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高分辨率解鏈的改進校準(zhǔn)的制作方法

文檔序號:8515787閱讀:506來源:國知局
高分辨率解鏈的改進校準(zhǔn)的制作方法
【專利說明】高分辨率解鏈的改進校準(zhǔn)
[0001] 發(fā)明背景
[0002] 本發(fā)明涉及用于在高分辨率解鏈PCR實驗中進行溫度校準(zhǔn)的方法或試劑盒。本 說明書進一步涉及用于最優(yōu)校準(zhǔn)的方法,其允許靶物和校準(zhǔn)物的相同或相似解鏈溫度的讀 出。本說明書進一步涉及用于實施所述方法的儀器和執(zhí)行所述方法的計算機程序。
[0003] 高分辨率解鏈(highresolutionmelting,HRM)是一種在PCR擴增后檢測靶序列 中未知核酸變異的方法。與傳統(tǒng)方法例如變性梯度凝膠電泳(DGGE)相比,HRM提供用于突 變掃描的幾個優(yōu)勢。這些優(yōu)勢包括較低的試劑和樣品消耗,較少的優(yōu)化步驟以及在單次實 時定量PCR中可執(zhí)行的封閉測試形式。
[0004] 在能夠非共價結(jié)合雙鏈核酸的特殊熒光DNA結(jié)合染料(例如LightCycler? 480Resolight染料,RocheAppliedScience,目錄號 04909640001)的存在下,對長達(dá)約 250個堿基對的靶序列PCR擴增后,加入生成的擴增子的HRM步驟。因為所述熒光非共價 雙鏈DNA結(jié)合染料不抑制PCR,所以其可以以飽和濃度加到擴增反應(yīng)中。在HRM步驟中,所 述熒光非共價雙鏈DNA結(jié)合染料被釋放,且可以檢測到野生型、純合子和雜合子突變體之 間關(guān)于擴增子解鏈圖譜的差異(ReedGH,KentJO,WittwerCT(2007),Pharmacogenomics 8 (6) : 597-608;WittwerCT(2009),Hum.Mutat. 30 (6) : 857-859;Wittwer等,美國專利號 7, 582, 429)。
[0005] 根據(jù)點突變的類型,觀察到的解鏈溫度差異可能非常小。單核苷酸多態(tài)性(SNPs) 通常導(dǎo)致解鏈溫度在約I. 〇°C(對于1類SNPs(C/T和G/A堿基改變)和2類SNP(C/A和G/T堿基改變))、約0? 5°C(對于3類SNPs(C/G堿基改變))和約0? 2°C(對于4類SNPs(A/ T堿基改變)為約0.2°C)之間的變化。與野生型相比,雜合子突變通常表現(xiàn)出不同的熒光 解鏈圖譜(解鏈曲線形狀),而純合子突變通常導(dǎo)致與野生型非常相似的解鏈圖譜,且僅能 通過較小的溫度變化區(qū)分。
[0006] 關(guān)于HRM的現(xiàn)有技術(shù)展現(xiàn)出如本文下面所述的幾個缺點。為了檢測解鏈溫度中的 小差異,要求測量系統(tǒng)極高的溫度精度。實時PCR儀器通常設(shè)計為基于模塊的系統(tǒng),其使用 Peltier元件進行精確溫度控制。然而,所述溫度控制受制于物理限制,其由例如溫度傳感 器的校準(zhǔn)、Peltier元件的控制以及微孔板個體和加熱模塊底座的幾何契合所導(dǎo)致。這些 限制通常導(dǎo)致在加熱模塊中最熱和最冷位置之間觀察到的0. 5-1. (TC的溫度范圍。因此,反 應(yīng)體積中的溫度控制不允許在純合突變體與其野生型相比具有非常相似的特征性解鏈圖 譜(profile)的HRM實驗中區(qū)分較小的溫度變化。
