GMA)的聚類而測量出的相似 性的量。
[0039] 示例 1
[0040] 養(yǎng)豬場糞肥中的氨氣排放的測試
[0041] 在兩個豬畜舍中進(jìn)行氨氣排放的測量。在其中一個畜舍中，使用專利申請 NL2009019中描述的裝置處理來自豬的漿料。將以保藏號CBS134115存放于CBS的聚生體 噴在畜舍1中豬所排泄的漿料上。畜舍2中的漿料未經(jīng)所述聚生體處理。
[0042] 每個畜舍中飼養(yǎng)80頭豬，并進(jìn)行為期12周的測量。在12周中的每一天，將 包含有聚生體的組合噴在蓄舍1中。利用包含有吸收液的洗氣瓶進(jìn)行取樣，利用標(biāo)準(zhǔn) NEN2826(NEN2826, 1999:Luchtkwaliteit.Uitworpdoorstationairepuntbronnen. Monsternemingenbepalingvanhetgehalteaangasvormigammoniak)測量 24小時內(nèi) NH3的排放。通過實(shí)施吸收法和濕化學(xué)分析來對氨氣進(jìn)行測定。
[0043] 在飼養(yǎng)豬的數(shù)周的幾個周期以及一年的幾個月中采集樣本。表1顯示了氨氣排放 的結(jié)果。相比于蓄舍2的糞肥，經(jīng)過以保藏號CBS134115存放于CBS聚生體處理的糞肥中氨 氣排放平均降低了 35%。在幾個季節(jié)（夏季，冬季和秋季）以及在豬的不同生長階段（全 部12周，以及每兩周為期算作1階段）進(jìn)行測量。
[0044] 在測量的設(shè)置的階段，兩個蓄舍中的動物數(shù)量、動物的年齡和重量均相似。
[0045] 表 1
[0046]
[0047] 示例 2
[0048] 養(yǎng)豬場糞肥中的甲烷排放的測試
[0049] 進(jìn)行如示例1中相似的設(shè)置。通過采集樣本并采用根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)NEN-EN的Lung方法， 在24小時內(nèi)對甲烷進(jìn)行測量。
[0050] 比較兩個不同養(yǎng)豬場，有平均19%的甲烷減少量。
[0051] 表2顯示了一個養(yǎng)豬場中相比于沒有加入聚生體混合物的豬舍2 (對照），糞肥中 加入了聚生體混合物的豬舍1的甲烷測量的結(jié)果。
[0052]
[0053]
[0054] 示例 3
[0055] 聚生體的鑒別
[0056] 對以保藏號NRCBS134115存放于CBS的聚生體的樣本進(jìn)行分析以鑒別其組分。 通過比利時根特的BCCM?/LMG鑒別服務(wù)進(jìn)行分析。
[0057] 無菌條件下，對樣本進(jìn)行等分取樣（幾滴），并將其均勻分散在：
[0058] -LMG培養(yǎng)基nr. 66 (MRS)，并在37°C下的厭氧條件下孵育1天，
[0059] -LMG培養(yǎng)基nr. 37 (RCM)，并在°C下的厭氧條件下孵育1天，
[0060] -LMG培養(yǎng)基nr. 13,并在28°C下的有氧條件下孵育1天，
[0061] -LMG培養(yǎng)基nr. 185(TSA)，并在28°C下的有氧條件下孵育2天。
[0062] 在不同的介質(zhì)中，觀察到了不同菌落類型，并且為了進(jìn)一步分析對該菌落進(jìn)行純 化。
[0063] 將四種經(jīng)過純化的菌落（tl、t2、t6和t7)采用AFLP?進(jìn)行DNA指紋識別。AFLP? 是一種用于通過選擇性擴(kuò)增限制性片段進(jìn)行全基因組指紋識別的基于PCR的技術(shù)（Vos 等.，NucleicAcidsResearch23:4407-4414(1995))。使用引物組合E01/Tll(Keygene)。
[0064] 以乳酸菌類群（包含雙歧桿菌）的AFLP?DNA指紋圖譜為參考的AFLP?DNA 指紋圖譜的聚類分析鑒別出鼠李糖乳桿菌（tl)、干酪乳桿菌（t2)、加納乳桿菌 (Lactobacillusghanensis)(t6)和類干酪乳桿菌（t7)的培養(yǎng)物。應(yīng)當(dāng)指出的是，文獻(xiàn) 資料表明干酪乳桿菌的菌株類型屬于玉米乳桿菌種類。然而，原核生物系統(tǒng)學(xué)方面的國 際委員會的司法委員會規(guī)定不應(yīng)使用玉米乳桿菌這一名稱（Int.J.Syst.Evol.Microbi ol. 58:1764-1765, (2008)) 〇
[0065] 將兩個經(jīng)過純化的菌落（t3和t4)進(jìn)行部分16SrDNA序列分析。按照Niemann等 人的方案（J.Appl.Microbiol. 82:477-484 (1997))制備總DNA。使用保守性引物利用PCR 對16SrDNA的基因（對應(yīng)于大腸桿菌編號系統(tǒng)的8-1541位置）的片段進(jìn)行擴(kuò)增。使用 Nuc丨coFast?96的PCRClean-up試劑盒（Macherey-Nagel公司，德國）對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純 化。使用BigDy_e?XTerminatorT純化試劑盒（AppliedBiosystems公司，美國）進(jìn)行測序 反應(yīng)。通過使用軟件包BioNumerics(AppliedMaths公司，比利時）進(jìn)行序列組裝。
[0066] 在從國際核苷酸序列庫EMBL收集的核糖體小亞基序列的比對中包含一致性序列 后使用軟件包BioNumerics(AppliedMaths公司，比利時）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。
[0067]以0%的空位罰分的同源性計算建立相似性矩陣；排除未知堿基。用這種方法， 與幾個被有效記載的芽孢桿菌屬種類具有97 %以上的相似性，對可能物種鑒定具有顯著意 義。然而，由枯草芽孢桿菌-復(fù)合物（一系列高度相關(guān)物種，目前包含枯草芽孢桿菌、解淀粉 芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌、死谷芽孢桿菌、摩加夫芽孢桿菌、特基拉芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌 和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌）的所有被有效記載的種類獲得的高度序列相似性（99. 1-100%， 基于部分序列）表明培養(yǎng)物中的一個（t3)屬于這些種類中的一個。對于其他培養(yǎng)物，與 幾個被有效記載的乳酸菌種類具有97%以上的相似性，對可能物種鑒定具有顯著意義。然 而，與干酪乳桿菌（99. 7% )和玉米乳桿菌（99. 6% )的菌株類型獲得的高度序列相似度 (99. 6-99. 7%，基于部分序列）表明該培養(yǎng)物（t4)屬于這些種類中的一個，特別是屬于干 酪乳桿菌。
