一種空氣顆粒物攜帶微生物的區(qū)域源解析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種空氣顆粒物攜帶微生物的區(qū)域源解析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]由于人類活動和多種氣象條件作用，大氣氣溶膠細粒子污染日趨嚴重，霧霾天氣越來越頻繁。霧霾天氣的頻繁發(fā)生引起了眾多研宄者的廣泛關(guān)注，目前研宄主要集中在霧霾空氣顆粒物的理化因子分析、城市中大氣氣溶膠細粒子的貢獻來源以及大氣污染模型的構(gòu)建等方面，針對污染空氣中微生物和環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)組成差異分析和空氣微生物來源解析的研宄并不多。已有研宄表明，空氣中顆粒物所攜帶的微生物，尤其是病原體和致敏菌，和人類易在霧霾高發(fā)天氣感染呼吸道疾病和過敏性疾病有著密不可分的聯(lián)系，因而探明霧霾中空氣微生物特別是病原微生物和致敏菌的區(qū)域性來源，進而從微生物群落分析的角度判斷霧霾的區(qū)域來源，對探尋合適的霧霾來源控制方法，提高空氣質(zhì)量，指導人類外出活動，保障人類身體健康具有重要的指導意義。
[0003]本發(fā)明可用于空氣顆粒物表面所攜帶微生物的區(qū)域潛在來源的調(diào)查，可分析TSP、PMlO與PM2.5等多種粒徑懸浮顆粒物表面攜帶微生物的群落與區(qū)域周邊表層樣本微生物群落之間的關(guān)系，從微生物群落的角度解析霧霾的來源，為霧霾的防治提供理論指導。其中，空氣顆粒物中病原微生物和致敏菌的區(qū)域源解析，對人類的健康具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種可分析空氣顆粒物攜帶微生物的區(qū)域來源解析進而判斷霧霾的區(qū)域性潛在來源的方法。
[0005]一種空氣顆粒物攜帶微生物的區(qū)域源解析方法的步驟如下:
1)空氣顆粒物樣本和區(qū)域典型表層塵土樣本的采集，于同一采樣日分別采集空氣顆粒物樣本和周邊不同區(qū)域環(huán)境中的表層土壤樣本、地面灰塵樣本、植物葉片表層灰塵樣本；
2)微生物DNA的提取與高通量測序，提取空氣顆粒物樣本和周邊不同區(qū)域環(huán)境中的表層土壤樣本、地面灰塵樣本、植物葉片表層灰塵樣本的微生物DNA，進行DNA質(zhì)量的檢驗，測定及檢驗合格的樣本進行相等DNA濃度混合，建立混合測序文庫，利用高通量測序技術(shù)獲得混合測序文庫中DNA目的片段序列；
3)樣本群落結(jié)構(gòu)分析，將所得DNA目的片段序列與Silva數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行比對，鑒定所得樣本中微生物的系統(tǒng)分類；
4)主坐標分析與群落相似度分析，利用Mothur程序和R軟件包對所得高通量序列進行單個和多個樣本間群落相似度的比較分析；
5)空氣顆粒物攜帶微生物潛在區(qū)域來源解析，根據(jù)空氣顆粒物樣本和周邊不同區(qū)域環(huán)境中的表層土壤樣本、地面灰塵樣本、植物葉片表層灰塵樣本的群落相似度分析結(jié)果解析區(qū)域內(nèi)潛在的空氣微生物來源；
6)致病菌和致敏菌來源解析，將已知的人體呼吸道和人體皮膚接觸易感染的病原菌和致敏菌在序列分析中單獨列出，重復(fù)步驟4)和步驟5)，找出病原菌和致敏菌在區(qū)域內(nèi)的主要潛在來源。
[0006]所述步驟I)為:選擇同一采樣日采集空氣顆粒物樣本和周邊不同區(qū)域環(huán)境中的表層土壤樣本、地面灰塵樣本、植物葉片表層灰塵樣本，空氣顆粒物樣本由三臺同型號的空氣采樣儀同時同地采集，所用空氣采樣儀為青島嶗山應(yīng)用技術(shù)研宄所生產(chǎn)的2050型中流量空氣采樣儀，該型號空氣采樣儀配備三種不同顆粒物粒徑的切割器，可同時分別采集TSP、PM10、PM2.5空氣顆粒物樣本，采樣之前將切割器和采樣濾膜進行高溫滅菌，設(shè)置采樣口距離地面的高度為12米，采樣流量為100 L/min，濾膜為圓形普通玻璃纖維濾膜，有效直徑為80 mm，采樣時間設(shè)為連續(xù)的24h ;周邊不同區(qū)域環(huán)境中的表層土壤樣本、地面灰塵樣本、植物葉片表層灰塵樣本按照采樣點分布圖采集，以空氣采樣儀所在位置為中心，從內(nèi)向外半徑500m，2km，5km和1km的同心圓上盡量均勾地設(shè)置典型區(qū)域米樣點，各同心圓上設(shè)置的采樣點個數(shù)分別為4、8、16和32個，用滅菌處理的小刷子、無菌刮刀和自封袋采集表層土壤樣本、地面灰塵樣本和植物葉片表層灰塵樣本。