[0007] 為了修正在基于模塊的熱循環(huán)儀的所有位置處不均勻的溫度分布,目前建立了兩 種不同的方法:
[0008] 在于特定的儀器上實施HRM實驗之前,使用特殊的校準(zhǔn)板來執(zhí)行分開的溫度校準(zhǔn) 運行。將所有位置的所述模塊特異性溫度數(shù)據(jù)保存于所述儀器的軟件中,并隨后用于HRM 實驗來修正所有位置的溫度差異。這種方法建立用于例如AppliedBiosystems7500和 7900HT實時PCR系統(tǒng)(例如MeltDoctor?HRMCalibrationPlate,目錄號PN4425618)和 BioradCFX實時PCR系統(tǒng)(例如MeltCalibrationKit,目錄號 184-5020)。
[0009] 所述校準(zhǔn)方法的缺點在于,當(dāng)實施分開的溫度校準(zhǔn)運行時,溫度不均一的實驗特 異性原因無法被修正。這些包括微孔板個體在加熱模塊底座中的不同契合,以及從底座到 板和反應(yīng)體積的溫度傳遞中相關(guān)的差異。此外,例如由不同的離子強度(由純化方法或樣 品材料導(dǎo)致的)導(dǎo)致的不同反應(yīng)條件影響觀察到的解鏈溫度。另外,Peltier模塊的熱老 化不能通過此方法補償。
[0010] 1)在HRM試驗中,內(nèi)部的溫度校準(zhǔn)物被加到每一個反應(yīng)中。所述溫度校準(zhǔn)物由未 標(biāo)記的雙鏈寡核苷酸組成,其采用低于或高于所述靶序列的預(yù)期解鏈溫度的解鏈溫度,并 使用在反應(yīng)中存在的熒光非共價雙鏈DNA結(jié)合染料來檢測?;跍y量到的孔與孔之間校 準(zhǔn)物的溫度差異,修正檢測到的目標(biāo)溫度。這一方法建立用于例如IdahoTechnology的 LightScarmer⑧儀器(HighSensitivityMasterMix,目錄號HRLS-ASY-0008)。
[0011] 溫度校準(zhǔn)物方法的缺點:對未標(biāo)記的內(nèi)部溫度校準(zhǔn)物的檢測基于用于靶突變檢測 的相同熒光非共價雙鏈DNA結(jié)合染料的釋放。因此所述目標(biāo)解鏈溫度必須與校準(zhǔn)物解鏈不 重疊。這將擴增子的大小限制到約40-120個堿基對的范圍。此外,根據(jù)靶物的G/C含量, 所述擴增子長度必須優(yōu)化到適合于允許的解鏈溫度范圍。另外,所述擴增子解鏈的熒光亮 度必須不能勝過并因此遮蓋內(nèi)部校準(zhǔn)物信號。熒光亮度強烈依賴于產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的量。 因此,在執(zhí)行HRM實驗之前,對于每一個靶物,開始核酸材料的量和引物的濃度必須優(yōu)化。
[0012] 本說明書的目的是提供用于HRM的方法,其不顯示上述缺點。 發(fā)明概要
[0013] 本說明書的第一個方面涉及用于PCR實驗中溫度校準(zhǔn)的方法,其中所述方法包括 以下步驟a)在多孔板的每個孔中提供用于擴增樣品中的特定靶核酸的反應(yīng)混合物,其包 含熒光非共價雙鏈DNA結(jié)合染料,b)在每個孔中提供雙鏈寡核苷酸,其中供體生色團共價 結(jié)合所述雙鏈寡核苷酸的第一條鏈,其中接受體生色團共價結(jié)合所述雙鏈寡核苷酸的第二 條鏈,c)在每一個孔中擴增所述特定靶核酸,d)在每個孔中解鏈所述特定靶核酸從而導(dǎo)致 自所述熒光非共價雙鏈DNA結(jié)合染料的放射發(fā)射的減少,以及解鏈所述雙鏈寡核苷酸從而 