丁香假單胞菌黃瓜致病變種黃瓜株系Padlock探針及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及丁香假單胞菌黃瓜致病變種（Pseudomonas syringaepv.lachrymans)黃瓜株系Padlock探針及應(yīng)用。本發(fā)明提供的探針適用于口岸 檢驗檢疫、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、植物保護等部門使用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃瓜細菌性角斑病是在黃瓜上由丁香假單胞菌黃瓜致病變種（Pseudomonas syringaepv.lachrymans)引起的的一種常見細菌性病害。主要在黃瓜幼苗和成株上發(fā)病， 為害葉片、葉柄、卷須、莖蔓和瓜條。發(fā)病初始時產(chǎn)生水漬狀小斑點，因受葉脈的限制，后期 病斑呈現(xiàn)多角形，淡黃色至褐色，最后葉會干枯、破裂。黃瓜細菌性角斑病菌在發(fā)病葉片背 部溢出乳白色的菌膿，但這種典型癥狀特點我們在實際田間或者大棚內(nèi)不太能經(jīng)?？吹?。 一般我們能看到色澤不一致的多角形病斑。病菌在植物體內(nèi)的新陳代謝作用往往受溫度所 影響，其最適溫度為25°C左右。在適宜發(fā)病條件下，黃瓜細菌性角斑病的發(fā)病、擴展蔓延的 時間很短，能使整株黃瓜葉片枯死，影響植株結(jié)果，造成嚴重的經(jīng)濟損失。
[0003] 黃瓜細菌性角斑病主要以帶菌種子進行遠距離傳播，種子也可隨病殘體遺留于土 壤中作為最初侵染源。角斑病菌通過水濺或者其他途徑，侵入幼苗子葉、水孔或傷口，引起 寄主發(fā)病。黃瓜細菌性角斑病菌除了能侵染黃瓜外，還能侵染萌蘆、西萌蘆等萌蘆科，以及 一些非萌蘆科作物。近年來黃瓜細菌性角斑病在中國有逐年加重的趨勢，將嚴重影響黃瓜 產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此對黃瓜細菌性角斑病菌的研宄具有重要的經(jīng)濟價值。
[0004] 國內(nèi)第一例黃瓜細菌性角斑病由俞大紱等報道，黃瓜細菌性角斑病在國內(nèi)的 傳播蔓延和為害情況從八十年代末開始開始受到關(guān)注。黃仲生等于北京、內(nèi)蒙和遼寧 三地的黃瓜上分離到大量菌株，經(jīng)過鑒定均為丁香假單胞菌黃瓜致病變種（P.syringae pv.lachrymans)，同時對其發(fā)病癥狀同樣進行了描述。1991年金潛等人通過一系列的實驗 證明黃瓜細菌性角斑病和甜瓜細菌性角斑病均是丁香假單胞菌黃瓜致病變種引起的（金 潛等，1991)。1988年孫福等人在黃瓜病株上分離得到該病原菌并通過人工接種的方法研宄 了其寄主范圍，其黃瓜病株來源于遼寧省、內(nèi)蒙古和北京市等地（孫福在等，1988)。2000， 年張昕等人在新疆哈密瓜上分離到11個菌株，通過一系列鑒定方法發(fā)現(xiàn)有9株為丁香假單 胞菌黃瓜致病變種（張昕等，2001)。2004-2005年，李亞利等在甘肅省瓜類植株上采集到葉 片和果實，該葉片和果實具有類似于西瓜果斑病的癥狀，通過分子生物學(xué)方法鑒定病原菌 為黃瓜細菌性角斑病菌，并證明了黃瓜細菌性角斑病菌還可以侵染辣椒、番茄等茄科植物 (李亞利等，2006)
[0005] Padlock探針是一條長的寡聚核苷酸鏈，長度為100bp左右，探針兩端（磷酸化的 5端和羥基化的3端）能與目的片段進行特異性的結(jié)合。探針兩端稱為T1端和T2端，探針 兩端有很強的特異性，只有與目標片段完全匹配時，其在連接酶的作用下，探針兩端與靶標 片段互補形成環(huán)狀。為了使這項技術(shù)用于病原菌的診斷，Marianna Szemes等人對如何保 證高特異性和在實際檢測中沒有目的靶標的情況下如何消除自身連接反應(yīng)進行了優(yōu)化。將 T1端和T2端設(shè)計成不對稱的兩端，并且T2端（3'端）明顯短于T1端（5'端）（Marianna Szemes等 2005)。
[0006]Padlock探針除了T1端和T2端外，還包括一段特異性序列和通用序列，特異性序 列我們稱為zipcode，通用序列稱為P1端和P2端。將目標檢測物提取DNA后，將待檢測的 DNA與設(shè)計好的探針進行連接，在連接酶的作用下探針T1端和T2端與靶標DNA完全序列互 補時，探針T1端和T2端在靶DNA上相鄰連接形成穩(wěn)定的環(huán)狀（LarssonC，2004)。探針不 能與DNA完全匹配時則以線狀存在。然后用核酸外切酶I和核酸外切III對錯配和沒有成環(huán) 狀的探針進行消化去除，消化后用通用引物對消化后的產(chǎn)物進行普通PCR擴增。產(chǎn)物進行 凝膠電泳通過電泳條帶的有無能初步判定檢測結(jié)果。為進一步確定實驗的可靠性，將擴增 后的產(chǎn)物進行雜交。先將zipcode的反向互補序列用地高辛標記，產(chǎn)物固定于尼龍膜上，然 后將標記好的zipcode的反向互補序列與尼龍膜上的產(chǎn)物進行雜交，通過膜上的雜交信號 能更好的判定目標檢測物中是否存在特定的病原檢測物。
