一種利用植物復(fù)合酶轉(zhuǎn)化人參皂苷的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，具體設(shè)及一種利用植物復(fù)合酶轉(zhuǎn)化人參皂巧 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人參為五加科人參屬植物（PanaxginsengC.A.Mayer),由于其根部肥大，帶有 分叉，形態(tài)長得像人，故稱為人參。人參的干燥根和根莖，具有補(bǔ)脾益肺、除邪、大補(bǔ)元?dú)?、?精神、止驚惇和明目益智等功效，享有"中藥之王"的美稱，是聞名遐選的"東北Ξ寶"之 一。我國歷史上第一部藥學(xué)典籍-《神農(nóng)本草經(jīng)》上將人參稱為"主養(yǎng)命W應(yīng)天，無毒，多 服久服不傷人，欲輕身益氣不老延年"的"君"藥上品之一。人參在我國主要分布于迂寧 省、吉林省和黑龍江地區(qū)，吉林省的長白山地區(qū)是作為我國人參的主產(chǎn)區(qū)，其產(chǎn)量占全國人 參產(chǎn)量的85%，世界人參產(chǎn)量的70%。人參皂巧作為人參的主要活性成分，約占人參總質(zhì)量 的4%，是一種固醇類化合物，屬于Ξ祗皂巧。根據(jù)巧元結(jié)構(gòu)的不同，分為齊墳果酸型巧曰如 Ro等），人參二醇型（如化1、化2、1^3、1?(1、化2)，人參^醇型（如1^、1^1、化1)，其中1^3、化2 等存在于野山參和紅參中，并且含量極低，因此稱為稀有人參皂巧。人參中人參二醇型皂巧 占總皂巧的45-60%，人參Ξ醇型皂巧占人參皂巧總量的12-20%，齊墳果酸型皂巧占人參皂 巧總量7-10%?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，皂巧的抗腫瘤活性與皂巧分子側(cè)鏈糖基的結(jié)合位置和數(shù) 量有關(guān)，并且抗腫瘤活性隨著糖基數(shù)量的減少而增加。因此，在人參皂巧中低糖鏈或無糖鏈 的稀有人參皂巧如Rg3 (2個(gè)糖基)、化2 (1個(gè)糖基)、C-K(1個(gè)糖基）和PPD(無糖基）等具 有很強(qiáng)的抗腫瘤活性。
[0003] 目前，制備稀有人參皂巧的方法有化學(xué)法和生物轉(zhuǎn)化法?；瘜W(xué)法如酸水解、堿水解 和Smith降解法等，雖然操作簡單，但專一性差，難W得到某種特定結(jié)構(gòu)的單體皂巧，并且 收率很低，同時(shí)造成環(huán)境污染，不適宜工業(yè)化生產(chǎn)。生物轉(zhuǎn)化法是利用生物體內(nèi)產(chǎn)生的酶的 降解作用來，選擇性地水解皂巧分子C-20位和C-3位上的側(cè)鏈糖基轉(zhuǎn)化為稀有人參皂巧， 具有高專一性、高效性和無污染等特點(diǎn)，成為近年來研究的熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種利用植物復(fù)合酶轉(zhuǎn)化人參皂巧的方法，工藝簡單，操作 方便，產(chǎn)品干燥容易，最重要的是在固體發(fā)酵的過程中實(shí)現(xiàn)人參皂巧的轉(zhuǎn)化，得到稀有人參 皂巧或抗腫瘤活性物質(zhì)原人參二醇（PPD)。
[0005] 本發(fā)明的目的通過采用W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 一種利用植物復(fù)合酶轉(zhuǎn)化人參皂巧的方法，包括W下步驟： a、 將干人參研磨成粉末，低溫滅菌，然后冷卻至室溫； b、 將經(jīng)滅菌的人參粉末與植物復(fù)合酶混勻，植物復(fù)合酶添加量為10-70%，用無菌化 液體培養(yǎng)基和蒸饋水調(diào)節(jié)水分，充分混勻后密封，置于恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵得到人參發(fā)酵產(chǎn) 物； C、將人參發(fā)酵產(chǎn)物用80%甲醇水溶液超聲提取，過濾，濾液減壓濃縮，得人參皂巧粗提 物； t在人參皂巧粗提物加入去離子水溶解后，用飽和正下醇溶液萃取，減壓濃縮，得到 人參皂巧提取物，其中含有低糖鏈稀有人參皂巧或無糖鏈的抗腫瘤活性物質(zhì)原人參二醇 (PPD)o
