菌（化lanaerobi皿 hy化ogeniformans)
[0047] 產(chǎn)氨鹽厭氧菌(原先稱為鹽厭氧菌株系"sapolanicus")分離自華盛頓州皂湖的嗜 堿(抑約10，15-至140-肖/升化(：1)厭氧沉積物，該處具有高達(dá)10肖/升的極高硫化物濃度。其 為絕對厭氧、革蘭氏陰性、不動、不結(jié)抱子的細(xì)長桿狀細(xì)菌（圖2)。其能夠利用C5-C6范圍的 糖，在抑ll、7%(wt/vol)化α和33°C下具有最優(yōu)生長，生成乙酸鹽、甲酸鹽，和氨作為主要 代謝終端產(chǎn)物。測定產(chǎn)氨鹽厭氧菌的基因組序列來促進(jìn)對其代謝和生物能源潛力的評估， 特別是改善堿性或鹽堿性預(yù)處理方案供于該細(xì)菌的強(qiáng)健氨生成。通過與億明達(dá)(Illumina) (Bennett，S. 2004.索來科薩（Solexa)有限公司基因測試學(xué)5:433-438)和454(Ma巧ulies, Μ.等.2005."微制造高密度皮升反應(yīng)器中的基因組測序"（Genome sequencing in microfabricated high density picolitre reactors) .Nature 437:376-380.)技術(shù)耳關(guān)合 來測定該產(chǎn)氨鹽厭氧菌的基因組序列。聯(lián)合基因組研究院(Joint Genome Institute)構(gòu)建 并測序了億明達(dá)GAi i鳥槍文庫，其產(chǎn)生27，639，916個讀數(shù)，總計2，100Mb，從77，351個讀數(shù) 生成454個鐵標(biāo)準(zhǔn)文庫，W及產(chǎn)生160，293個讀數(shù)總計82.3Mb的454數(shù)據(jù)的具有10.607 ± 2.65 Ikb的平均插入大小的雙端454文庫。有必要采用486個額外的反應(yīng)和6個散開 (shatter)文庫來縮近缺口并產(chǎn)生最終的序列質(zhì)量。用于測定基因組序列的方法已于先前 描述化Ikins，J. G.等，2010 /'纖維素分解性極端嗜熱嗜熱厭氧菌0B47T的完全基因組序 列".J.Bacteriol.doi :10.1128/JB. 00950-10)，并且運(yùn)是是"最終的"基因組（Chain， P. S.G.等.2009 /'測序新紀(jì)元中的基因組工程標(biāo)準(zhǔn)".Science 326:236-237)?？偦蚪M大 小是2，613，116bp，基于52.2Mb的454草擬數(shù)據(jù)的最終組裝提供平均21.5X的基因組覆蓋率， 而463Mb的億明達(dá)草擬數(shù)據(jù)提供平均178X的基因組覆蓋率?；蚪M是33.1 %G+C且包含2， 295個編碼候選蛋白質(zhì)的基因模型。所述基因組包含四種分離的rRNA操縱子，其各自含有 55、165(沈9 10^:1)和238誠酷基因，其中168誠酷基因之間具有99.9-100%的相同性。 最接近的顯著16S rRNA基因匹配(GenBank登錄號GQ215697)是其它鹽厭氧菌物種。然而，所 有競爭性的物種因其為嗜中性而均具有生理學(xué)差異。該全基因組鳥槍工程已登記于DDBJ/ EMBL/GenBank，登錄號 CP002304。
[004引實(shí)施例2
[0049] 從甘油產(chǎn)生1，3-丙二醇
[00加]培養(yǎng)基包括（每升）：70g化Cl、40g化2C〇3、6.3g K2冊〇4、lg酵母提取物、0.75g 化2S(作為還原劑）、0.6g半脫氨酸（作為還原劑），W及10ml的基礎(chǔ)培養(yǎng)基儲液和10ml的痕 量礦物溶液?；A(chǔ)培養(yǎng)基儲液包含(每升）：50mg NH4N〇3、8.5mg MgCb·細(xì)2〇、7.5mg Si〇2、 4.5mg MnS〇4 ·出0、4.2mg CaCb · 2出0、4mg亞甲藍(lán)（作為氧指標(biāo)），和 1.8mg FeS〇4 · 7此0。痕 量礦物溶液包含（每升）：3g MgS〇4?7H2〇、1.63g 化廠NTA、lg 化Cl、0.64g MnCl2*4出0、 0.13gZnCl2、0.1gFeS04*7H20、0.1gCaCl2*2H20、0.1gCoCl2*6H20、0.03gNiS04· 細(xì)2〇、0.025g 化2M0O4 · 2此0、0.025g 化2WO4 · 2此0、0.01g A化（S〇4)2 · 12出0、0.01g 曲B03 和7mg Q1CI2 · 2出0。
[0051] 培養(yǎng)物瓶用50mL的培養(yǎng)基配備，然后補(bǔ)充2.5mL的600mM甘油儲液(至終濃度為約 25mM甘油）。培養(yǎng)瓶還補(bǔ)充2.5血的12祉g/mL維生素 Bi2溶液(至終濃度為約53.3化g/L)。更換 頂部空間氣體W包含100%化。所述樣品在30°C于振蕩解育箱中W15化pm解育屯天。來自用 甘油更改的培養(yǎng)物的結(jié)果示于下表1。立個重復(fù)用甘油和細(xì)菌補(bǔ)充。一個用甘油補(bǔ)充的培養(yǎng) 物不接種細(xì)菌。Ξ個額外的重復(fù)補(bǔ)充有甘油和維生素 Bi2。一個用甘油和維生素 Bi2補(bǔ)充的培 養(yǎng)物不接種細(xì)菌。運(yùn)些結(jié)果清楚顯示細(xì)菌消耗了甘油補(bǔ)充物。還補(bǔ)充有維生素 Bi2的那些培 養(yǎng)物能比沒有用該維生素補(bǔ)充的那些消耗更大量的甘油。
[0052] 表1.