[0007]MariannaSzemes等，運用Padlock探針結(jié)合Microarray技術(shù)對十種重要的植物 病原菌進行了檢測并對這種技術(shù)成功的進行了優(yōu)化，結(jié)果表明這是一種靈敏度跟特異性很 好，效率很高的高通量檢測技術(shù)。
[0008] 田艷麗（2008)對6種重要植物病原菌進行了高通量檢測，其中包括四種我國對外 檢疫病原菌。并且成功的將其運用于實際樣品檢測，其中在瓜類細菌性果斑病菌上設(shè)計的 Padlock探針能將其成功與燕麥褐條病菌區(qū)分開，并且這兩種病原菌所選的特異性序列只 有一個堿基的差異。這是其它分子檢測手段很難達到的（田艷麗，2008)。
[0009] 王輝等Padlock探針技術(shù)用于5種支原體的檢測，將ITS間隔區(qū)作為靶標區(qū)域。并 同時進行了 5種支原體的高通量檢測。結(jié)果表明多重檢測結(jié)果與單一的探針檢測結(jié)果相一 致。有高敏感性和特異性（王輝等2010)。
[0010]目前主要用普通PCR對丁香假單胞菌黃瓜致病變種黃瓜株系進行檢測，而普通 PCR容易出現(xiàn)假陽性等問題，發(fā)明Padlock探針的目的在于避免常規(guī)的PCR等檢測方法易受 檢測樣品中雜質(zhì)干擾、以及假陽性的現(xiàn)象。
[0011] Padlock探針有很強的特異性，能夠檢測單堿基突變，彌補了普通PCR的不足。設(shè) 計探針的前期是找到一條特異性的序列，得到特異性序列后并不能簡單的得到一條特異性 探針。特異性探針的設(shè)計是一個大量篩選和反復(fù)驗證的過程。Padlock探針是一條長的寡 聚核苷酸鏈，長度為l〇〇bp左右，探針兩端（磷酸化的5端和羥基化的3端）能與目的片段 進行特異性的結(jié)合。探針兩端稱為T1端和T2端，探針兩端需要有很強的特異性，所以T1 端和T2端的位置、長度、GC含量等都要經(jīng)過反復(fù)考量，無數(shù)次的試驗后最后才有可能得到 一條特異性強和靈敏度高的探針。
[0012] Padlock探針具有很強的特異性，只有與目標片段完全匹配時它才能形成環(huán)狀， Padlock探針能夠檢測單堿基突變，探針不能與DNA完全匹配時則以線狀存在。然后用 Exonuclease I和Exonuclease III錯配和沒有成環(huán)狀的探針進行消化去除，消化后用通用 引物對消化后的產(chǎn)物進行普通PCR擴增。將Padlock探針結(jié)合Microarray技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn) 丁香假單胞菌黃瓜致病變種黃瓜株系高通量檢測。此方法避免了常規(guī)的PCR等檢測方法易 受檢測樣品中雜質(zhì)干擾、以及假陽性的現(xiàn)象。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明的目的在于提供了一種丁香假單胞黃瓜致病變種黃瓜株系的Padlock探 針，探針序列為SEQIDNO. 1所示。利用本發(fā)明提供探針，可避免常規(guī)的PCR等檢測方法易 受檢測樣品中雜質(zhì)干擾、以及假陽性的現(xiàn)象?？蓪Χ∠慵賳伟S瓜致病變種黃瓜株系進 行檢測，并且特異性強、靈敏度高。
[0014] 本發(fā)明的另一個目的在于提供丁香假單胞黃瓜致病變種黃瓜株系的Padlock探 針的應(yīng)用，包括利用該探針制備丁香假單胞黃瓜致病變種黃瓜株系檢測試劑盒，或?qū)⑵渑c Macroaary結(jié)合進行高通量檢測。
[0015] 為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：
[0016] 本發(fā)明的發(fā)明思路為：將丁香假單胞黃瓜致病變種黃瓜株系與其他細菌的序列用 軟件進行序列比對，選取核苷酸特異部分為Padlock探針為T2端，靠近T2端的作為T1端。 然后與GenBank登錄的所有細菌序列比較以確保待檢測細菌Padlock探針的特異性。特異 性探針的設(shè)計是一個大量篩選和反復(fù)驗證的過程，T1端和T2端為不對稱的兩端，并且T2端 (3端）明顯短于T1端（5端），T1端和T2端的位置、長度、GC含量等都要經(jīng)過反復(fù)考量，試 驗。探針的總長度為l〇〇bp左右，所以T1端和T2端的長度和位置都是可變的，設(shè)計過程中 先確定一個位點，分別從兩邊設(shè)計T1端和T2端，若先確定T1端后，T2端從10-25個堿基數(shù) 依次試驗特異性，若先確定T2端的數(shù)量，則依次找尋最佳T1端位置和數(shù)量，直到找到最佳 位點設(shè)計特異的T1端和T2端。本發(fā)明尋找了許多看家基因，分別在不同看家基因的的