一種利用pcr技術(shù)檢測葡萄苗木中葡萄根瘤蚜的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用PCR技術(shù)檢測葡萄苗木中葡萄根瘤蚜的方法；具體涉及一種 利用DNA擴(kuò)增技術(shù)獲得特異DNA條形碼用于鑒定葡萄苗木是否攜帶葡萄根瘤蚜，并利用實(shí) 時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)攜帶樣品進(jìn)一步進(jìn)行更為準(zhǔn)確的定性定量，屬于檢驗(yàn)檢疫分子生物 學(xué)領(lǐng)域。 二、
【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄根瘤財(cái)（Daktulosphaira vitifoliae Fitch.)是葡萄上的專性寄生害蟲。葡 萄根瘤蚜原產(chǎn)于北美洲，19世紀(jì)中葉隨苗木傳入歐洲，給歐洲葡萄栽培和葡萄酒產(chǎn)業(yè)造成 了毀滅性打擊，成為世界上第一個(gè)被列入檢疫對(duì)象的有害生物。葡萄根瘤蚜以1齡若蟲或 越冬卵在葡萄根部的皮縫或枝條縫隙進(jìn)行越冬，1齡若蟲和蟲卵很小，用肉眼甚至常規(guī)鏡檢 的方法都很難檢測到根瘤蚜的存在，特別是當(dāng)苗木夾裹了土壤之后發(fā)現(xiàn)更為困難，這點(diǎn)與 根結(jié)線蟲能在一年生苗木上造成容易發(fā)現(xiàn)的結(jié)節(jié)明顯不同。隨著改革開放，我們團(tuán)體或個(gè) 人大量從國外引進(jìn)或攜帶葡萄材料，從而埋下了隱患。2005年首先在上海馬陸葡萄園發(fā)現(xiàn) 葡萄根瘤蚜，其后在湖南懷化、陜西灞橋等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了較大規(guī)模的根瘤蚜?？梢?，葡萄根 瘤蚜在我國存在爆發(fā)、傳播的風(fēng)險(xiǎn)極大，所以檢疫、檢控葡萄根瘤蚜的工作已迫在眉睫。目 前絕大部分技術(shù)人員還不能有效辨別根瘤蚜為害，為了防止根瘤蚜隨苗木進(jìn)行大規(guī)模、遠(yuǎn) 距離的傳播，建立一種快速、準(zhǔn)確、高效的檢測方法已成為當(dāng)務(wù)之急。
[0003] DNA條形碼（DNA barcoding)技術(shù)是近年發(fā)展起來的利用一個(gè)或幾個(gè)特異的DNA 片段對(duì)地球上現(xiàn)有物種進(jìn)行識(shí)別和鑒定的一項(xiàng)新的分子鑒定技術(shù)，最初只是用于動(dòng)物類 群物種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)新型系統(tǒng)，而后上升到鑒定所有真核生物物種，同時(shí)也被成功應(yīng)用于土 壤病原體、真菌、細(xì)菌和線蟲的鑒定，為許多入侵害蟲的診斷和鑒定提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支 持。Herbert等（2008)曾用DNA條形碼技術(shù)對(duì)可能含有根瘤蚜的土壤進(jìn)行了鑒定，篩選到 一對(duì)能夠用于根瘤蚜鑒定的特異引物，并發(fā)現(xiàn)與其他鑒定方法相比，DNA條形碼技術(shù)準(zhǔn)確度 較高。Bruce等（2010)也證明DNA條形碼技術(shù)可用于土壤中根瘤財(cái)?shù)目焖勹b定。本發(fā)明首 次將DNA條形碼技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)用于葡萄苗木根部根瘤蚜的鑒定。本發(fā)明不 僅使用了簡單的PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行根瘤蚜的定性，還創(chuàng)新性地使用了更靈敏更準(zhǔn)確的實(shí)時(shí) 熒光定量PCR技術(shù)，在檢驗(yàn)鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠的同時(shí)還可以根據(jù)檢測結(jié)果比較不同樣品間 根瘤蚜含量的多少，該方法有助于苗木根瘤蚜的檢疫檢驗(yàn)。 三、

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種利用PCR技術(shù)檢測葡萄苗木中葡萄根瘤蚜 的方法。內(nèi)容包括提取葡萄根瘤蚜基因組DNA，根據(jù)葡萄根瘤蚜ITS2區(qū)設(shè)計(jì)根瘤蚜特異引 物，以根瘤蚜基因組DNA為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，如果 擴(kuò)增產(chǎn)物大小為IHbp核酸序列，即說明樣品含有根瘤蚜；進(jìn)一步對(duì)含有根瘤蚜的樣品進(jìn) 行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，根據(jù)樣品孔循環(huán)數(shù)與熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系圖可以直觀的進(jìn)行根 瘤蚜含量的定性和定量。
[0005] 一種利用PCR技術(shù)檢測葡萄苗木中葡萄根瘤蚜的方法，包括以下步驟：
[0006] 1、根據(jù)葡萄根瘤蚜ITS2序列設(shè)計(jì)特異性引物：
[0007] 上游引物（ITS2-1) :5'-3'AATCCGCAGGTTATACGAACATC SEQ. ID. NO 1