[0006] 進(jìn)一步地，所述的植物復(fù)合酶來自于蔬果、海藻類或谷類植物，其復(fù)合酶成分包含 淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶中的兩種W上酶類。
[0007] 進(jìn)一步地，所述的a步驟中人參粉末滅菌溫度為50-90°C。
[0008] 進(jìn)一步地，所述的b步驟中固體發(fā)酵體系的水分為50-80%，發(fā)酵時(shí)間為5-25h，發(fā) 酵溫度為20-70°C。
[0009] 進(jìn)一步地，所述的b步驟中無菌化液體培養(yǎng)基由0. 5gNH4CI，1.Og馬冊〇4,0. 5g KH2PO4,0. 25邑MgS〇4和 1. 0邑酵母粉，水 1000ml,pH值 7. 0 構(gòu)成。
[0010] 進(jìn)一步地，所述的C步驟中在人參發(fā)酵產(chǎn)物中，加入80%甲醇水溶液50-200mU在 50°C超聲提取 10-50min。
[0011] 進(jìn)一步地，所述發(fā)酵過程中，植物復(fù)合酶水解多糖鏈人參主皂巧的C-3和C-20位 的糖基，生成低糖鏈稀有人參皂巧或無糖鏈的抗腫瘤活性物質(zhì)原人參二醇（PPD)。
[0012] 本發(fā)明人參皂巧的固體發(fā)酵是將人參等中藥材作為營養(yǎng)基質(zhì)，通過微生物或酶的 生化反應(yīng)過程對人參皂巧進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，產(chǎn)生新的生物活性成分。該方法工藝簡單，操作方 便，產(chǎn)品干燥容易，成本低廉，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。特別是在固體發(fā)酵的過程中實(shí)現(xiàn)人參皂 巧的轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生稀有人參皂巧或抗腫瘤活性物質(zhì)原人參二醇（PPD)。
【附圖說明】
[0013] 圖1為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)人參皂巧提取物中稀有人參皂巧PPD標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖中X軸表示 峰面積，Y軸表原人參二醇PPD的濃度，單位為mg/血。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 為了更清楚地理解本發(fā)明，下面通過具體的實(shí)施例進(jìn)一步做詳細(xì)描述。運(yùn)些實(shí)施 例僅用于對本發(fā)明進(jìn)一步說明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[001引實(shí)施例1 配置化液體培養(yǎng)基（0. 5g畑典1，1.Og馬冊04,0. 5g皿2?04,0. 25gΜ拆04和1.Og酵母 粉，水1000ml，抑值7.0)，121°C滅菌15min，冷卻至室溫；人參研磨成粉末，低溫滅菌，滅菌 溫度為50-90°C，然后冷卻至室溫；將4.8g滅菌后的人參粉末與1.2g植物復(fù)合酶混勻；加 入化液體培養(yǎng)基和蒸饋水調(diào)節(jié)水分，固體發(fā)酵體系的水分為50-80% ;充分混勻后密封，置 于30°C恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵7d得到人參發(fā)酵產(chǎn)物；發(fā)酵產(chǎn)物用80%甲醇水溶液50-200mL， 在50°C超聲提取10-50min超聲提取，過濾，濾液減壓濃縮得人參皂巧粗取物；在人參皂巧 粗取物加入去離子水溶解后，用飽和正下醇溶液萃取，減壓濃縮，得到人參皂巧提取物。經(jīng) HPLC分析結(jié)果，人參發(fā)酵物中人參皂巧Rgl含量為3. 53mg/g，Re含量為3. 16mg/g，化1含 量為8. 49mg/g，Rc含量為 3. 35mg/g，化2 含量為 2. 32mg/g，Rd含量為 1. 63mg/g，PPD含量 為 7.Olmg/g。
[001引實(shí)施例2 配置化液體培養(yǎng)基（0.5g畑典1，1. Og馬冊04,0. 5g皿2?04,0. 25g Μ拆04和1. Og酵母 粉，水1000ml，抑值7.0)，121°C滅菌15min，冷卻至室溫；人參研磨成粉末