一種莖瘤芥根瘤內(nèi)生細(xì)菌gj-06、含有該內(nèi)生細(xì)菌的根腫病防治劑及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于內(nèi)生菌技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種莖瘤芥根瘤內(nèi)生細(xì)菌sub tilis ) GJ-06、含有該內(nèi)生細(xì)菌的根腫病防治劑及應(yīng)用。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]蕓笞根腫菌{Plasmod1p hora brassicae fforon)屬于原生生物界根腫菌門(mén)根腫菌綱根腫菌目根腫菌科，其主要危害白菜、油菜、榨菜、蘿卜等十字花科植物，造成植物根部腫大，影響植物吸收，同時(shí)根腫菌侵染造成植物根系表皮破裂，土壤其他病原菌侵入，導(dǎo)致植物根系腐爛，植株矮小黃化甚至死亡，嚴(yán)重減產(chǎn)。蕓薹根腫菌可在土壤中長(zhǎng)期存活，一旦田間發(fā)病，難以消除，田塊無(wú)法繼續(xù)種植十字花科作物。近年來(lái)，隨著我國(guó)十字花科作物種植面積的增加、種子和蔬菜廣泛調(diào)運(yùn)、連作年限增加等因素的影響，我國(guó)十字花科根腫病發(fā)生逐年加重，嚴(yán)重威脅十字花科作物的生產(chǎn)。
[0004]棒菜(莖瘤芥)CSrawica juncea var.tumidaTsen etLee)屬十字花科蕓薹屬芥菜種葉芥亞種大葉芥變種的變種。“涪陵榨菜”已經(jīng)成為我國(guó)重慶的特色農(nóng)業(yè)，涪陵區(qū)榨菜的種植面積和產(chǎn)量均居全國(guó)第一位。自1994年在涪陵地區(qū)發(fā)現(xiàn)榨菜根腫病起，目前該病已成為榨菜的主要病害，田間發(fā)病率30-50%，發(fā)病田塊很難再繼續(xù)種植榨菜，造成榨菜種植面積下降，嚴(yán)重威脅榨菜的可持續(xù)發(fā)展(高明泉，彭洪江，王旭，等.涪陵榨菜根腫病的危害與產(chǎn)量損失測(cè)定.植物保護(hù)，2002，28(6): 31-33 ;肖崇剛，郭向華，韓海波，等.涪陵榨菜根腫病病菌鑒定及主要特性.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，24(4): 539-541)。涪陵地區(qū)榨菜種植連作年限達(dá)10-20年，單一作物長(zhǎng)期連作會(huì)導(dǎo)致連作障礙，造成土壤酸化、土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)失衡、土傳病害增加等問(wèn)題(.Zhang X, Pan Z, Zhou X, et al.Autotoxicity and Continuous Cropping Obstacles:A Review.Chinese Journal of Soil Science,2007, 4: 33-38)。目前，涪陵地區(qū)榨菜連作田土壤已經(jīng)呈現(xiàn)酸化，根腫菌休眠孢子在酸性環(huán)境下更容易存活(Narisawak, Ohhi K T, Hashiba Τ.Suppress1 η of clubroot andverticilli um yellowsin Chinese cabbage in the field by the root endophyticfungus Heteroconi umchaetospir a.Plant Pathology, 2000, 49: 141-146)，這也導(dǎo)致根腫病逐年加重。作為土傳病害，根腫病的發(fā)生與土壤微生物、植物根系分泌物和土壤理化性質(zhì)密切相關(guān)。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是:如何提供一種能夠抑制根腫病的內(nèi)生細(xì)菌和根腫病防治劑，使其可應(yīng)用于根腫病防治中，有效降低莖瘤芥的根腫病病情指數(shù)。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:一種莖瘤芥根瘤內(nèi)生細(xì)菌(Bacillus sub tilis) GJ-06，其分類(lèi)命名為枯草芽抱桿菌 GJ-06 (Bacillus sub tilisGJ-伙?)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏日期為2015年11月9日，菌種保藏號(hào)為CCTCC NO:M 2015665 ;所述莖瘤芥根瘤內(nèi)生細(xì)菌{Bacillus subtil is) GJ-06 的 16SrDNA 序列如 SEQ ID N0.1 所示。
[0007]上述莖瘤芥根瘤內(nèi)生細(xì)菌subtil is) GJ-06在根腫病防治中的應(yīng)用。
[0008]一種根腫病防治劑，其組分包括上述莖瘤芥根瘤內(nèi)生細(xì)菌{Bacillus sub tilis)GJ-06 ;其中，上述莖瘤芥根瘤內(nèi)生細(xì)菌(也ciWys仰況iWs) GJ-06作為有效成分。
[0009]上述根腫病防治劑在根腫病防治中的應(yīng)用。
[0010]相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果:
1、本發(fā)明從莖瘤芥中分離出內(nèi)生細(xì)菌，并通過(guò)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生細(xì)菌GJ-06將莖瘤芥的根腫病病情指數(shù)從75.3降低到36.1，對(duì)莖瘤芥根腫病的抑制達(dá)到52%，可有效減緩田間根腫病發(fā)病程度，取得了意想不到的效果。
[0011]2、接種本發(fā)明GJ-06菌株的莖瘤芥發(fā)病時(shí)間較晚，莖瘤芥產(chǎn)量與健康菌株相當(dāng)，經(jīng)第二年田間試驗(yàn)表明，該菌可以穩(wěn)定地抑制莖瘤芥根腫病，具有良好的穩(wěn)定性。
[0012]3、本發(fā)明根腫病防治劑以莖瘤芥根瘤內(nèi)生細(xì)菌GJ-06為有效成分，且通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)該根腫病防治劑中GJ-06的濃度為2X 10scfu -mL 1時(shí)，對(duì)莖瘤芥根腫病抑制效果更好，抑制率達(dá)到52%。
[0013]
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為內(nèi)生細(xì)菌GJ-06的高倍顯微鏡圖；
圖2為內(nèi)生細(xì)菌GJ-06的掃描電鏡圖；
圖3為接種根腫病內(nèi)生細(xì)菌GJ-06后莖瘤芥發(fā)病程度圖。
[0015]
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。本實(shí)施案例在以本發(fā)明技術(shù)為前提下進(jìn)行實(shí)施，現(xiàn)給出詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，來(lái)說(shuō)明本發(fā)明具有創(chuàng)造性，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于以下的實(shí)施例。下述實(shí)施例中使用的化學(xué)藥品如無(wú)特殊說(shuō)明，即為普通市售產(chǎn)品。
[0017]實(shí)施例1
莖瘤芥根部?jī)?nèi)生細(xì)菌的分離:
將莖瘤芥(永安小葉)根腫病產(chǎn)生的根結(jié)和健康根表面消毒，放入無(wú)菌研缽中研磨成漿液，涂布于NA平板(牛肉浸膏3 g/L，蛋白胨2.5 g/L，葡萄糖5 g/L，瓊脂16g/L。)上，37°C培養(yǎng)48 h后，挑取細(xì)菌菌落，純化，備用。
[0018]將分離得的根瘤內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)菌落形態(tài)及革蘭氏染色初步鑒定，共得到8株內(nèi)生細(xì)菌，初步標(biāo)號(hào)為 GJ-01、GJ-02、GJ-03、GJ-04、GJ-05、GJ-06、GJ-07、GJ-08，采用 NA 培養(yǎng)基液體發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件37°C培養(yǎng)12 h，用于后續(xù)試驗(yàn)，以清水為對(duì)照(CK)。
[0019]實(shí)施例2
內(nèi)生細(xì)菌的鑒定:
以細(xì)菌通用引物16SrDNA序列為設(shè)計(jì)引物(16S-F: agagtttgatcctggctcag，16S-R:tacggctaccttgttacgactt)，利用 PCR 方法(95 °C , 5min ；95 °C，30s，55 °C，30s, 72 °C，lmin30s，32cycle ；72 °C，lOmin ；12 °C , forever)擴(kuò)增 GJ-06 菌株的16SrDNA序列，將擴(kuò)增的序列轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序，在NCBI比較分析確定其分類(lèi)地位；結(jié)果顯示GJ-06與細(xì)菌域、厚壁菌門(mén)、芽孢桿菌綱、芽孢桿菌目、芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬細(xì)菌16SrDNA序列一致性為100%，表明該菌屬于枯草芽孢桿菌。
[0020]對(duì)GJ-06菌株進(jìn)行高倍顯微鏡(目鏡十倍，物鏡100倍，放大1000倍)和掃描電鏡表征，分析其形態(tài)特征，確定內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)。結(jié)果如圖1和圖2所示，單個(gè)細(xì)胞0.7-0.8X2-3微米，無(wú)荽腥，周生鞭壬，能運(yùn)動(dòng)，芽孢0.6橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏。其結(jié)構(gòu)特征也與枯草芽孢桿菌相符，因此，鑒定該菌為枯草芽孢桿菌。
[0021]實(shí)施例3
內(nèi)生細(xì)菌對(duì)莖瘤芥根腫病的抗性分析:
選擇根腫病病發(fā)病重的莖瘤芥地塊進(jìn)行，在移栽時(shí)，將莖瘤芥幼苗截根處理，
將100 mL實(shí)施例1培養(yǎng)后的八種菌株懸浮液(IX 109 cfu.mL ')分別加水至500 mL并混合均勻，進(jìn)行浸根每個(gè)處理100棵，3次重復(fù)操作。以清水為空白對(duì)照，小區(qū)隨機(jī)排列，管理同一般大田。分別在處理區(qū)和對(duì)照區(qū)調(diào)查田間病株率和病情指數(shù)，測(cè)算處理區(qū)菌株的防治效果。
