一株樺褶孔菌及其在烯酰嗎啉殘留降解中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境微生物領(lǐng)域，是利用微生物的方法降解化學(xué)農(nóng)藥殘留，涉及一株樺裙孔菌菌株Lenzites betulina Y4962及其在烯酰嗎啉農(nóng)藥殘留降解中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]微生物降解是近年來廣泛興起的使用微生物對農(nóng)藥等有機污染物殘留進行生物降解的熱點研究領(lǐng)域。該技術(shù)通過微生物菌體的降解和吸附作用將有機污染物大分子分解成小分子化合物，并使其喪失生物活性并對環(huán)境無害。由于微生物個體小、繁殖迅速、比表面大等特點，它們較之其它生物更易適應(yīng)環(huán)境，并可通過自然突變產(chǎn)生新菌種，產(chǎn)生新的酶系統(tǒng)，獲得新的代謝途徑，從而可參與對農(nóng)藥等有機污染物的降解與轉(zhuǎn)化作用，因此微生物對降解農(nóng)藥殘留具有巨大潛力。
[0003]白腐真菌是一類能夠生長在木材基質(zhì)上，造成木材白色腐朽的一類高等擔子菌，產(chǎn)生的非特異性胞外酶系漆酶(Laccase)、木質(zhì)素過氧化物酶(Lignin peroxidase)和猛過氧化物酶(Manganese peroxidase)除了能夠降解木材中的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素夕卜，還能夠有效降解多種環(huán)境污染物，包括目前很多種類的多環(huán)芳烴、人工合成染料及化學(xué)農(nóng)藥。白腐真菌種類豐富，種類間以及相同種類的不同菌株對環(huán)境污染物的降解能力具有明顯差異，因此獲得對化學(xué)農(nóng)藥的高效降解菌株并運用于實踐，對降低環(huán)境中農(nóng)藥殘留的危害具有重要意義。烯酰嗎啉是專一殺卵菌的殺菌劑，能夠破壞卵菌細胞壁膜的形成而使病菌死亡。而作為高等擔子菌的樺褶孔菌，由于不具有烯酰嗎啉的作用位點，烯酰嗎啉對其是無作用效果的。
[0004]本專利是從原始森林的腐木上分離得到的一株高效降解卵菌殺菌劑——烯酰嗎啉的白腐真菌樺裙孔菌Lenzites betulina Y4962。實驗表明烯酰嗎啉不對該菌產(chǎn)生任何抑制和殺滅作用，反而能夠在水瓊脂培養(yǎng)基中利用烯酰嗎啉作為唯一碳源和能源而生長；在添加外源營養(yǎng)物的液體培養(yǎng)條件下，該菌96h能夠?qū)⒒烊肱囵B(yǎng)基中10mg/L的高濃度烯酰嗎啉降解72%以上。充分說明該菌可以用于水體及農(nóng)產(chǎn)品表面殘留的烯酰嗎啉的生物降解。目前尚無利用Lenzites betulina降解烯酰嗎啉農(nóng)藥殘留研究的文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一株樺褶孔菌菌株及其在烯酰嗎啉殘留降解中的應(yīng)用，該菌株具有在水體殘留及表面殘留的烯酰嗎啉的生物降解的工業(yè)化應(yīng)用前景。
[0006]一株樺裙孔菌菌株，該菌株命名為樺裙孔菌(Lenzites betulina),菌株Y4962,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)；保藏日期是2014年1月24日保藏編號為:CGMCC N0.8783。
[0007]菌絲長勢旺盛，菌落初為絨毛狀，后為成較致密的氈片狀，雪白色，不產(chǎn)生色素；菌落由生殖菌絲和骨架菌絲組成，生殖菌絲薄壁到稍厚壁，直徑2-3微米，具有鎖狀聯(lián)合分隔，偶爾分枝；骨架菌絲稍厚壁到厚壁，菌絲壁在棉蘭試劑中有嗜藍反應(yīng)，在碘化鉀試劑中無變化，直徑1-2.5微米，常見直角分枝；平皿培養(yǎng)3天菌落直徑4.5厘米。該菌株的ITS rDNA序列已經(jīng)提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，GenBank登錄號KJ845635,該序列與Lenzitesbetulina菌株DSH97_071的基因序列同源性達99%。
