整齊，較濕潤(rùn)，乳白色。生理生化指標(biāo)顯示菌株XJP2不 能還原硝酸鹽，不液化明膠，不產(chǎn)生吲哚和硫化氫，且接觸酶試驗(yàn)陰性。
[0022] 2、唾液乳桿菌XJP2的16S rRNA序列測(cè)定
[0023]以所述菌株XJP2的DNA為模板，16S rRNA通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段進(jìn)行序列測(cè) 定;Blast比對(duì)顯不該菌株序列與GenBank基因庫(kù)中Lactobacillus salivarius的16s rRNA 序列同源度最高，同源率為99%。通過(guò)DNAMAN6.0對(duì)Genbank中已有的乳桿菌屬的16S rRNA 序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，菌株XJP2與Lactobacillus salivarius同源性最高，判 定該菌株XJP2為唾液乳桿菌。
[0024]將篩選到的菌株XJP2進(jìn)行菌種保藏，保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì) 普通微生物中心(CGMCC);地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究 所;保藏日期:2015年9月16日；唾液乳桿菌Lactobacillus sal ivar ius的保藏編號(hào)為CGMCC Νο·11386〇
[0025] 實(shí)施例2、唾液乳桿菌XJP2的生長(zhǎng)測(cè)定
[0026] 將活化的XJP2菌液以1 % (約107cfu/mL)的接種量接種于所述MRS液體培養(yǎng)基中， 37°C，160rpm培養(yǎng)24h，每隔3h取樣，在600nm下測(cè)定吸光值，繪制生長(zhǎng)曲線圖。如圖2所示，實(shí) 驗(yàn)結(jié)果表明，XJP2培養(yǎng)3h即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12h進(jìn)入穩(wěn)定期。培養(yǎng)20h時(shí)L-乳酸產(chǎn)量為 18.2g/L〇
[0027] 實(shí)施例3、唾液乳桿菌XJP2對(duì)酸、膽鹽的耐受性測(cè)定
[0028] 將活化的XJP2菌液以1 % (約107cfu/mL)的接種量分別接種于pH為2.5、3.5、4.5的 MRS培養(yǎng)基中，37 °C靜置培養(yǎng)。在Oh、2h、4h取樣，MRS傾注計(jì)數(shù)。用同樣的方法處理菌株，將菌 液接種于豬膽鹽濃度為〇 .1%、0.2%、0.3%的MRS培養(yǎng)基中，37 °C靜置培養(yǎng)。在Oh、2h、4h取 樣，MRS傾注計(jì)數(shù)。
[0029]從表1、表2結(jié)果可以看出，菌株XJP2對(duì)酸、膽鹽具有較好的耐受性，pH 2.5或0.3%
[0031] 膽鹽的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)2h后活菌存活率均超過(guò)70%，具有較好的抗逆性。[0030] 表1菌株XJP2對(duì)酸耐受性結(jié)果(cfu/mL)
[0032]
[0033]
[0034] 實(shí)施例4、唾液乳桿菌XJP2預(yù)防肉雞細(xì)菌性腹瀉試驗(yàn)
[0035]選1日齡肉仔雞100只，隨機(jī)分為2組，每組100只。試驗(yàn)組飲水中添加唾液乳桿菌菌 液，添加量為l〇6cfu/L，對(duì)照組不添加菌液，兩組均按正常程序飼喂，觀察、統(tǒng)計(jì)腹瀉率，成 活率。試驗(yàn)期間，試驗(yàn)組成活率明顯高于對(duì)照組，腹瀉死亡率比對(duì)照組減少85%，試驗(yàn)表明 所述唾液乳桿菌XJP2對(duì)預(yù)防肉仔雞細(xì)菌性腹瀉，減少死亡率具有顯著效果。
[0036]實(shí)施例5、唾液乳桿菌XJP2對(duì)肉雞體內(nèi)益生作用試驗(yàn)
[0037]試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，135只健康1日AA肉雞隨機(jī)分為3組，每組3個(gè)重復(fù)， 每個(gè)重復(fù)15只雞。對(duì)照組日糧和飲水中不添加唾液乳桿菌，試驗(yàn)組日糧中分別添加106cfu/ g、107cfu/g唾液乳桿菌，42日齡取盲腸食糜樣品，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定樣品總菌、乳酸桿 菌、大腸桿菌菌量;DGGE分析總菌多樣性。表3和表4實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，日糧中添加10 7cfu/g唾 液乳桿菌XJP2,可顯著提高盲腸中乳酸菌數(shù)量(P〈0.05);提高腸道菌群多樣性（如圖3所 示），對(duì)腸道菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用。
[0038]表3盲腸內(nèi)容物菌數(shù)結(jié)果(Log cfu/g)
[0039]
[0040]
[0041]
[0042] 以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其進(jìn)行限制；盡管參照前述實(shí) 施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，依然可以對(duì)前述實(shí)施 例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換;而這些修改或替 換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案的精神和范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株唾液乳桿菌XJP2,其特征在于：其分類命名為唾液乳桿菌Lactobacillus salivarius，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 11386。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的唾液乳桿菌XJP2,其特征在于:所述唾液乳桿菌XJP2呈革蘭氏 陽(yáng)性，菌落圓形，邊緣整齊，乳白色，菌落光滑平整。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的唾液乳桿菌XJP2，其特征在于:所述唾液乳桿菌XJP2培養(yǎng)20h 后L-乳酸產(chǎn)量大于18.2 g/L。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的唾液乳桿菌XJP2，其特征在于:所述唾液乳桿菌XJP2對(duì)酸、膽 鹽具有較好的耐受性。5. 權(quán)利要求1所述的唾液乳桿菌XJP2在制備用于肉雞養(yǎng)殖的微生態(tài)添加劑中的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的唾液乳桿菌XJP2在制備用于肉雞養(yǎng)殖的微生態(tài)添加劑中的應(yīng) 用，其特征在于:所述唾液乳桿菌XJP2能顯著提高盲腸中乳酸菌數(shù)量。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的唾液乳桿菌XJP2在制備用于肉雞養(yǎng)殖的微生態(tài)添加劑中的應(yīng) 用，其特征在于:所述唾液乳桿菌XJP2能預(yù)防肉仔雞細(xì)菌性腹瀉。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一株唾液乳桿菌XJP2及其應(yīng)用，本發(fā)明提供的唾液乳桿菌XJP2分離自健康肉雞盲腸黏膜，所述唾液乳桿菌<i>Lactobacillus？salivarius？</i>XJP2保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC？No.11386。所述唾液乳桿菌XJP2對(duì)酸、膽鹽具有較好的耐受性，可在動(dòng)物腸道定植。所述唾液乳桿菌XJP2體外培養(yǎng)繁殖快，且L-乳酸產(chǎn)量高，具有預(yù)防肉雞細(xì)菌性腹瀉，改善腸道菌群等功能，可用于微生態(tài)制劑的開發(fā)。CGMCC No. 1138620150916
【IPC分類】A23K50/75, C12R1/225, C12N1/20, A23K10/18
【公開號(hào)】CN105624071
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610152385
【發(fā)明人】王嬌, 王欣志, 于剛, 趙世偉, 張大偉, 趙志強(qiáng), 王政
【申請(qǐng)人】青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司
【公開日】2016年6月1日
【申請(qǐng)日】2016年3月17日