一種提高人金屬硫蛋白MT1b原核表達(dá)載體表達(dá)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一種提高人金屬硫蛋白MTlb原核表達(dá)載 體表達(dá)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 金屬硫蛋白（Metallothionein，MT),又稱疏基金屬結(jié)合蛋白。一類非酶蛋白質(zhì)， 除含有鎘（Cd)、鋅（Zn)的MT外，在自然界也存在含有銅（Cu)、汞（Hz)、金（Au)、鉍（Bi)等 元素的MT。MT的蛋白分子內(nèi)不含有芳香族氨基酸和組氨酸。讓MT中50%的金屬離子發(fā)生 解離的pH值分別為：Zn-MT:3. 5~4. 5 ;Cd-MT:2. 5~3. 5 ;Cu-MT〈1.0。因MT缺乏芳香族氨 基酸，故在280nm處無吸收峰，然而具有與金屬相關(guān)的吸收峰。去金屬的MT在190nm處有 一個(gè)吸收峰。所有脊椎動(dòng)物、多數(shù)植物和微生物體內(nèi)都含有MT。無論是自然產(chǎn)生還是誘導(dǎo) 產(chǎn)生的MT，其氨基酸組成基本相同、主要不同在所含金屬及其含量。目前產(chǎn)品主要從兔肝、 馬腎、豬肝和微生物（如粗脈孢菌）等中提取。
[0003] 關(guān)于金屬硫蛋白的功能和開發(fā)利用，自1978年到1999年先后在瑞士、日本、美國 共舉行了四次國際專題研討會(huì)，第五次國際專題研討會(huì)于2005年10月在北京召開。1987 年我國將MT列入[863]計(jì)劃，"八五"、"九五"重大攻關(guān)項(xiàng)目，1994年列入國家級(jí)[火炬計(jì) 劃];2003年MT項(xiàng)目被國家科技部列為"國家科技成果重點(diǎn)推廣計(jì)劃項(xiàng)目，1995年聯(lián)合國 將MT列入向世界各國推薦的生物技術(shù)產(chǎn)品。由此可見從國內(nèi)到國外對(duì)MT的研究、開發(fā)、推 廣、應(yīng)用的高度重視。
[0004] 關(guān)于MT蛋白的生物發(fā)酵生產(chǎn)，曾經(jīng)有用大腸桿菌、枯草桿菌、鏈球菌、酵母菌等基 因工程重組方法，但均由于表達(dá)量過低而至今未有投入生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于以上表達(dá)量不足的缺陷，本發(fā)明的主要目的是利用人工基因全合成的方法將 密碼子優(yōu)化，并且將表達(dá)子首尾串聯(lián)重復(fù)4次成為包含4拷貝MT順反子的原核（E.coli) 表達(dá)載體，用以提尚表達(dá)量。
[0006] -種提高人金屬硫蛋白MTlb原核表達(dá)載體表達(dá)量的方法，包括將含經(jīng)密碼子優(yōu) 化后的人金屬硫蛋白分子的編碼區(qū)的串聯(lián)單位在原核表達(dá)載體克隆區(qū)串聯(lián)重復(fù)4次形成 包含4拷貝人金屬硫蛋白順反子的串聯(lián)重復(fù)區(qū)；將含串聯(lián)重復(fù)區(qū)的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化原核 宿主細(xì)胞；培養(yǎng)并大量繁殖該細(xì)胞，利用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)導(dǎo)人金屬硫蛋白分子表達(dá)。
[0007] 其中，每個(gè)所述的串聯(lián)單位優(yōu)選包括核糖體結(jié)合區(qū)和經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人金屬硫 蛋白MTlb分子。
[0008] 每個(gè)所述的串聯(lián)單位還優(yōu)選包括位于串聯(lián)單位兩端的酶切位點(diǎn)。
[0009] 經(jīng)密碼子優(yōu)化后的MTlb編碼區(qū)序列優(yōu)選如SEQIDNO. 1所示。
[0010] 含經(jīng)密碼子優(yōu)化后的MTlb編碼區(qū)的串聯(lián)重復(fù)區(qū)序列如SEQIDNO. 2所示。
[0011] 經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人金屬硫蛋白MTlb編碼區(qū)基因序列，如SEQIDNO. 1所示。
[0012] -種用于提尚人金屬硫蛋白MTlb原核表達(dá)量的串聯(lián)重復(fù)區(qū)，所述的串聯(lián)重復(fù)區(qū) 由串聯(lián)單位重復(fù)串聯(lián)4次組成；所述的串聯(lián)單位包括核糖體結(jié)合區(qū)和經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人 金屬硫蛋白的編碼區(qū)。
[0013] 用于提高人金屬硫蛋白MTlb原核表達(dá)量的串聯(lián)重復(fù)區(qū)序列優(yōu)選自SEQID N0. 2。