[0化3]
[0054]表2顯示補(bǔ)充有甘油的培養(yǎng)物的結(jié)果。Ξ個重復(fù)補(bǔ)充有甘油和細(xì)菌。用甘油補(bǔ)充的 一個培養(yǎng)物不接種細(xì)菌。Ξ個額外的重復(fù)補(bǔ)充有甘油和維生素 Βι2。用甘油和維生素 Βι2補(bǔ)充 的一個培養(yǎng)物不接種細(xì)菌。運(yùn)些結(jié)果清楚顯示所述細(xì)菌能夠產(chǎn)生1,3-丙二醇。還補(bǔ)充有維 生素 Βι2的那些培養(yǎng)物能產(chǎn)生比沒有用該維生素補(bǔ)充的那些更大量的1,3-丙二醇。
[0化5] 表2.
[0化6]
[005引討論
[0059]標(biāo)準(zhǔn)曲線示于圖3-6。分析第0天和第7天甘油和甘油+Βι2處理組之間的差異。檢測 甘油消耗和1,3-丙二醇生成。還檢測乙酸鹽生成來確定相較于甘油脫水酶通路的甘油激酶 通路的活性。在沒有蛋白質(zhì)分析的情況下，生長的準(zhǔn)確測量是不可行的，但乙酸鹽的生成能 夠至少指示發(fā)生的發(fā)酵，并且估計有多少甘油量被用于丙酬酸鹽代謝而非1,3-丙二醇生 成。
[0060] 圖7中的散點(diǎn)圖顯示培養(yǎng)物W大致相同的甘油濃度起始，然而在7天后，補(bǔ)充有Bi2 的培養(yǎng)物(右側(cè)，5-8000)利用了甘油總量中的更多量。
[0061] 圖8中的散點(diǎn)圖顯示，在極端條件下觀察到來自細(xì)菌的1,3-丙二醇生成，并且當(dāng)Bi2 被補(bǔ)充至該生物體時產(chǎn)量增加。對于乙酸鹽W粗略測試伴隨正常代謝活性的"生長"，補(bǔ)充 有Bi2的培養(yǎng)物中的峰面積和峰高約為僅甘油培養(yǎng)物的一半，運(yùn)有助于解釋生長下降。進(jìn)行 快速成對T檢驗W確定甘油和甘油+Bi2培養(yǎng)物中的濃度差異是顯著的。兩個P值均<0.001指 示統(tǒng)計學(xué)顯著地生成1，3-丙二醇。
[0062] 第0天的瓶中甘油終濃度是約25.3mM，并且我們產(chǎn)出了約12mM 1,3-丙二醇，獲得 約0.47的mol/mol比，然而Bi2補(bǔ)充<64yg/mL，運(yùn)歸因于接種物的稀釋和碳源的添加。
[0063] 實(shí)施例3
[0064] Bi2的需求
[0065] 厭氧培養(yǎng)物在160mL血清瓶中制備。通過在化覆蓋下煮沸脫氣來制備培養(yǎng)基。培養(yǎng) 基冷卻時，向培養(yǎng)基添加反應(yīng)物儲液混合物，其包含0.75g化2S和0.6g半脫氨酸/升。一旦 培養(yǎng)基冷卻，將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至Coy厭氧手套袋，其中將50mL的培養(yǎng)基分散于填充并高壓蒸汽 處理的（121°C，20分鐘）的160mL血清瓶。高壓滅菌后，頂部空間氣體用80 %化/20 % C〇2混合 物交換。然后，用來自先前儲存的培養(yǎng)物的10%接種物接種所述瓶。添加30mM甘油。缺氧下 補(bǔ)充維生素 Bi2,無菌過濾的儲液在^化旨/1、254旨/1、5化旨/1、754旨/1和10〇4旨/1的接種即刻 前添加。
[0066] 每24小時取樣。5mL注射器用化/0)2混合物脫氣，然后從各取樣階段移出ImL培養(yǎng)物 樣品。將樣品置于1.5mL Eppendo計管，并Wl3,000x g離屯、5分鐘。將上清液輕輕倒入另一 個1.5mL Eppendorf管，并冷凍用于HPLC分析。
[0067] 對于冊LC分析，無菌過濾的樣品（0.4化Μ PTFE濾器）被注射至保持在50°C下的 300x 7.8mm Aminex HPX-87H柱(伯樂，加利福尼亞州海格拉斯）。流動相是W〇.6ml/分鐘的 流速保持在大約2.2M化下的2.5mM出S化。采用UV 231 (210nm)和折射率檢測器進(jìn)行檢測。
[0068] 獲