[0130] 2)實驗方法
[0131] (1)0.lmm〇l/LQ)PPH·]甲醇溶液 陽132] 用分析天平稱取19. 72mgQ)PPH·]溶于500mL甲醇溶液中，配制得到的0.Immol/ UDPPH·]甲醇溶液，錫紙避光保存，即配即用。
[0133] (2)扣PPH·]法測定生物活性膚的抗氧化活性 陽134] 在1. 5血EP管中加入500μL濃度為0.Immol/L扣PPH.]甲醇溶液、按表2分別 加入500μL不同濃度的待測樣品和去離子水作為空白對照。 陽135] 待檢測樣品加樣完畢后，混合均勻，室溫靜置30min后取200微升至96孔板中，用 酶標(biāo)儀在517nm處檢測吸光值。按照下式計算自由基清除率，實驗結(jié)果見表2。 陽136] 公式：扣PPH·]自由基清除率=(A〇-As)/A〇X100%
[0137] 其中A。表示空白對照組的吸光值，Ag表示樣品組的吸光值。
[0138] 表2DPK1法測定生物活性多膚的總抗氧化能力結(jié)果 陽 139]
[0140] 通過扣PPH·]法對生物活性多膚SAEP體外總抗氧化活性進行了測定，發(fā)現(xiàn)其具 有清除自由基能力，具體ICwmg/mU值見表2。根據(jù)相關(guān)抗氧化能力的標(biāo)準(zhǔn)可認(rèn)定發(fā)明的生 物活性多膚SAEP具有較好的抗氧化能力。 陽141] 2、ABTS法測定生物活性膚的體外抗氧化活性 陽142] 1)實驗試劑及儀器
[0143] 試劑：總抗氧化力試劑盒（ABTS法），碧云天公司生產(chǎn)；甲醇，上海國藥公司提供； 合成實施例1中得到的乳源性生物活性多膚。
[0144] 主要儀器：Pro200酶標(biāo)儀，奧地利Tecan公司產(chǎn)品；96孔細胞培養(yǎng)板，美國 Millipore公司制造。 陽145]。實驗方法
[0146] (1)ABTS工作液的配置
[0147] 取40微升ABTS溶液與40微升氧化劑溶液配制成ABTS工作母液，配制后避光存 放12-16小時后使用，配好的ABTS工作母液在室溫下避光存放，2-3天內(nèi)穩(wěn)定。使用前，把 ABTS工作母液用PBS稀釋成ABTS工作液，大約40倍，要求ABTS工作液的吸光度減去相應(yīng) 的PBS空白對照后，A734為0. 7 + 0. 05。
[0148] 似Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
[0149] 用樣品配制溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，把lOmM Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0. 005、0. 01、0. 03、 0. 05、0. 1、0. 25、0. 5和1.OmM。在96孔板的每個檢測孔中加入200微升ABTS工作液，標(biāo)準(zhǔn) 曲線檢測孔內(nèi)加入10微升各種濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液，輕輕混勻。室溫解育4分鐘后，用 酶標(biāo)儀在734nm處測定吸光值。
[0150] Trolox濃度與吸光值呈良好的正比關(guān)系，濃度越高，吸光值越低。本發(fā)明Trolox 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見圖6,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9995，Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線的精 密度和準(zhǔn)確度均符合檢測要求，可用于后續(xù)計算。 陽15U (3)ABTS法測定生物活性膚的抗氧化活性 陽15引在96孔板的每個檢測孔中加入200微升ABTS工作液，空白對照孔中加入10微升PBS溶液，樣品檢測孔內(nèi)加入10微升各種樣品，輕輕混勻。室溫解育4分鐘后，用酶標(biāo)儀在 734nm處測定吸光值。測定根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品的總抗氧化能力?？偪寡趸芰Ρ硎?方式W Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度來表示。按照下式計算總抗氧化能力，實驗結(jié)果見表3: 陽153]
[0154]表3 ABTS法測定生物活性多膚的總抗氧化能力結(jié)果陽1巧]
