一種檢測(cè)人類PDGFRα基因D842_H845del突變或I843_D846del突變的診斷試劑盒和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)人類TOGFRa基因D842_H845del突變或I843_D846del突變 的診斷試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 胃腸道間質(zhì)瘤（GastrointestinalStromalTumors,GIST)是一類起源于胃腸道 間葉組織的腫瘤，占消化道間葉腫瘤的大部分。胃腸道間質(zhì)瘤占胃腸道惡性腫瘤的1~ 3%，估計(jì)年發(fā)病率約為10 - 20/100萬(wàn)，多發(fā)于中老年患者，40歲以下患者少見(jiàn)，男女發(fā)病 率無(wú)明顯差異。GIST大部分發(fā)生于胃（50~70%)和小腸（20~30%)，結(jié)直腸約占10~ 20%，食道占0~6%，腸系膜、網(wǎng)膜及腹腔后罕見(jiàn)。GIST病人20-30%是惡性的，第一次就 診時(shí)約有11~47 %已有轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移主要在肝和腹腔。
[0003] 目前臨床上一線靶向藥物是格列衛(wèi)（伊馬替尼，諾華制藥），二線藥物索坦（舒尼 替尼，輝瑞制藥）每個(gè)患者年消費(fèi)均為十余萬(wàn)人民幣。不同基因突變類型患者，輔助治療的 獲益存在差異，因此靶向治療之前需進(jìn)行基因檢測(cè)，以預(yù)測(cè)靶向治療的療效并指導(dǎo)靶向藥 物種類和劑量的選用。其規(guī)范的用藥方案已經(jīng)進(jìn)入《中國(guó)胃腸間質(zhì)瘤診斷治療共識(shí)》（2013 年版）。
[0004] 人類roGFRa基因是編碼血小板源性生長(zhǎng)因子家族中的一個(gè)細(xì)胞膜酪氨酸激酶 受體的基因，其突變與GIST相關(guān)。如，TOGFRa基因D842_H845del突變和I843_D846del 突變就與GIST的治療相關(guān)，出現(xiàn)了這D842_H845del突變或I843_D846del突變的病人， 對(duì)GIST的一線藥物一一格列衛(wèi)敏感，可以采用一線藥物治療有效，而未突變的患者則對(duì) 一線藥物不敏感，應(yīng)當(dāng)采用二線藥物--索坦治療。因此，檢測(cè)GIST患者是否出現(xiàn)D842_ H845del突變或I843_D846del突變，對(duì)其臨床用藥有非常重要的意義。
[0005] D842_H845del突變和I843_D846del突變屬于PDGFRa第18外顯子上的突變，二 者均屬于缺失突變，且缺失的氨基酸有交叉，具體如圖1所示。
[0006] 目前，均是通過(guò)測(cè)序的方式檢測(cè)PDGFRa基因D842_H845del突變和I843_D846del 突變，但是測(cè)序的經(jīng)濟(jì)和人力成本太高，不利于普通的臨床檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種新的定量PCR檢測(cè)試劑盒和方法，用于檢 測(cè)PDGFRa基因D842_H845del突變或I843_D846del突變。
[0008] PDGFRa基因D842_H845del突變或I843_D846del突變的信息如下：
[0009]
[0010] 本發(fā)明提供了SEQ ID NO. 1~2所示的引物對(duì)。
[0011] 本發(fā)明提供了SEQ ID NO. 3所示的探針。
[0012] 本發(fā)明還提供了SEQ ID NO. 1~2和SEQ ID N0. 3所示的探針在制備檢測(cè)檢測(cè)人 類TOGFRa基因D842_H845del突變或I843_D846del突變的試劑中的用途。
[0013] 優(yōu)選地，所述試劑還包括SEQ ID N0. 4~5所示引物對(duì)與SEQ ID N0. 6所示的探 針或SEQ ID N0. 7~9所示引物與SEQ ID N0. 10所示的探針。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)人類TOGFRa基因D842_H845del或I843_D846del突變 突變的試劑盒，它包括SEQ ID NO. 1~2和SEQ ID N0. 3所示的探針。
[0015] 優(yōu)選地，它還包括質(zhì)控引物與質(zhì)控探針：SEQ ID N0. 4~5所示引物對(duì)與SEQ ID NO. 6所示的探針或SEQ ID NO. 7~9所示引物與SEQ ID NO. 10所示的探針。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)人類TOGFRa基因D842_H845del突變或I843_D846del 突變的方法，它包括如下步驟：
[0017] (1)提取樣本DNA :取待檢組織，提取其中的DNA ;
[0018] (2)基因擴(kuò)增：用前述的試劑盒對(duì)待檢樣本中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增；
[0019] (3)結(jié)果檢測(cè)：對(duì)DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。
[0020] 本發(fā)明根據(jù)TOGFRa基因D842_H845del突變和I843_D846del突變的交叉部分， 設(shè)計(jì)了特定的引物，用于檢出D842_H845del和I843_D846del突變。本發(fā)明試劑盒和方法可 以有效檢測(cè)D842_H845del突變和I843_D846del突變的交叉部分，而D842_H845del突變或 I843_D846del突變是不會(huì)同時(shí)出現(xiàn)的，因此，只要用本發(fā)明檢試劑盒和方法測(cè)出有突變，就 可以確證此種突變要么是D842_H845del突變，要么是I843_D846del突變。
[0021] 然而，無(wú)論是D842_H845del突變，還是I843_D846del突變，都會(huì)使得待檢患者對(duì) 治療藥物格列衛(wèi)敏感，因而本發(fā)明試劑盒可以有效篩查對(duì)格列衛(wèi)敏感的GIST患者。