[0007]所述步驟4)為:用Mothur程序分析混合測序文庫在1n Torrent、454、Illumina測序平臺測序完成的下機數(shù)據(jù)，利用Silva數(shù)據(jù)庫將空氣顆粒物樣本微生物DNA序列與區(qū)域表層塵土樣本微生物DNA序列進行比對注釋，并放于同一個文件夾中進行聚類分析，用主坐標分析法PCoA通過一系列的特征值和特征向量排序后，選擇主要特征值，找到距離矩陣中最主要的坐標，繪制出主坐標分析圖，觀察個體或群體間的差異，根據(jù)各樣本OTU組成和豐度的差異，利用R軟件包計算樣品間的相似度，繪制樣本相似度樹圖。
[0008]所述步驟5)為:根據(jù)主坐標分析圖和樣本相似度樹圖的顯示，若周邊環(huán)境樣本與空氣顆粒物樣本微生物群落的相似度高，即周邊環(huán)境樣本為當?shù)乜諝忸w粒物的潛在主要來源，若周邊環(huán)境樣本與空氣顆粒物樣本微生物群落差異性高，則認為周邊環(huán)境樣本不是空氣顆粒物的主要來源，排查每一個周邊環(huán)境表層樣本，探明區(qū)域內(nèi)潛在的空氣顆粒攜帶微生物的來源，進而判斷霧霾的區(qū)域性潛在來源。
所述步驟6)為:首先，查詢與人體呼吸道疾病與過敏反應(yīng)有關(guān)的常見病原菌和致敏菌，建立空氣病原菌和致敏菌的名單；然后，下載Silva數(shù)據(jù)庫，根據(jù)病原菌和致敏菌名單簡化Silva數(shù)據(jù)庫，建立Silva簡化數(shù)據(jù)庫；再利用Silva簡化數(shù)據(jù)庫，在步驟2)獲得的混合測序文庫中挑出病原菌和致敏菌的DNA序列，建立新的混合測序文庫；最后，針對新的混合測序文庫，重復(fù)步驟4)和步驟5)，探明區(qū)域內(nèi)潛在的空氣顆粒物攜帶病原菌和致敏菌的潛在來源。
[0009]本發(fā)明的有益效果:1)本發(fā)明可用于空氣顆粒物表面所攜帶微生物的區(qū)域潛在來源的調(diào)查，可分析TSP、PM10與PM2.5等多種粒徑懸浮顆粒物表面攜帶微生物的群落與區(qū)域周邊表層樣本微生物群落之間的關(guān)系；2)本發(fā)明通過比較不同顆粒物中微生物種群與周圍環(huán)境樣本中微生物種群的相似度和差異性來判斷霧霾顆粒物中微生物的產(chǎn)生源和輸送源，可以為微生物污染源控制提供依據(jù)；3)本發(fā)明從微生物群落的角度解析霧霾的來源，為霧霾的防治提供理論指導。其中，空氣顆粒物中病原微生物和致敏菌的區(qū)域源解析，對人類的健康具有重要的意義。
【附圖說明】
[0010]圖1是空氣顆粒物攜帶微生物的區(qū)域源解析方法流程圖；
圖2是空氣顆粒物樣本和區(qū)域典型表層塵土樣本采集點分布圖；
圖3是實施例中空氣顆粒物樣本和周邊表層塵土樣本微生物主坐標分析圖；
圖4是實施例中空氣顆粒物樣本和周邊表層塵土樣本微生物群落相似度分析樹圖。
【具體實施方式】
[0011]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0012]如圖1所示，一種空氣顆粒物攜帶微生物的區(qū)域源解析方法的步驟如下:
1)空氣顆粒物樣本和區(qū)域典型表層塵土樣本的采集，于同一采樣日分別采集空氣顆粒物樣本和周邊不同區(qū)域環(huán)境中的表層土壤樣本、地面灰塵樣本、植物葉片表層灰塵樣本；
2)微生物DNA的提取與高通量測序，提取空氣顆粒物樣本和周邊不同區(qū)域環(huán)境中的表層土壤樣本、地面灰塵樣本、植物葉片表層灰塵樣本的微生物DNA，進行DNA質(zhì)量的檢驗，測定及檢驗合格的樣本進行相等DNA濃度混合，建立混合測序文庫，利用高通量測序技術(shù)獲得混合測序文庫中DNA目的片段序列；
3)樣本群落結(jié)構(gòu)分析，將所得DNA目的片段序列與Silva數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行比對，鑒定所得樣本中微生物的系統(tǒng)分類；
4)主坐標分析與群落相似度分析，利用Mothur程序和R軟件包對所得高通量序列進行單個和多個樣本間群落相似度的比較分析；
5)空氣顆粒物攜帶微生物潛在區(qū)域來源解析，根據(jù)空氣顆粒物樣本和周邊不同區(qū)域環(huán)境中的表層土壤樣本、地面灰塵樣本、植物葉片表層灰塵樣本的群落相似度分析結(jié)果解析區(qū)域內(nèi)潛在的空氣微生物來源；
6)致病菌和致敏菌來源解析，將已知的人體呼吸道和人體皮膚接觸易感染的病原菌和致敏菌在序列分析中單獨列出，重復(fù)步驟4)和步驟5)，找出病原菌和致敏菌在區(qū)域內(nèi)的主要潛在來源。
[0013]所述步驟I)為:選擇同一采樣日采集空氣顆粒物樣本和周邊不同區(qū)域環(huán)境中的表層土壤樣本、地面灰塵樣本、植物葉片表層灰塵樣本，空氣顆粒物樣本由三