導(dǎo)致自所述供體生色團的放射發(fā)射的增加或自所述接受體生色團的放射發(fā)射的減少,其通 過供體生色團和接受體生色團的空間分離進行,e)通過檢測自所述熒光非共價雙鏈DNA結(jié) 合染料的放射發(fā)射的減少,在每個孔中監(jiān)控所述擴增的特定靶核酸的解鏈溫度值,并分開 地通過檢測自所述供體生色團的放射發(fā)射的增加或自所述接受體生色團的放射發(fā)射的減 少,在每個孔中監(jiān)控所述雙鏈寡核苷酸的解鏈溫度,f)基于所述雙鏈寡核苷酸解鏈溫度值 的孔與孔差異,對于每個孔修正所述擴增的特定靶核酸的解鏈溫度值。
[0014] 本說明書的第二個方面涉及用于實施在上述PCR實驗中的溫度校準(zhǔn)的試劑盒,其 中所述試劑盒包含a)用于在樣品中擴增特定靶核酸序列所有的必要試劑,b)熒光非共價 雙鏈DNA結(jié)合染料,c)雙鏈寡核苷酸,其中供體生色團共價結(jié)合所述雙鏈寡核苷酸的第一 條鏈,其中接受體生色團共價結(jié)合所述雙鏈寡核苷酸的第二條鏈。
[0015] 本說明書的第三個方面涉及用于實施在上述PCR實驗中的溫度校準(zhǔn)的反應(yīng)混合 物,其中所述反應(yīng)混合物包含a)靶核酸序列,b)用于擴增特定靶核酸序列的所有的必要試 劑,c)熒光非共價雙鏈DNA結(jié)合染料,以及d)雙鏈寡核苷酸,其中供體生色團共價結(jié)合所 述雙鏈寡核苷酸的第一條鏈,接受體生色團共價結(jié)合所述雙鏈寡核苷酸的第二條鏈。
[0016] 本說明書的第四個方面涉及用于在上述PCR實驗中實行溫度校準(zhǔn)的儀器。
[0017] 本說明書的第五個方面涉及用于執(zhí)行在上述PCR實驗中溫度校準(zhǔn)的方法的計算 機程序。
【附圖說明】
[0018] 圖1 :本圖顯示了實施例1中32種野生型、32種雜合突變體和32種純合突變體 在不使用校準(zhǔn)物時的標(biāo)準(zhǔn)化解鏈曲線。所述實驗在帶有熱學(xué)未校準(zhǔn)的PCR模塊的儀器上進 行。
[0019] 圖2 :本圖顯示了實施例1中32種野生型、32種雜合突變體和32種純合突變體在 使用校準(zhǔn)物時的標(biāo)準(zhǔn)化解鏈曲線。所述實驗在帶有熱學(xué)未校準(zhǔn)的PCR模塊的儀器上進行。
[0020] 圖3 :本圖顯示了實施例1中,六個基因型變體在不使用校準(zhǔn)物時的標(biāo)準(zhǔn)化解鏈曲 線。所述實驗在帶有熱學(xué)預(yù)校準(zhǔn)的PCR模塊的儀器上進行。
[0021] 圖4:本圖顯示了實施例1中,六個基因型變體在使用校準(zhǔn)物時的標(biāo)準(zhǔn)化解鏈曲 線。所述實驗在帶有熱學(xué)預(yù)校準(zhǔn)的PCR模塊的儀器上進行。
[0022] 發(fā)明詳述
[0023] 下述定義用來說明和限定本文所用各種術(shù)語的含義和范圍。
[0024] 術(shù)語"一個"、"一種"和"所述"除非上下文另有清晰說明,一般包括復(fù)數(shù)形式。
[0025]術(shù)語"擴增子"一般指代選擇的擴增產(chǎn)物,其通過一組特定的正向和反向引物擴 增,例如那些通過本領(lǐng)域中已知擴增技術(shù)生產(chǎn)的。
[0026] 術(shù)語"擴增"一般指代從靶核酸產(chǎn)生復(fù)數(shù)核酸分子,其中引
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