[0022] 本發(fā)明提供的試劑盒可以準(zhǔn)確檢測(cè)待檢人群是否出現(xiàn)D842_H845de 1突變或 I843_D846del突變，為GIST患者的用藥提供指導(dǎo)，且檢測(cè)快速、簡(jiǎn)便，成本低廉，可以大量 推廣使用，臨床應(yīng)用前景良好。
[0023] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0024] 以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1 D842_H845del突變和I843_D846del突變
[0026] 圖2樣品1的測(cè)序結(jié)果
[0027] 圖3樣品2的測(cè)序結(jié)果
[0028] 圖4樣品3的測(cè)序結(jié)果
[0029] 圖5樣品1的檢測(cè)結(jié)果
[0030] 圖6樣品2的檢測(cè)結(jié)果
[0031] 圖7樣品3的檢測(cè)結(jié)果
[0032] 圖8D842_H845del突變DNA濃度梯度稀釋結(jié)果
[0033] 圖9I843_D846del突變DNA濃度梯度稀釋結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0034] 實(shí)驗(yàn)試劑：
[0035] Roche公司
[0036] FastStartTaqDNAPolymerase
[0037] CatNo. 12032937001
[0038] 大連Takara公司
[0039] UracilDNAGlycosylase(UNG),heatlabile200U2u/l
[0040] CatNo. 2820
[0041] 大連Takara公司
[0042] dUplusdNTPMixture(12. 5X)
[0043] (dATP2. 5mM,dGTP2. 5mM,dCTP2. 5mM,dUTP7. 5mM,)
[0044] CatNo. 4035
[0045] 大連Takara公司
[0046] TakaraTaqTMHotStartVersion
[0047] CatNo.R007A
[0048] 實(shí)施例1本發(fā)明檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法
[0049] -、本發(fā)明試劑盒的組成
[0050] PCR擴(kuò)增試劑（50人份）：
[0051]
[0052] TOGFRa基因D842_H845del突變或I843_D846del突變的擴(kuò)增引物以及檢測(cè)探 針：
[0053] 引物：
[0054] 5'-GATCCTGAGTCATTTCTTCCTTT-3'Forward
[0055] 5,-CATAGTTCGAATCTCTGGCCA-3' Reverse
[0056]探針：
[0057] FAM-ATGCAGTGTGTCCACCGTGATCTG-BQ1 Forward
[0058] 質(zhì)控引物及探針：
[0059] 引物：
[0060] CtlF內(nèi) 5'-cctcaagatcatcagcaatgcctc-3' Forward
[0061] CtlR內(nèi) 5'-GTGGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3'Reverse
[0062] 探針：
[0063] CtlP內(nèi)HEX-5,-TGGCCAAGGTCATCCATGACAACT-3,-BQ1Forward
[0064] 引物：
[0065] CtlFl外 5,_aaggtgatetatttttccctttct_3， Forward
[0066] CtlF2 外 5,-acaggtaaccatttatttgttctc-3' Forward
[0067] CtlR外 5,-CAAAACAAAGGAAGCCACTG-3' Reverse
[0068] 探針：
[0069] CtlP外FAM-5' -TGGGTACACATAACAGTGACTTTAAGGAAC-3' -BQ1Forward
[0070] 二、采用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)
[0071] 1、樣本DNA提取：可以使用Qiagen公司、天根公司、Promega公司等DNA提取試劑 盒提取。
[0072] 以石蠟組織樣本，用Qiagen公司試劑盒為例，提取DNA。
[0073] 1.利用手術(shù)刀取出組織邊界無(wú)用的石蠟；
[0074] 2.將石蠟包埋組織切成4μm厚的薄片；
[0075] 3.迅速用滅菌小鑷子取2-6枚裝入DNase/RNaseFreeEP管中（每張攤開(kāi)面積 500 (最大）mm2,即邊長(zhǎng)1. 6cm的正方形大??；
[0076] 4.加入800μ1二甲苯，振蕩器上震蕩10s，最大轉(zhuǎn)數(shù)離心3分鐘；
[0077] 5.加入800μ1二甲苯，振蕩器上震蕩10s，最大轉(zhuǎn)數(shù)離心3分鐘；
[0078] 6.棄二甲苯，加入800μ1無(wú)水乙醇，最大轉(zhuǎn)數(shù)離心3分鐘；
[0079] 7.棄無(wú)水乙醇，揮干樣品；
[0080] 8.加入 180μ1ALTbuffer及 20μ1proteinaseK，56°C-小時(shí)以上，直至清亮；
[0081 ] 9. 90°C一小時(shí)；
[0082] 10.離心6000glmin，取上清；（此步驟是防止沉淀物阻塞柱子）
[0083] 11.加入200μ1AL,混勻，加入200μ1乙醇，再混勻；
[0084] 12.簡(jiǎn)單離心清潔管壁；
[0085] 13.將全部混合液加入到DNA分離柱，關(guān)蓋，離心6000glmin，換新的收集管；
[0086] 14.加入 500μ1AW1, 6000g離心lmin;換收集管；
[0087] 15.加入 500μ1AW2,6000g離心lmin，換收集管；
[0088] 16.全速離心3min，干燥柱子；
[0089] 17.換一只干凈的1. 5ml收集管，準(zhǔn)備收集DNA;加入20-30μ1ATE，在室溫保持 lmin以溶解DNA。全速離心lmin收集DNA。
[0090] 2、定量PCR擴(kuò)增
[0091] TOGFRa基因D842_H845del突變和I843_D846del突變的擴(kuò)增引物以及檢測(cè)探 針：
[0092] 5,-GATCCTGAGTCATTTCTTCCTTT-3' Forward
[009