一種以內(nèi)標為基礎(chǔ)的蘋果銹果類病毒rt-pcr檢測技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種以內(nèi)標為基礎(chǔ)的蘋果銹果類病毒RT-PCR檢測技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]蘋果銹果病又名花臉病或裂果病，是對蘋果危害較重的非潛隱性病毒之一，也是中國蘋果病毒的重要檢疫對象，廣泛分布于東北、西北、華北各蘋果產(chǎn)區(qū)，發(fā)病嚴重的果園病株率高達30 %以上，有擴大蔓延的趨勢；當今技術(shù)水平下，尚無有效的防治藥劑，采用脫毒方法繁殖無病毒苗木是目前最為有效的防治手段，準確、靈敏、快速的檢測技術(shù)是果樹無毒化栽培的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和基本保障；但因病毒在樹體內(nèi)含量低、分布不均、受外界因素影響大、組織富含多糖、多酚等特點，在檢測過程中易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象，目前，國內(nèi)外已有ASSVdPCR檢測的報道，但尚未見以內(nèi)標為基礎(chǔ)的ASSVd RT-PCR檢測技術(shù)的報道；本發(fā)明開發(fā)了含有nad 5內(nèi)標基因的蘋果銹果類病毒RT-PCR檢測技術(shù)，成功克服了假陰性現(xiàn)象，為該病毒的準確檢測、無毒苗木的高效繁育奠定基礎(chǔ)，為今后蘋果病毒病的有效防治提供理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明建立了一種以內(nèi)標為基礎(chǔ)的蘋果銹果類病毒RT-PCR檢測技術(shù)，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案:提取蘋果組織總RNA，以蘋果銹果類病毒及一種蘋果內(nèi)源基因為引物，通過RT-PCR方法擴增蘋果銹果類病毒及蘋果內(nèi)源基因的特異性序列，蘋果內(nèi)源基因起到排除假陰性對照的作用，最后通過凝膠電泳觀察擴增產(chǎn)物，判定組織中是否含蘋果銹果類病毒，本發(fā)明的具體內(nèi)容，即以內(nèi)標為基礎(chǔ)的蘋果銹果類病毒RT-PCR檢測技術(shù)的具體方法如下:
(1)蘋果組織總RNA的提取以帶有葉芽一年生枝條頂端0~5cm皮層組織為試材，采用針對富含多糖多酚組織的RNA提取改良法提取總RNA，定容于20 μ L除RNase水中，-80°C保存?zhèn)溆茫?br> (2)病毒特異性基因序列的擴增以步驟(I)獲得的總RNA為模板，進行RT-PCR得到擴增產(chǎn)物。以ASSVdQCxin和nad 5為引物，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進行cDNA合成，兩對引物分別為:蘋果銹果類病毒引物:ASSVdQCxin-3’:CACCAGTTCCGCTGTGGGTTC，ASSVdQCxin-5’:GCCTACAAGAACGTACGGTGTTGA G，第 2 對蘋果內(nèi)源基因引物-,nad 5-3;:CTCCAGTCACCAACATTGGCATAA，/?ai/ 5~W:GATGCTTCTTGGGGCTTCTTGTT；
(3)瓊脂糖凝膠電泳檢測取5UL PCR擴增產(chǎn)物(蘋果銹果類病毒特異性片段大小為330 bp，蘋果內(nèi)源基因rmd 5#異性片段大小為181 bp), 1.5%瓊脂糖凝膠在I XTAE緩沖液中進行電泳分析，100V電泳40分鐘，EB染色后，觀察結(jié)果，根據(jù)電泳條帶有無及大小判斷是否帶毒；
本發(fā)明專利的有益效果是，通過設(shè)計蘋果銹果類病毒特異性引物及能夠排除假陰性現(xiàn)象的蘋果內(nèi)源基因引物，進行檢測體系及程序的優(yōu)化，建立了一種利用內(nèi)標為基礎(chǔ)的蘋果銹果類病毒RT-PCR檢測技術(shù)體系，避免了常規(guī)PCR的假陰性結(jié)果，檢測穩(wěn)定性好，特異性強，可用于田間樣本及組培苗帶毒情況的快速檢測，為蘋果無毒苗木的繁育提供技術(shù)支持，為蘋果銹果類病毒病害防控奠定基礎(chǔ)，減少病害造成的損失。
【附圖說明】