[0008] 下游引物（ITS2-2) :5' -3' CGGTCTCGTCAAAITTCGGA SEQ. ID. NO 2
[0009] 2、提取基因組DNA
[0010] 參照Lin、Walker (1996)和Downie (2000)的方法提取待檢測樣品DNA。
[0011] 3、根瘤蚜特異DNA片段擴(kuò)增：
[0012] 使用上述待檢測樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系25μ1:10倍的buffer 2·5μ1，2·5πιΜ dNTP 2μ1，上下游引物（IOmM)各0·5μ1，模板0隱1以14&9酶瓜用無菌水 補(bǔ)齊。反應(yīng)程序：95°C預(yù)變性5min，95°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，進(jìn)行32-35 個(gè)循環(huán)反應(yīng)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)下觀察目的條 帶，若待檢測樣品擴(kuò)增產(chǎn)物中含有IHbp片段，則該待檢測樣品含有根瘤蚜。
[0013] 4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測根瘤蚜
[0014] 將上述含有根瘤蚜的待檢測樣品DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。使用SYBR染料 法，總反應(yīng)體系為20yl:2XUltra SYBR Mixture(With R0X)10yl，所述上、下游引物各 〇· 5 μ 1，模板為2 μ l，RNase-Free Water 7 μ 1。反應(yīng)程序（兩步法PCR) :95°C預(yù)變性 IOmin ; 95°C變性10s，60°C退火/延伸lmin，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)，建立熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖， 根據(jù)每個(gè)樣品孔的熒光強(qiáng)度曲線變化判斷根瘤蚜及其含量。
[0015] 本發(fā)明有益效果：
[0016] 本發(fā)明首次將PCR技術(shù)用于葡萄苗木根部根瘤蚜的鑒定，本發(fā)明的創(chuàng)新性在于提 供了一種快速準(zhǔn)確鑒定葡萄苗木是否攜帶根瘤蚜的方法，解決了苗木檢疫檢驗(yàn)的困難，DNA 條形碼技術(shù)有利于檢疫部門廣泛性、常規(guī)性、程式化規(guī)模檢驗(yàn)苗木的分子方法，而實(shí)時(shí)熒光 定量PCR技術(shù)有助于檢疫部門對(duì)發(fā)生樣品進(jìn)行進(jìn)一步定性定量，掌握和判斷根瘤蚜傳播和 爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性大、操作簡便、風(fēng)險(xiǎn)性小的好處。 四、【附圖說明】
[0017] 圖1 :根瘤蚜DNA擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖
[0018] 圖中顯示凡是含有根瘤蚜的根系樣品：2、3、4、5均有一個(gè)114bp的條帶，而無根瘤 蚜的根系樣品1無此條帶，證明了根瘤蚜DNA提取的準(zhǔn)確性與可行性。
[0019] 圖2 :根瘤蚜DNA特異性檢測結(jié)果圖
[0020] 圖中顯示，1-1及1-2DNA樣品為陽性，說明帶有根瘤蚜；而2號(hào)樣品（含有根結(jié)線 蟲）、3號(hào)僅含有根皮DNA的樣品，以及無根瘤蚜的陰性對(duì)照根系4號(hào)均為陰性，證明利用這 組特異引物和SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR方法可以把根瘤蚜與根結(jié)線蟲以及根部DNA區(qū) 分開來，從而驗(yàn)證了該DNA條形碼的特異性。
[0021] 圖3 :不同濃度梯度的根瘤蚜DNA熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖
[0022] 將從疫區(qū)采集分離到的根瘤蚜樣品DNA加入到無根瘤蚜的赤霞珠葡萄根DNA中進(jìn) 行稀釋，使溶液中根瘤蚜DNA的濃度分別為10 4、103、102、IO1和Ipg/μ 1，利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的 根瘤蚜特異引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖中顯示在濃度為Ipg/μ 1時(shí)仍能檢 測出來，說明根瘤蚜DNA條形碼的敏感性很高。
[0023] 圖4 :不同蟲口密度的根瘤蚜DNA熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖 [0024] 從一年生赤霞珠葡萄苗木粗根上剝?nèi)∑咸迅?. lg，然后向每份根皮樣品中分別 加入0、5、15、30、60、90個(gè)1齡根瘤蚜若蟲，之后提取總DNA，并將提取的DNA稀釋IO3倍，利 用本發(fā)明設(shè)計(jì)的根瘤蚜特異引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)含有5頭1齡根瘤蚜若 蟲的樣品稀釋IO3倍后即〇. 005頭時(shí)仍可檢出，說明該方法對(duì)根瘤蚜進(jìn)行定性定量檢測靈 敏精確。
[0025] 圖5 :30株接種苗木根瘤蚜DNA檢測結(jié)果
[0026] 對(duì)接種的30株苗木單株提取根皮DNA，