[0156]通過總抗氧化能力法（ABTS法）對生物活性多膚SAEP體外總抗氧化活性進行了 測定，發(fā)現(xiàn)生物活性多膚SAEP具有抗氧化能力：在多膚濃度為Img/mL情況下，其所對應(yīng)的 Trolox濃度為0. 00063mmol/L。因此，可認(rèn)定發(fā)明的生物活性多膚SAEP具有一定的抗氧化 能力。 陽157] W上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例，上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及 其功效，而并非對本發(fā)明任何形式上和實質(zhì)上的限制，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技 術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可W做出若干改進和補充，運些改進和補充也 應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情 況下，當(dāng)可利用W上所掲示的技術(shù)內(nèi)容而做出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本 發(fā)明的等效實施例；同時，凡依據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù)對上述實施例所作的任何等同變化的 更動、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種分離的生物活性多肽SAEP，其包括 (a) 由SEQIDNO:1所示的氨基酸組成的多肽； (b) 或在SEQIDNO:1所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且 具有同等活性的由（a)衍生的多肽。2. 編碼權(quán)利要求1所述生物活性多肽SAEP的核苷酸片段。3. 權(quán)利要求1所述生物活性多肽的制備方法，包括如下步驟： 1) 發(fā)酵：將瑞士乳桿菌添加到脫脂乳中進行厭氧發(fā)酵，獲得瑞士乳桿菌發(fā)酵乳； 2) 破壁：對發(fā)酵乳離心后得到的菌體進行超聲，破碎菌壁使胞內(nèi)肽游離，獲得菌肽混 合液； 3) 多肽的粗提：對步驟2)中的菌肽混合液的進行低溫離心分離，取上清液； 4) 多肽的純化： a.對步驟3)的上清液進行超濾處理，收集濾液； b.固相萃取柱分離：收集的濾液采用Waters Sep-pak C18固相萃取柱萃取，收集生物 活性多肽混合物； 5) 多肽的消化及穩(wěn)定性：采用兩步酶解法酶解步驟4)的生物活性多肽混合物，獲得生 物活性多肽混合物；第一步酶解所采用的酶為胃蛋白酶，第二步酶解所采用的酶為胰酶。4. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟1)所述厭氧發(fā)酵的條件為：發(fā)酵 溫度36~38°C，發(fā)酵時間6~8h。5. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述離心的條件為20°C， 4000~5000rpm，離心15min;步驟2)所述破壁的條件為菌體濃度0. 0238g/ml，破碎功率 300W，破碎總時間26min。6. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟3)中，所述低溫離心的條件為： 4°C，8000 ~lOOOOrpm，離心 15 ~30min。7. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟3)a所述超濾處理所采用的是截留 分子量分別為3kDa的超濾管；所述超濾處理過程中，轉(zhuǎn)速為4800r/min，時間為30min，離心 溫度為4°C。8. 權(quán)利要求1所述生物活性多肽SAEP或所述生物活性多肽的衍生物在制備抗氧化和 /或增強機體免疫力的食品、保健品及藥物中的應(yīng)用。9. 一種抗氧化藥物，包含如權(quán)利要求1所述生物活性多肽SAEP或所述生物活性多肽的 衍生物。10. -種增強機體免疫力藥物，包含如權(quán)利要求1所述生物活性多肽SAEP或所述生物 活性多肽的衍生物。
【專利摘要】本發(fā)明涉及蛋白領(lǐng)域，具體涉及一種來源于β-乳球蛋白的乳源性生物活性多肽SAEP。本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的生物活性多肽具有不同的抗氧化生物學(xué)活性和促進細胞免疫的活性；研究結(jié)果表明本發(fā)明的這種乳源性生物活性肽作為一類小分子物質(zhì)具有潛在的延緩衰老的功能。另外，模擬消化實驗結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)的這條生物活性多肽在通常的動物體內(nèi)消化條件下依舊穩(wěn)定存在，不會被進一步降解，能夠被動物機體直接吸收利用發(fā)揮其具有的生物活性功能，對開發(fā)具有抗氧化功能、增強免疫功能及延緩衰老的乳制品、保健品及藥物具有十分重要的意義。
【IPC分類】C12R1/225, A23L33/18, A61P39/06, C07K14/47, C12P21/02, C12N15/12, A61K38/17, C12P21/06, A61P37/04, A23L33/00
【公開號】CN105254743
【申請?zhí)枴緾N201510672601
【發(fā)明人】張少輝, 周婕慧, 錢蕙佶, 胡亞菁, 高揚, 徐海紅, 金贏凱, 李婉如
【申請人】上海交通大學(xué)
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年10月16日