一種同步檢測三種柑橘病毒的RT-qPCR試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物病毒診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種同步檢測CYVCV、CTV和CTLV的 三種柑橘病毒的RT-qPCR試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 柑橘是世界第一大水果和全球第五大貿(mào)易農(nóng)產(chǎn)品。2013年，我國柑橘栽培面積 3633萬畝，產(chǎn)量3321萬噸，均居世界第一位。近年來，隨著柑橘產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，柑橘發(fā)生多 病原混合感染及繼發(fā)感染的情況越來越普遍。柑橘黃脈病毒、柑橘衰退病毒及柑橘碎葉病 毒這三種病毒在生產(chǎn)上流行范圍廣、為害較大，且存在混合侵染的情況，對我國柑橘產(chǎn)業(yè)安 全構(gòu)成威脅。柑橘黃化脈明病毒引起的柑橘黃脈病是新近發(fā)生的一種病害。檸檬和酸橙感 染CYVCV后，樹勢減弱、產(chǎn)量降低，嚴(yán)重影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。自2009年在我國云南瑞麗首次發(fā)現(xiàn) 以來，柑橘黃脈病在四川安岳、重慶等地也有發(fā)生，對部分地區(qū)的檸檬產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生了比較嚴(yán)重 的影響。CYVCV是α線性病毒科(Alphaf lexiviridae)印度柑橘病毒屬(Mandarivirus)病毒， 除可接傳播，還可能通過粉虱和蚜蟲傳播，因而具有大面積傳播流行風(fēng)險(xiǎn)，對柑橘產(chǎn)業(yè)尤其 是檸檬產(chǎn)業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。柑橘衰退病毒引起的柑橘衰退病是世界范圍內(nèi)一種極具經(jīng)濟(jì)重 要性的病害，對世界柑橘產(chǎn)業(yè)造成過嚴(yán)重為害，目前依然威脅著以酸橙為砧的柑橘和對CTV 莖陷點(diǎn)型株系敏感的葡萄柚、柚和甜橙的生產(chǎn)。雖然我國生產(chǎn)中多用抗病或耐病砧木，但廣 泛分布著CTV的各種強(qiáng)毒株和強(qiáng)力傳媒褐色桔蚜，隨甜橙等的大發(fā)展，CTV莖陷點(diǎn)型強(qiáng)株系 的為害日趨嚴(yán)重。柑橘碎葉病毒引起的柑橘碎葉病是威脅柑橘生產(chǎn)的重要病害之一?，F(xiàn)已 報(bào)道發(fā)生柑橘碎葉病的國家有日本、美國、南非、澳大利亞和中國，其中以中國和日本發(fā)生 最為普遍。CTLV在我國的浙江、湖南、福建和廣西等地的局部地區(qū)已造成比較嚴(yán)重的為害。 目前，用于上述單一病毒檢測的方法較多，例如指示植物檢測鑒定、電鏡觀察、酶聯(lián)免疫 (ELISA)、直接組織點(diǎn)免疫(DTBIA)，分子探針雜交等技術(shù)，并在生產(chǎn)中得到推廣應(yīng)用。隨著 分子生物學(xué)的發(fā)展，RT-PCR檢測方法以其速度快、靈敏度高、特異性好等特點(diǎn)受到青睞。巢 式RT-PCR，免疫捕獲RT-PCR等則進(jìn)一步提高了檢測靈敏度或便捷性。
[0003] 但是，生物學(xué)檢測方法如指示植物鑒定耗時(shí)長且受環(huán)境等諸多條件限制，費(fèi)時(shí)費(fèi) 力；血清學(xué)方法尤其DTBIA，操作簡便，成本低廉，適合田間樣品大規(guī)模檢測，但其靈敏度及 準(zhǔn)確性有待提高;分子生物學(xué)方法如RT-qPCR檢測法快速、靈敏、特異，是目前采用的主要檢 測方法之一，但也存在需要多次分病毒繁瑣操作，時(shí)間成本高，污染幾率較大，并且需要接 觸有毒物質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種同步檢測三種柑橘病毒的RT-qPCR試劑盒，旨在解決 生物學(xué)檢測方法受環(huán)境條件限制，費(fèi)時(shí)費(fèi)力;血清學(xué)方法靈敏度及準(zhǔn)確性較低;分子生物學(xué) 方法存在需要多次分病毒繁瑣操作，時(shí)間成本高，污染幾率較大，需要接觸有毒物質(zhì)的問 題;并進(jìn)一步提高檢測靈敏度。