[0068] 為了進(jìn)一步分析樣本，在無菌條件下進(jìn)行等分取樣，并且在生理水中進(jìn)行系列 (十倍）稀釋。將〇.lml的等分樣本均勻分散在：
[0069] -LMG培養(yǎng)基nr. 185 (TSA)，并在28°C下的有氧條件孵育3天。
[0070] 發(fā)現(xiàn)了一種其他的菌落類型（t8)，經(jīng)過純化后通過如上所述的部分16SrDNA序 列分析對其進(jìn)行進(jìn)一步的分析。用這種方法，與幾個被有效記載的乳酸桿菌種類具有97% 以上的相似性，對可能物種鑒定具有顯著意義。然而，與類干酪乳桿菌兩個亞種的菌株類型 獲得的高度序列相似度（99. 6-99. 9%，基于部分序列）表明該培養(yǎng)物（t8)屬于這一物種。
[0071]
【主權(quán)項】
1. 一種細(xì)菌，包含部分16S rDNA核苷酸序列，其中所述部分16S rDNA核苷酸序列具有 與SEQ ID NO: 1所示序列或其互補(bǔ)序列高于85%的序列同源性。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌具有與SEQ ID NO: 1所示序列或其互補(bǔ) 序列高于99. 6 %的序列同源性。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌為擬桿菌種類。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌以保藏號CBS 134116存放于CBS。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌具有SEQ ID NO: 1所示的序列或其互 補(bǔ)序列。6. -種用于改善糞肥或土壤的微生物聚生體，包括根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的細(xì)菌。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的聚生體，其中所述聚生體進(jìn)一步包括糖類，優(yōu)選地為單糖和/ 或雙糖。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的聚生體，其中所述糖類來源于甘蔗或甜菜，并且優(yōu)選地為 甘蔗蜜。 9. SEQ ID NO: 1用于檢測或鑒定具有所述核苷酸序列或與SEQ ID NO: 1所示序列至少 85 %序列同源性的細(xì)菌的應(yīng)用。10. -種微生物聚生體，包含減少氨氣和/或甲烷排放的微生物，其中在以保藏號 CBS134115存放于CBS的聚生體中含有所述微生物。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的微生物聚生體，包括一種或多種選自由鼠李糖乳桿菌、 干酪乳桿菌、加納乳桿菌Lactobacillus ghanensis、類干酪乳桿菌、狹義枯草芽孢桿 菌Bacillus subtilis sensu stricto、解淀粉芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌、死谷芽孢桿菌 Bacillus vallismorits、摩加夫芽抱桿菌、特基拉芽抱桿菌Bacillus tequilensis、逼羅 芽孢桿菌Bacillus siamensis、和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌所組成的組的細(xì)菌。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的微生物聚生體，包括鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌、加納乳桿 菌、類干酪乳桿菌、狹義枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌、死谷芽孢桿菌、摩 加夫芽孢桿菌、特基拉芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的細(xì)菌。13. 根據(jù)權(quán)利要求10-12所述的微生物聚生體，包含以保藏號CBS134115存放于CBS的 聚生體。14. 根據(jù)權(quán)利要求1-5的細(xì)菌或根據(jù)權(quán)利要求6-8或10-13的聚生體用于減少糞肥或 土壤中氨氣和/或甲烷排放的應(yīng)用。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中所述糞肥為動物糞肥。16. -種糞肥，包含根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的細(xì)菌或根據(jù)權(quán)利要求6-8或10-13所述的 聚生體。17. -種用于減少糞肥或土壤中氨氣和/或甲烷的方法，包含以下步驟：向糞肥或土壤 中加入根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的細(xì)菌或根據(jù)權(quán)利要求6-8或10-13所述的聚生體；以及對 所述細(xì)菌或聚生體進(jìn)行足夠時間的孵育，以減少所述糞肥中氨氣和/或甲烷的形成。18. 根據(jù)權(quán)利要求16所述糞肥作為有機(jī)肥料的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于改善糞肥或土壤的新型細(xì)菌和微生物聚生體，其中所述細(xì)菌包含部分16S？rDNA核苷酸序列，所述部分16S？rDNA核苷酸序列具有與SEQ？ID？NO:1所示序列或其互補(bǔ)序列高于85％的序列同源性。CBS 13411620121227
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/01, A01C3/00, C02F3/34
【公開號】CN105051177
【申請?zhí)枴緾N201380069041
【發(fā)明人】林茨·姚斯特拉
【申請人】瑞納戈若有限公司
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2013年12月23日
【公告號】CA2894824A1, EP2938720A1, WO2014104883A1