一種用于體外檢測(cè)Neurofibromastosis2疾病致病基因NF2的c.602delTG突變的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)NF2基因 c. 602delTG突變的試劑盒，該試劑盒可用于該疾病 的輔助診斷和新藥開(kāi)發(fā)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)纖維瘤病2型疾?。╪eurofibromatosis type2，NF2)是一種常染色體遺傳疾 病，其主要特征為雙側(cè)聽(tīng)神經(jīng)瘤（圖1)，常伴發(fā)顱內(nèi)和髓內(nèi)神經(jīng)鞘瘤、腦膜瘤和室管膜瘤等 多種腫瘤。多數(shù)腫瘤為良性，但是由于這些腫瘤位于顱內(nèi)或椎管內(nèi)造成神經(jīng)或腦組織的壓 迫，引起一系列嚴(yán)重癥狀，主要包括聽(tīng)力喪失，視力下降，四肢肌力減退，面部感覺(jué)減退，目艮 臉閉合不全，咽反射消失，皮下結(jié)節(jié)等，NF2的發(fā)病率高，約1/25 000,且自發(fā)突變率高，外 顯率100%。由于NF2表型多樣，NIH確定了 NF2的診斷標(biāo)準(zhǔn)：① CT或MRI顯示雙側(cè)聽(tīng)神經(jīng) 瘤；②直系一級(jí)親屬患NF2以及單側(cè)聽(tīng)神經(jīng)瘤或至少有以下病變中的2個(gè)：神經(jīng)纖維瘤、腦 膜瘤、膠質(zhì)瘤、神經(jīng)鞘瘤和青少年晶狀體后包膜下混濁。
[0003] NF2基因定位于22號(hào)染色體長(zhǎng)臂1區(qū)二帶（22ql2)，長(zhǎng)約110 000 bp，編碼區(qū) cDNA長(zhǎng)為1785bp，含17個(gè)外顯子，通過(guò)選擇剪接產(chǎn)生兩個(gè)主要蛋白亞型schwannomin或 Merlin。這個(gè)蛋白屬于Ezrin，Radixin，Moesin(ERM)家族，主要在細(xì)胞骨架和細(xì)胞膜之間 起連接作用。但是，NF2也是一個(gè)腫瘤抑制基因，NF2功能失活不但與家族性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤 有關(guān)而且與散發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤有關(guān)。NF2基因編碼蛋白Merlin可以抑制細(xì)胞增殖，同時(shí) 其可以與核內(nèi)泛素連接酶E3相互作用，抑制調(diào)控細(xì)胞周期基因表達(dá)和激活細(xì)胞凋亡基因 表達(dá)。更重要是，Merlin通過(guò)多種生物信號(hào)通路參與了腫瘤抑制作用。目前，發(fā)現(xiàn)Merlin 通過(guò)酪氨酸受體激酶通路，抑制細(xì)胞增殖，而NF2患者M(jìn)erlin蛋白失活，使得酪氨酸受體激 酶（RTKs)通路激活，促進(jìn)細(xì)胞異常增殖。在RTKs-ERK/MAPK通路中Rac、Pakl蛋白起到重要 的作用。Paks(p212activated kinases)是具致癌性的Rac/Q)C42依賴(lài)的Ser/Thr激酶，整 聯(lián)蛋白信號(hào)肽（細(xì)胞黏附相關(guān)分子）通過(guò)Paks將Merl in磷酸化使其失活，促使正常細(xì)胞 進(jìn)行有絲分裂;Merlin對(duì)Racl起負(fù)性調(diào)節(jié)，抑制其下游效應(yīng)物Paks，從而抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)， 或Merlin直接抑制Paks活性阻斷Rac介導(dǎo)的信號(hào)通路。此外，發(fā)現(xiàn)表皮生長(zhǎng)因子受體家 族（ErbB家族），包括血管生長(zhǎng)因子受體（EGFR)和血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子受體（PDGFRb)， 通絡(luò)酪氨酸受體激酶（RTKs)通路參與了 NF2腫瘤的形成，在Merlin基因缺失細(xì)胞中發(fā)現(xiàn) 抑制EGFR信號(hào)通路的藥物可以抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。在神經(jīng)鞘瘤的組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)許多ErbB 家族蛋白的表達(dá)?？笶rbB家族蛋白抗體可以抑制神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞的增殖。在臨床前期雙側(cè) 聽(tīng)神經(jīng)瘤模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑埃羅替尼可以有效的抑制 腫瘤細(xì)胞的增殖。最近，研宄報(bào)道血管生長(zhǎng)因子單克隆抗體阿瓦斯汀改善NF2患者的聽(tīng)力 功能。
[0004] 目前在基因水平對(duì)NF2型疾病進(jìn)行篩查的方法或試劑盒還未曾報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于輔助診斷神經(jīng)纖維瘤病2型疾病的試劑盒。