[0014] -種表達(dá)人金屬硫蛋白MTlb的原核表達(dá)載體，所述的原核表達(dá)載體含有本發(fā)明 所述的串聯(lián)重復(fù)區(qū)。
[0015] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0016] 1、所述人MTlb蛋白的優(yōu)化密碼子提高了大腸桿菌內(nèi)該類密碼的可獲得性。
[0017] 2、所述MTlb原核表達(dá)載體中MTlb表達(dá)順反子增加了近3倍，MTlb的表達(dá)量由單 拷貝時(shí)的4. 1 %增加到平均9. 8%，表達(dá)量增加了2. 4倍；
[0018] 3、所述MT原核表達(dá)載體表達(dá)的MTlb蛋白為天然單分子，并非融合蛋白。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發(fā)明提供的一種MTlb串聯(lián)結(jié)構(gòu)不意圖。
[0020] 注解：示意圖中所代表的DNA序列為所構(gòu)建的原核表達(dá)載體的一部分，以 "T7promoter"開始，以"T7terminator"結(jié)束；"Lac operator"為lacl結(jié)合位點(diǎn)；"RBS"為 核糖體結(jié)合序列。"T7terminator"為T7B策菌體的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列（下同）。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步說明，但不作對(duì)本發(fā)明的限 定。
[0022] 采用的技術(shù)方案如下：
[0023] 首先，本發(fā)明第一步將人MTlb蛋白分子翻譯成cDNA序列，然后經(jīng)DNA2.0軟件優(yōu) 化MT cDNA的密碼子，使其更適合于大腸桿菌的密碼子偏好，并且對(duì)氨基端的起始15個(gè)氨 基酸編碼區(qū)進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，避免強(qiáng)二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，經(jīng)密碼子優(yōu)化后的MTlb編碼區(qū)序列如 SEQ ID NO. 1所示。
[0024] 第二步是用寡核苷酸分步延伸法合成MTlb的全長序列，5'端添加Ncol酶切位點(diǎn)， 3'端依次添加SpelNhel兩個(gè)酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物經(jīng)Ncol/Nhel雙酶切純化后，定容至 50ng/ul，再將原核表達(dá)載體pET28a(+)經(jīng)Ncol/Nhel酶切純化，定容至100ng/ul。
[0025] 第三步，連接與轉(zhuǎn)化：
[0026] MTlb 2ul pET28a(+)載體DNA(100ng/u]) :2ul 1(?:XT4DNA連接酶緩沖液 lul T4DNA連接酶（200U/ul) lul 消毒去離子水 4u:l
[0027] 1300rpm，離心5s，混勻，再同法離心一次，室溫靜置連接2小時(shí)。
[0028] 全部10ul轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)菌，經(jīng)靜置30m，熱激lm，加入1ml LB后，37度震蕩培 養(yǎng)lh后，離心4m(6000rpm，EP離心機(jī)），棄上清，懸浮沉淀物，均勾涂布于含卡那霉素的軟 瓊脂平皿上，37度溫箱過夜培養(yǎng)。次日調(diào)取克隆，PCR鑒定陽性重組體，陽性克隆經(jīng)測序分 析正確后，得到包含1拷貝MTlb順反子的克隆。
[0029] 接著進(jìn)行第一次串聯(lián)連接：
[0030] 取正確克隆1株，分別用兩管做酶切：管-1用酶Spel/BamHI雙切，回收大片段 (5. 5kb左右）作為載體；管-2用酶Xbal/BamHI雙切，回收235bps的片段。連接管-1和 管-2的回收產(chǎn)物，經(jīng)鑒定和DNA測序分析后，得到包含2拷貝MTlb順反子的MT重組表達(dá) 載體。
[0031] 第二步串聯(lián)連接：采用第一步串聯(lián)連接產(chǎn)物（包含2拷貝MT順反子的正確克?。?管-1用Spel/Xhol酶切，回收大片段（載體+2拷貝MT順反子）；管-2用Xbal/Xhol酶切， 回收537bps的DNA片段（包含2拷貝MT順反子）。再經(jīng)連接鑒定后，即可得到4拷貝MT 順反子的MTlb原核表達(dá)載體，其中含經(jīng)密碼子優(yōu)化后的MTlb編碼區(qū)的串聯(lián)重復(fù)區(qū)序列如 SEQ IDN0.2所示。
[0032] 小量搖瓶表達(dá)比較：