[0005] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種同步檢測三種柑橘病毒的RT-qPCR試劑盒，所述同步檢 測三種柑橘病毒的RT-qPCR試劑盒對CYVCV、CTV、CTLV三種病毒的特異引物同管混合包裝， CYVCV、CTV、CTLV三種病毒上下游引物濃度分別為：CYVCV1.3yM、CTVl. 0yM、CTLV2.7μΜ; CYVCV、CTV、CTLV三種病毒擴(kuò)增產(chǎn)物特征Tm值范圍：CYVCV為86.25 ± 0.35°C、CTLV為84.00 土 0.25。(3、(：17為81.25±0.25。(3;
[0006] CYVCV、CTV、CTLV三種病毒特異性RT-qPCR引物序列如下：
[0007] CYVCV-F：TCAAACCTCCAACGCACAAAC；
[0008] CYVCV-R：CATTGTTGTGGGTTTTTGCTTC；
[0009] CTV-F：GTGTGCAGATTTCTTGACCG；
[0010] CTV-R：TCCCAAGCTGCCTGACATT；
[0011] CTLV-F：AGTTTGGAAGACGTGCTTCA；
[0012] CTLV-R：TGCAGAGAAGAAGGTAAAGCTC 〇
[0013] 進(jìn)一步，所述同步檢測三種柑橘病毒的RT-qPCR試劑盒還包括:RT-qPCR反應(yīng)液、 RT-Taq酶、陽性對照品、陰性對照品、標(biāo)準(zhǔn)品和無核酸超純水。
[0014] 進(jìn)一步，所述熒光定量RT-qPCR反應(yīng)液包含熒光染料EvaGreen、氯化鎂和三磷酸脫 氧核糖核苷酸。
[0015] 進(jìn)一步，所述陽性對照品為:含CYVCV、CTV和CTLV片段重組質(zhì)?；旌掀罚瑵舛染鶠?200ng/yl〇
[0016] 進(jìn)一步，所述陰性對照品為:健康柑橘葉片總核酸提取液。
[0017] 進(jìn)一步，所述定量RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)品由以下3種標(biāo)準(zhǔn)品組成：CYVCV標(biāo)準(zhǔn)品、CTV標(biāo)準(zhǔn) 品、CTLV標(biāo)準(zhǔn)品。
[0018] 進(jìn)一步，所述同步檢測三種柑橘病毒的RT-qPCR試劑盒避光保存于-20度。
[0019]本發(fā)明的另一目的在于提供一種同步檢測三種柑橘病毒的RT-qPCR試劑盒的使用 方法，所述使用方法包括：
[0020]樣品總核酸提?。菏褂贸Ｒ?guī)方法或核酸抽提試劑盒從待測樣品葉片中提取總核 酸，即可作為RT-qPCR模板；
[0021] 一步法多重實(shí)時(shí)熒光RT-qPCR:分別取2 . ΟμL模板、陽性對照品、陰性對照品，依次 加入RT-qPCR反應(yīng)液12.5μ1，RT-Taq酶0.3μ1，CYVCV、CTV和CTLV特異性引物混合物1.5μ1，加 ddH20 至反應(yīng)體系總體積為 25μ1;反應(yīng)參數(shù)為：45°C30min; 95°C5min; 95°C 15s，60°Clmin，40 個(gè)循環(huán);熔解曲線程序?yàn)?5°C15s，60°Clmin，95°C15s;從60°C開始收集熒光信號(hào)；
[0022 ]標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:分別取CYVCV、CTV和CTLV標(biāo)準(zhǔn)品用無菌雙蒸水進(jìn)行10倍梯度系列 稀釋至1 X ΙΟ*3~1 X 107CopiesAU，然后采用上述方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR反應(yīng)，擴(kuò)增 完成后，以Ct值為縱坐標(biāo)，l 〇g1QX為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0023]結(jié)果判斷：在正負(fù)對照均符合預(yù)期的前提下，通過熔解曲線峰值高低及有無來判 