[0008]所述樺褶孔菌菌株的培養(yǎng)過程為:將所述的樺褶孔菌菌株Lenzites betulinaY4962菌株的菌絲體接種到直徑60毫米平皿培養(yǎng)基上，在28-30°C，平皿培養(yǎng)基上生長4_5天；解剖刀刮取菌絲，接入液體培養(yǎng)基中，4個培養(yǎng)皿刮取的菌絲接種到裝有100ml培養(yǎng)液的250ml錐形瓶中，于28-30°C，140rpm轉(zhuǎn)速條件下振蕩培養(yǎng)6_7天，獲得包含其分泌的胞外降解酶的培養(yǎng)液，其為菌絲及菌液的混合菌劑；
[0009]所述的平皿培養(yǎng)基組成為酵母浸粉10g，瓊脂17g，加水至lL，pH自然，于121°C高壓滅菌20分鐘；
[0010]所述的液體培養(yǎng)基組成為酵母浸粉8-12g，KH2P040.4-0.6g, CuS040.05-0.lg, CaCl20.01-0.02g, MnS040.01-0.02g, Vitamin B1.01-0.02g, Tween 800.4-0.6g, pH 自然，加水定容至1L，于121°C高壓滅菌20-25分鐘。
[0011]含有烯酰嗎啉農(nóng)藥最終濃度大于0到200mg/L的上述培養(yǎng)的培養(yǎng)液，于28_30°C，搖床震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時間96-120小時，進行烯酰嗎啉農(nóng)藥可的降解。
[0012]于含有烯酰嗎啉農(nóng)藥最終濃度大于0到200mg/L的上述培養(yǎng)的培養(yǎng)液接種樺褶孔菌，以樺褶孔菌為菌種，以殺菌劑為補充碳源，降解烯酰嗎啉。
[0013]所述的樺褶孔菌菌株及其在烯酰嗎啉殘留降解中的應(yīng)用按如下步驟進行實驗:
[0014](1)在樺褶孔菌菌株培養(yǎng)液90_120ml中，加入終濃度8_10mg/L的烯酰嗎啉農(nóng)藥，于28-30°C，轉(zhuǎn)速140-160rpm，搖床震蕩培養(yǎng)，以未經(jīng)接種的培養(yǎng)液中加入相等濃度的烯酰嗎啉農(nóng)藥作為對照組；
[0015](2)每隔24h取樣一次，取2-3ml樣品置于小口 100ml錐形瓶中，加入乙腈8_12mL，超聲提取15min,結(jié)束后倒入裝有8g Nacl的塑料離心管中，反復(fù)顛倒混勻，3500rpm離心5min，靜置50min，取上層乙腈于100ml圓底燒瓶中，33_37°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，2ml正己烷加
0.5ml丙酮清洗圓底燒瓶，倒入送樣小瓶中，并重復(fù)一次，定容至5ml，取1ml用于GC-E⑶氣相色譜分析，計算降解率。
[0016]其降解率(%) = (A_B)/AX100，其中:
[0017]A為對照組烯酰嗎啉農(nóng)藥殘留值，
[0018]B為經(jīng)降解菌劑降解后的烯酰嗎啉農(nóng)藥殘留值。
[0019]以樺褶孔菌為菌種，以殺菌劑為補充碳源，降解烯酰嗎啉。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)點是:本專利是從原始森林的腐木上分離得到的一株高效降解卵菌殺菌劑-烯酰嗎啉的白腐真菌菌株樺裙孔菌(Lenzites betulina),菌株Y4962。該樺裙孔菌是一株具有較高活力，培養(yǎng)方法簡單，生長速度快，不易變異的菌株，實驗表明該菌能夠在水瓊脂培養(yǎng)基中利用烯酰嗎啉作為唯一碳源和能源而生長，并使烯酰嗎啉降解；在添加外源營養(yǎng)物的液體培養(yǎng)條件下，該菌96h能夠?qū)⒒烊肱囵B(yǎng)基中10mg/L的烯酰嗎啉降解72%以上，充分說明該菌可以用于水體及農(nóng)產(chǎn)品表面殘留的烯酰嗎啉的生物降解，具有農(nóng)藥殘留生物降解的工業(yè)化應(yīng)用前景，也可以作為研究白腐真菌對烯酰嗎啉農(nóng)藥殘留降解機制的模式菌株。
【具體實施方式】
[0021 ] 本發(fā)明所提供的降解烯酰嗎啉農(nóng)藥