[0004]圖1是田間果樹攜帶蘋果銹果類病毒情況的RT-PCR檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0005]以帶有葉芽蘋果一年生枝條頂端0~5 cm皮層組織為試材，取100 mg組織，在液氮中迅速研磨，加0.5 mL提取試劑(400 yL RNA提取試劑+100 μ?β-巰基乙醇)進行提取，最后加入20 μ L DEPC水充分溶解RNA。然后以特異性引物ASSVdQCxin和nad 5為引物，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進行cDNA合成，以合成的cDNA為模板，配制以下PCR反應(yīng)體系:cDNA模板 3.0 yL，ASSVdQCxin-3’(20 pmol/^L) I μ L，ASSVdQCxin-5’(20 pmol/^L) I μ L，nad 5~?> (20 pmol/M-L)0.1 μ L, nad 5^5，(20 pmol/M-L) 0.1 μ L，2 X ES Taq Mastermix12.5 μ L，用ddH20補足25 μ L ;PCR程序為:預(yù)變性94°C 3 min ;35個循環(huán):94°C變性Imin，6L 0°C退火 45 s，72°C延伸 30 s ;72°C終延伸 10 min ;取 5 μ L PCR 擴增產(chǎn)物，L 5%瓊脂糖凝膠在IXTAE緩沖液中進行電泳分析，100V電泳40分鐘，EB染色后，觀察結(jié)果，根據(jù)電泳條帶有無及大小判斷是否帶毒(ASSVd特異性片段大小為330 b^,nad 5#異性片段大小為181 bp)。
【主權(quán)項】
1.一種以內(nèi)標為基礎(chǔ)的蘋果銹果類病毒RT-PCR檢測技術(shù)，其特征在于通過提取蘋果組織總RNA，采用蘋果銹果類病毒及一種蘋果內(nèi)源基因的特異性引物，通過RT-PCR方法擴增銹果類病毒及蘋果內(nèi)源基因特異性序列，凝膠電泳觀察擴增產(chǎn)物有無及大小，判定組織是否帶毒。2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)蘋果組織總RNA的提取以帶有葉芽一年生枝條頂端0~5cm皮層組織，采用針對富含多糖多酚組織的RNA提取改良法提取總RNA，定容于20 μ L除RNase水中，_80°C保存?zhèn)溆? (2)病毒特異性基因序列的擴增以步驟(I)獲得的總RNA為模板，以ASSVdQCxin和irnd 5"為引物，以M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，兩種引物為:蘋果銹果類病毒引物:ASSVdQCxin-3’:CACCAGTTCCGCTGTGGGTTC ;ASSVdQCxin_5’:G C C TACAAGAACGTACGGTGTTGA G，蘋果內(nèi)源基因引物-,rmd 5~?>':C T C C AGTCACCAACATTGGCATAA ；nad 5-5':GATGCTTCTTGGGGCTTCTTGT T，以合成的cDNA為模板，配制以下反應(yīng)體系進行PCR擴增:cDNA模板3.0μ L，ASSVdQCxin-3’(20 pmol/^L) I μ L，ASSVdQCxin-5’(20 pmol/^L) I μ L, nad 5^3'(20 pmol/M-L)0.1 μ L, nad ?5^5' (20 pmol/M-L) 0.1 μ L, 2 X ES Taq Mastermix 12.5 μ L,用ddH20補足25 yL ;PCR程序為:預(yù)變性94°C 3 min ;35個循環(huán):94°C變性I min，61.0°C退火 45 s，72°C延伸 30 s ;72°C終延伸 10 min ； (3)瓊脂糖凝膠電泳檢測及判斷標準取5UL PCR擴增產(chǎn)物，1.5%瓊脂糖凝膠在IXTAE緩沖液中進行電泳分析，100V電泳40分鐘，EB染色后，觀察結(jié)果，根據(jù)電泳條帶有無及大小判斷是否帶毒；蘋果銹果類病毒330 bp，蘋果內(nèi)源基因Z7ai/ 5#異性片段大小為.181 bp ;判斷標準為:未擴增出內(nèi)源基因特異性片段即代表實驗失??；擴增出內(nèi)源基因特異性片段即代表實驗有效；擴增出內(nèi)源基因特異性片段及銹果類病毒特異性片段即代表蘋果組織中帶有銹果類病毒；擴增出內(nèi)源基因特異性片段，未擴增出銹果類病毒特異性片段即代表組織中不帶有銹果類病毒。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種以內(nèi)標為基礎(chǔ)的蘋果銹果類病毒RT-PCR檢測技術(shù)。以帶有葉芽蘋果一年生枝條頂端0~5cm皮層組織為試材，采用RNA提取改良法提取組織總RNA，以總RNA為模板，蘋果銹果類病毒特異性引物和蘋果內(nèi)源基因引物進行RT-PCR反應(yīng)，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳中擴增產(chǎn)物的有無和大小判斷蘋果組織是否攜帶蘋果銹果類病毒。判斷標準為：未擴增出內(nèi)源基因特異性片段即代表實驗失??；擴增出內(nèi)源基因特異性片段即代表實驗有效；擴增出內(nèi)源基因特異性片段及蘋果銹果類病毒特異性片段即代表蘋果組織中攜蘋果帶銹果類病毒；擴增出內(nèi)源基因特異性片段，未擴增出蘋果銹果類病毒特異性片段即代表組織中不攜帶蘋果銹果類病毒。
【IPC分類】C12R1/94, C12Q1/70, C12Q1/68
【公開號】CN104962662
【申請?zhí)枴緾N201510449388
【發(fā)明人】王亞南, 楊金鳳, 曹克強
【申請人】河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2015年7月29日