[0006] 本發(fā)明所提供的用于輔助診斷NF2型疾病的試劑盒，包括如下引物對(duì)：SEQ ID NO : 1 和 SEQ ID NO :2。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如下突變位點(diǎn)的用途：NF2基因的第2個(gè)外顯子中 c. 602-603位處的核苷酸TG缺失。
[0008] 該用途是在制備輔助診斷NF2型疾病的試劑盒中的應(yīng)用。具體是針對(duì)該突變位點(diǎn) 設(shè)計(jì)能夠檢測(cè)出該突變位點(diǎn)的引物對(duì)，即得到輔助診斷NF2型疾病的試劑盒。
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種與NF2型疾病相關(guān)的突變位點(diǎn)。
[0010] 本發(fā)明所提供的與NF2型疾病相關(guān)的突變位點(diǎn)如下：NF2基因的第2個(gè)外顯子中 c. 602-603位核苷酸TG缺失。
[0011] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)纖維瘤病2型（NF2)疾病致病基因 NF2的c. 602delTG突 變，并且證明該突變位點(diǎn)與NF2疾病相關(guān)。進(jìn)一步設(shè)計(jì)了檢測(cè)該突變位點(diǎn)的引物，并將其用 于診斷NF2疾病。實(shí)驗(yàn)證明，該引物可特異地、準(zhǔn)確得診斷出NF2疾病患者。該診斷方法簡(jiǎn) 單、成本低，檢測(cè)結(jié)果直接、可靠，適用于對(duì)NF2疾病NF2基因 c. 602delTG突變的大規(guī)模的 篩查和診斷。通過(guò)產(chǎn)前篩查及新生兒NF2基因突變篩查，可以降低NF2疾病患兒的出生率， 指導(dǎo)攜帶致病基因的患者生活行為，預(yù)防疾病發(fā)生，大大緩解社會(huì)壓力。體外檢測(cè)NF2疾病 相關(guān)基因 NF2的c. 602delTG突變的試劑盒對(duì)于這些學(xué)科研宄與發(fā)展都是不可或缺的。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1為關(guān)于NF2患者臨床表現(xiàn)：雙側(cè)聽(tīng)神經(jīng)瘤（如箭頭所示）。
[0013] 圖2為NF2基因 c. DNA編碼區(qū)氨基酸與核苷酸堿基的對(duì)照：突變位于第602個(gè)堿 基，第54位的氨基酸變?yōu)榉g終止信號(hào)（灰色標(biāo)記插入的堿基，其后氨基酸缺失表達(dá)）。
[0014] 圖3為本發(fā)明NF2基因雜合突變中PCR反應(yīng)過(guò)程示意圖，示出反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí) 間。
[0015] 圖4為本發(fā)明方法NF2基因外顯子2的部分測(cè)序結(jié)果，上方為突變序列，下方位正 常對(duì)照序列，箭頭所指為突變位點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 本發(fā)明所用試劑材料，如無(wú)特別說(shuō)明，均為市售購(gòu)買(mǎi)產(chǎn)品。
[0017] 實(shí)施例1、與神經(jīng)纖維瘤病2型疾病相關(guān)的NF2基因突變位點(diǎn)c. 602delTG的發(fā)現(xiàn)
[0018] 通過(guò)神經(jīng)外科門(mén)診收集NF2患者，在患者及家屬自愿的前提下，簽署知情同意書(shū) 后，留取5-10ml血樣，建立住院病歷資料庫(kù)，詳細(xì)記錄患者病情、家系中發(fā)病情況以及聯(lián)系 方式。然后應(yīng)用酚氯仿抽提方法提取基因組DNA，定量后入庫(kù)，-20°C保存，每份DNA均準(zhǔn)確 對(duì)應(yīng)登記的患者臨床資料。根據(jù)Primer Premier5. 0進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，包含NF2基因602位點(diǎn) 及兩側(cè)序列，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，測(cè)序引物與PCR擴(kuò)增引物相同，應(yīng) 用ABI公司3730DNA測(cè)序儀進(jìn)行反向測(cè)序。將得到的序列與Genbank中的標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)， 確定602突變位點(diǎn)。按正常閱讀框進(jìn)行翻譯以確定NF2基因突變位點(diǎn)。
[0019] 結(jié)果：通過(guò)對(duì)36例NF2疾病患者及6例正常對(duì)照的NF2基因編碼區(qū)外顯子的篩查 發(fā)現(xiàn)一名患者在外顯子2上具有NF2基因新的突變。該突變點(diǎn)為雙核苷酸缺失突變。NF2疾 病患者為雜合子，即一個(gè)等位基因?yàn)镹F2基因的第2個(gè)外顯子中c. 602-603位核苷酸TG缺 失，將該突變記作c. 602delTG突變。這個(gè)突變?cè)?例對(duì)照組中均未被發(fā)現(xiàn)。正常人在此處不 存在任何突變，為純合基因型，即兩個(gè)等位基因均為NF2基因的第2個(gè)外顯子中c. 602-603 位核苷酸為T(mén)G (圖2)。說(shuō)明這一突變位點(diǎn)與NF2疾病相關(guān)。存在c. 602delTG突變的為NF2 疾病患者。