[0033] 分別取pET28a⑴空載體、MTlb單拷貝、2拷貝、4拷貝的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 BL21 (DE3)表達(dá)菌株，挑取單菌落分別接種4ml2XYT培養(yǎng)基（含50ug/ml卡那霉素）， 37°C，250rpm，震蕩培養(yǎng)，待到細(xì)菌生長至對(duì)數(shù)生長期，分別向各管加入0. 4ulIPTG，25°C誘 導(dǎo)培養(yǎng)6小時(shí)。收集lml菌液，離心沉淀，PBS洗一次，再用500ulPBS懸浮，超聲破碎細(xì) 胞，12000rpm/15分鐘，4°C離心棄沉淀，取上清上樣20%SDS-PAGE，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)顯色，脫 色，凝膠成像儀計(jì)算目標(biāo)條帶占總蛋白的比例，結(jié)果（如下）顯示隨拷貝數(shù)增加，表達(dá)量增 高（按目標(biāo)條帶密度占總蛋白密度百分比計(jì)算）。
[0034] 表1.不同MTlb拷貝數(shù)載體在小量搖菌條件下目標(biāo)條帶密度占總蛋白密度百分比
[0035]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提高人金屬硫蛋白MTlb原核表達(dá)載體表達(dá)量的方法，其特征在于包括將含經(jīng) 密碼子優(yōu)化后的人金屬硫蛋白MTlb分子的編碼區(qū)的串聯(lián)單位在原核表達(dá)載體克隆區(qū)串聯(lián) 重復(fù)4次形成包含4拷貝人金屬硫蛋白順反子的串聯(lián)重復(fù)區(qū)；將含串聯(lián)重復(fù)區(qū)的原核表達(dá) 載體轉(zhuǎn)化原核宿主細(xì)胞；培養(yǎng)并大量繁殖該細(xì)胞，利用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)導(dǎo)人金屬硫蛋白分子表 達(dá)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于每個(gè)所述的串聯(lián)單位包括核糖體結(jié)合區(qū)和 經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人金屬硫蛋白分子。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于每個(gè)所述的串聯(lián)單位還包括位于串聯(lián)單位 兩端的酶切位點(diǎn)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于經(jīng)密碼子優(yōu)化后的MTlb編碼區(qū)序列如SEQ ID NO. 1 所示。5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于含經(jīng)密碼子優(yōu)化后的MTlb編 碼區(qū)的串聯(lián)重復(fù)區(qū)序列如SEQ ID NO. 2所示。6. 經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人金屬硫蛋白分子MTlb編碼區(qū)基因序列，其特征在于序列如SEQ ID NO. 1 所示。7. -種用于提高人金屬硫蛋白MTlb原核表達(dá)量的串聯(lián)重復(fù)區(qū)，其特征在于所述的串 聯(lián)重復(fù)區(qū)由串聯(lián)單位重復(fù)串聯(lián)4次組成；所述的串聯(lián)單位包括核糖體結(jié)合區(qū)和經(jīng)密碼子優(yōu) 化后的人金屬硫蛋白的編碼區(qū)。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的串聯(lián)重復(fù)區(qū)，其特征在于所述的串聯(lián)重復(fù)區(qū)序列為SEQ ID NO. 2 〇9. 一種表達(dá)人金屬硫蛋白MTlb的原核表達(dá)載體，其特征在于所述的原核表達(dá)載體含 有權(quán)利要求9或10所述的串聯(lián)重復(fù)區(qū)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高人金屬硫蛋白MT1b原核表達(dá)載體表達(dá)量的方法。該方法包括：人工合成密碼子優(yōu)化的MT1b？DNA分子，該分子還包括DNA內(nèi)切酶識(shí)別序列NcoI、SpeI、NheI；將所述DNA分子構(gòu)建到pET28a(+)的NcoI/NheI克隆區(qū)；再經(jīng)過系列重組使包含核糖體結(jié)合區(qū)的MT1b編碼基因擴(kuò)增到4拷貝。本發(fā)明的方法適用于所有小分子多肽(100個(gè)氨基酸以內(nèi)的)表達(dá)載體的構(gòu)建，整個(gè)過程操作簡單，快速，所制備的原核表達(dá)載體提高了MT1b蛋白的表達(dá)量，降低了成本，提高了工作效率。
【IPC分類】C12N15/70, C12N15/12, C12N15/69
【公開號(hào)】CN105238803
【申請?zhí)枴緾N201510703788
【發(fā)明人】李萬波
【申請人】盤古基因生物工程(南京)股份有限公司
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年10月26日