[0022]將莖瘤芥根腫病嚴(yán)重度分級(jí)定為5級(jí)，其標(biāo)準(zhǔn)為(高明泉，2012):
0級(jí):健株。
[0023]1級(jí):側(cè)根發(fā)病，腫瘤小而少，呈白色，對(duì)植株生長(zhǎng)無(wú)或輕微影響，產(chǎn)量損失為0-5 %。
[0024]2級(jí):腫瘤主要在主根中部、上、下側(cè)根多，或側(cè)根上腫瘤大而多，呈白色或米黃色，對(duì)植株生長(zhǎng)有一定影響，但地上部分無(wú)明顯癥狀，產(chǎn)量損失6-20%。
[0025]3級(jí):主根腫瘤大且變黑，表面粗糙龜裂，有少量側(cè)根，地上部分生長(zhǎng)受阻，中心葉片變?yōu)樯罹G色，在陽(yáng)光下出現(xiàn)輕度萎蔫，產(chǎn)量損失21-35%。
[0026]4級(jí):主根腫瘤龜裂或腐爛變黑，幾乎無(wú)側(cè)根，地上部分生長(zhǎng)嚴(yán)重受阻，株型矮小，葉色暗綠，菜頭小且皮厚筋多，在陽(yáng)光下，整株嚴(yán)重萎蔫，極易拔起，產(chǎn)量損失(不包括無(wú)實(shí)際收獲價(jià)值的病株)在36%以上。
[0027]分別將8株內(nèi)生細(xì)菌接種于大田栽種的莖瘤芥幼苗，收割前統(tǒng)計(jì)根腫病病情指數(shù)。結(jié)果如圖3所示:接種根瘤內(nèi)生細(xì)菌GJ-06的處理，根腫病的病情指數(shù)為36.1，顯著低于其他菌株及對(duì)照(病情指數(shù)為75.3)的病情指數(shù)，使病情指數(shù)從75.3降到36.1，該菌株對(duì)莖瘤芥根腫病的防治達(dá)到52%，可有效減緩田間根腫病發(fā)病程度。同時(shí)接種GJ-06菌株的莖瘤芥發(fā)病時(shí)間較晚，莖瘤芥產(chǎn)量與健康菌株相當(dāng)，經(jīng)第二年田間試驗(yàn)表明，該菌可以穩(wěn)定地抑制莖瘤芥根腫病。由此可見(jiàn)，GJ-06菌株對(duì)莖瘤芥根腫病具有良好的防治效果。
[0028]最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種莖瘤芥根瘤內(nèi)生細(xì)菌(Bacillus sub til is) GJ-06，其特征在于，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2015年11月9日，菌種保藏號(hào)為CCTCC NO:M 2015665。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述莖瘤芥根瘤內(nèi)生細(xì)菌(Bacillussubtil is) GJ-06,其特征在于，所述莖瘤芥根瘤內(nèi)生細(xì)菌(■feciWiA? sub tills) GJ-06的16SrDNA序列如SEQ ID N0.1所示。3.權(quán)利要求1或2所述莖瘤芥根瘤內(nèi)生細(xì)菌(Bacillussubtil在根腫病防治中的應(yīng)用。4.一種根腫病防治劑，其特征在于，其組分包括權(quán)利要求1或2所述莖瘤芥根瘤內(nèi)生細(xì)觀Bacillus subtil ism ;其中，權(quán)利要求1或2所述莖瘤芥根瘤內(nèi)生細(xì)菌subtilis)QyQ^作為有效成分。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述根腫病防治劑，其特征在于，所述莖瘤芥根瘤內(nèi)生細(xì)菌{Bacillus subtil is) GJ-06 在防治劑中的濃度為 2X 108cfu.mL:06.權(quán)利要求5所述根腫病防治劑在根腫病防治中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種莖瘤芥根瘤內(nèi)生細(xì)菌GJ-06、含有該內(nèi)生細(xì)菌的根腫病防治劑及應(yīng)用，所述莖瘤芥根瘤內(nèi)生細(xì)菌（<i>Bacillus？subtilis</i>）GJ-06保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2015年11月9日，菌種保藏號(hào)為CCTCC？NO：M？2015665；所述根腫病防治劑包括上述莖瘤芥根瘤內(nèi)生細(xì)菌GJ-06，上述莖瘤芥根瘤內(nèi)生細(xì)菌GJ-06作為有效成分；所述莖瘤芥根瘤內(nèi)生細(xì)菌GJ-06和根腫病防治劑可在根腫病防治中應(yīng)用。本發(fā)明內(nèi)生細(xì)菌GJ-06將莖瘤芥的根腫病發(fā)病指數(shù)從75.3降低到36.1，對(duì)莖瘤芥的防治率達(dá)到52%，可有效減緩田間根腫病發(fā)病程度，取得了意想不到的效果。CCTCC NO：M201566520151109
【IPC分類(lèi)】A01P3/00, C12R1/125, C12N1/20, A01N63/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105368754
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510910792
【發(fā)明人】王殿東, 潘麗梅, 譚永忠, 王旭祎, 田雪亮, 曾甜, 姜清敏
【申請(qǐng)人】長(zhǎng)江師范學(xué)院
【公開(kāi)日】2016年3月2日
【申請(qǐng)日】2015年12月10日