定檢測樣品是否為陽性，如果溶解曲線CYVCV、CTLV和CTV對應(yīng)的Tm值處產(chǎn)生特異熔解峰，即 CYVCV為86.25 ± 0.35°C、CTLV為84.00 ± 0.25°C、CTV為81.25 ± 0.25°C，則相應(yīng)病毒為檢測 陽性，即待測樣品攜帶相應(yīng)病毒，反之，則為檢測陰性，即沒有攜帶相應(yīng)病毒;如果檢測結(jié)果 為陽性，根據(jù)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測樣品Ct值，計(jì)算待測樣本病毒濃度。
[0024] 本發(fā)明運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR技術(shù)，采用CYVCV、CTLV和CTV的特異性引物，開 發(fā)出一種同步檢測柑橘黃脈病毒、柑橘衰退病毒及柑橘碎葉病毒的一步法同步檢測三種柑 橘病毒的RT-qPCR試劑盒。本發(fā)明通過一個(gè)RT-qPCR反應(yīng)可以從樣本中同時(shí)檢測出CYVCV、 CTLV和CTV的存在，并且能夠?qū)Υ龣z測病毒進(jìn)行準(zhǔn)確定量。與傳統(tǒng)的普通RT-qPCR相比，本發(fā) 明提升了 CYVCV、CTLV和CTV檢測靈敏度100倍以上;僅需一個(gè)步驟完成檢測，操作更簡便并 可以減少污染導(dǎo)致假陽性幾率30%;不必單獨(dú)逆轉(zhuǎn)錄及電泳，省時(shí)3倍以上;在診斷病害發(fā) 生和監(jiān)控病害流行及維護(hù)柑橘產(chǎn)業(yè)安全等方面具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0025]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的同步檢測三種柑橘病毒的RT-qPCR試劑盒使用方法流 程圖。
[0026]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的三種病毒(CYVCV、CTLV和CTV)混合侵染柑橘樣品進(jìn)行 同步實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR檢測實(shí)例示意圖。
[0027] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線及病毒定量示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0029] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。
[0030] 本發(fā)明實(shí)施例的同步檢測三種柑橘病毒的RT-qPCR試劑盒包括如下3對病毒特異 性RT-qPCR引物，其序列如下：
[0031] SEQ ID N0：1,CYVCV-F：TCAAACCTCCAACGCACAAAC；
[0032] SEQ ID NO：2,CYVCV-R：CATTGTTGTGGGTTTTTGCTTC；
[0033] SEQ ID NO：3,CTV-F：GTGTGCAGATTTCTTGACCG；
[0034] SEQ ID NO：4,CTV-R：TCCCAAGCTGCCTGACATT；
[0035] SEQ ID NO：5,CTLV-F：AGTTTGGAAGACGTGCTTCA；
[0036] SEQ ID NO：6,CTLV-R：TGCAGAGAAGAAGGTAAAGCTC〇
[0037] 所述試劑盒，CYVCV、CTV、CTLV三種病毒的特異引物同管混合包裝，各病毒上下游 引物濃度為:CYVCV1.3yM、CTVl. 0yM、CTLV2.7μΜ。
[0038] 所述試劑盒，各病毒擴(kuò)增產(chǎn)物特征Tm值范圍：CYVCV為86.25 ± 0.35°C、CTLV為 84.00±0.25。(3、(：17為81.25±0.25。(3。
[0039] 所述試劑盒還包括:a)RT_qPCR反應(yīng)液、b)陽性對照品、c)陰性對照品、d)標(biāo)準(zhǔn)品、 e) RT-Taq酶和f)無核酸超純水。