[0020] 實(shí)施例2、用于NF2型疾病的診斷試劑盒及其應(yīng)用
[0021] 一、試劑盒組成
[0022] 上游引物：NF2602-F :5，-CCTTCCCCATTGGTTTGTTATTG-3，（SEQ ID NO :1);
[0023] 下游引物：NF2602-R :5，-CcAGGGCCAGCAGCAGTCTAATC-Sr (SEQ ID NO ：2)；
[0024] 50ul IOX PCR 緩沖液（Pharmacia)，
[0025] IOul IOmM dNTP 混合液（Pharmacia)，
[0026] 5ul (5unit/ul) Taq DNA 聚合酶（Takara)，
[0027] 各 IOul (lOpmol/ul) Fl (SEQ ID NO :1)和 Rl (SEQ ID NO :2)引物，
[0028] Iml純水（自制）。
[0029] 二、試劑盒應(yīng)用
[0030] (一）診斷材料：
[0031] 共36例NF2疾病患者及6例正常人的外周血血樣。
[0032] 通過(guò)神經(jīng)外科門(mén)診收集NF2患者，在患者及家屬自愿的前提下，簽署知情同意書(shū) 后，留取5-10ml血樣，建立住院病歷資料庫(kù)，詳細(xì)記錄患者病情、家系中發(fā)病情況以及聯(lián)系 方式。本研宄已得到了本單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
[0033] (二）診斷方法
[0034] 1、基因組DNA的提?。?br>[0035] 第一天：在抗凝劑EDTA存在下，將收集的5-10ml人外周血在2500rpm，離心分離 30分鐘除去血清；加入0. 2 % NaCl溶液，使總體積為50ml。輕輕振蕩溶液5-6次，并使其放 置于冰上15分鐘；在2500rpm離心分離30分鐘，借此收集沉淀物；用0. 2%的NaCl溶液， 以類(lèi)似于前面的方式再進(jìn)行洗滌；在如此獲得的沉淀物中，加入IOmMTris-HCl (pH8.0)和 IOmM EDTA(4ml)，以懸浮該沉淀物；將 10% SDS，25mg/ml 的蛋白酶 K 和 10mg/ml 的 RNaseA 加入懸液中，其加入量分別為4ml、16ul和20ul，接著上下顛倒懸液輕輕混合；在37°C過(guò)夜 溫育懸液。
[0036] 第二天：加入4ml酚/Tris溶液，上下顛倒混合物混合所得的混合物；以3000rpm 進(jìn)行離心分離10分鐘除去水層；將水層和4ml酚/氯仿溶液混合，接著逆混合并以 3000rpm離心分離10分鐘；除去水層，用氯仿提取兩次，以獲得水相，往其中加1/10,3M NaAC (pH5. 2)，兩倍量的冷無(wú)水乙醇，使DNA沉淀；用70%的乙醇洗滌以獲得基因組DNA ;使 這樣獲得的DNA，基因組DNA溶解于TE中，然后定量測(cè)定混合物在260nm的吸收率；DNA工 作液濃度校正至50ng/ul，置-20°C冰箱保存。
[0037] 2、PCR 擴(kuò)增
[0038] PCR反應(yīng)體系
[0039]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于輔助診斷NF2型疾病的試劑盒，包括如下引物對(duì)：SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2〇
2. 如下突變位點(diǎn)在制備輔助診斷NF2型疾病的試劑盒中的應(yīng)用：NF2基因的第2個(gè)外 顯子中c. 602-603位核苷酸TG缺失。
3. -種與NF2型疾病相關(guān)的突變位點(diǎn)：NF2基因的第2個(gè)外顯子中c. 602-603位核苷 酸TG缺失。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于體外檢測(cè)Neurofibromastosis 2疾病致病基因NF2的c.602delTG突變的試劑盒。該試劑盒包括如下引物對(duì)：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了NF2疾病致病基因NF2的c.602delTG突變，并且證明該突變位點(diǎn)與NF2疾病相關(guān)。進(jìn)一步設(shè)計(jì)了檢測(cè)該突變位點(diǎn)的引物，并將其用于診斷NF2疾病。通過(guò)產(chǎn)前篩查及新生兒NF2基因突變篩查，可以降低NF2疾病患兒的出生率，指導(dǎo)攜帶致病基因的患者生活行為，預(yù)防疾病發(fā)生，大大緩解社會(huì)壓力。體外檢測(cè)NF2疾病相關(guān)基因NF2的c.602delTG突變的試劑盒對(duì)于這些學(xué)科研究與發(fā)展都是不可或缺的。
【IPC分類(lèi)】C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104878080
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410306409
【發(fā)明人】張俊廷, 郝淑煜, 馮潔, 李達(dá), 吳震, 王亮, 張力偉
【申請(qǐng)人】首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院
【公開(kāi)日】2015年9月2日
【申請(qǐng)日】2014年6月26日