工程菌及其在制備(3r, 5s)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物制藥領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種工程菌及其在制備 (3R，5S)-6-氯-3, 5-二哲基己酸叔了醋中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 他汀類藥物是一類哲甲基戊二酷輔酶A(HMG-CoA)還原酶的競爭性抑制劑藥 物，是目前臨床上應(yīng)用廣泛的降血脂藥物。HMG-CoA還原酶催化HMG-CoA還原成3-甲 基-3, 5-二哲基戊酸的反應(yīng)是膽固醇的生物合成途徑，他汀類藥物通過抑制HMG-CoA還原 酶的合成，可抑制體內(nèi)膽固醇的合成，降低低密度脂蛋白膽固醇（LDkC)水平，對W膽固醇 升高為主的高血脂癥和冠屯、病有較好的療效。在結(jié)構(gòu)上，他汀類藥物通常由憎水性的剛性 平面結(jié)構(gòu)母核和具有雙手性中屯、的（3R，5S/R)-雙哲基己酸醋組成。
[0003] 其中，阿托伐他?。ˋtorvastatin)是全新第S代、全合成、高純化、高選擇性的 HMG-CoA還原酶抑制劑，多年來占據(jù)降血脂藥物的主要市場份額。（3R，5S)-6-氯-3, 5-二 哲基己酸叔了醋是合成阿托伐他汀的關(guān)鍵中間體，在其制備方法中，利用還原酶從 (S)-6-氯-5-哲基-3-幾基己酸叔了醋一步還原的方法，W其高效率、高選擇性的特點成為 化學(xué)和制藥工業(yè)界重點研究的對象。
[0004] 目前，報道的制備（3R，5S)-6-氯-3, 5-二哲基己酸叔了醋的方法分為兩種，一種 為化學(xué)還原法，在現(xiàn)有技術(shù)中，按化學(xué)還原劑的不同主要有兩種方法，其一為在棚燒及棚氨 化鋼作用下，采用-7〇°C低溫還原，相關(guān)公開專利為；中國專利CN101624390、CN102180862、 CN101613341、印度專利2009MU03028,該法反應(yīng)條件苛刻且需大量易燃有毒的棚燒，在工藝 安全方面不易控制；另一則是采用金屬復(fù)合催化劑高壓加氨的方法進(jìn)行還原，相關(guān)公開專 利為中國專利CN103483295A、日本專利2003128629,其催化劑制備工藝復(fù)雜，且反應(yīng)需要 保證無水無氧，不利于工業(yè)化應(yīng)用。
[0005] 相比較而言，生物法的應(yīng)用條件更加溫和，操作也相對簡便。例如美國專利 US20130040364 A1公開了一種利用來自于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的幾基 還原酶及其突變株不對稱還原生產(chǎn)（3R，5S)-6-氯-3, 5-二哲基己酸叔了醋的方法，同時美 國專利US6472544B1也公開了一種利用來自木蘭假絲酵母（Candida magnoliae IF00705) 的幾基還原酶來進(jìn)行不對稱還原的方法，該兩種方法均采用添加輔助的葡萄糖脫氨酶和葡 萄糖的方法來實現(xiàn)輔酶的原位循環(huán)。該方法雖然較化學(xué)法具有較多的優(yōu)點，但其輔酶循環(huán) 過程中會產(chǎn)生與產(chǎn)物等摩爾數(shù)的葡萄糖醒酸，反應(yīng)過程中需要加入等摩爾數(shù)的堿W維持反 應(yīng)體系的抑，反應(yīng)體系中產(chǎn)生的酸和堿在一定程度上會對酶活產(chǎn)生一定的影響，從而延長 反應(yīng)的時間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種工程菌及其在制備（3R，5S)-6-氯-3, 5-二哲基己酸叔了醋 中的應(yīng)用，該工程菌能夠不對稱還原（S)-6-氯-5-哲基-3-幾基己酸叔了醋合成（3R， 5S)-6-氯-3, 5-二哲基己酸叔了醋，產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率和純度均較高。
[0007] 本發(fā)明提供了一種工程菌，包括宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的目的基因，所述目的 基因為如堿基序列SEQ ID NO. 3所示的幾基還原酶基因。
[000引所述的幾基還原酶基因（簡稱DKr)為全合成基因，基因來源于Acinetobacter calcoaceti州S SC 13876的二幾基還原酶基因Dkr。
[0009] 所述工程菌含有帶所述幾基還原酶基因的表達(dá)載體祀T30-30a(+);宿主細(xì)胞 為大腸桿菌，優(yōu)選地，為大腸桿菌化2UDE3)菌株。所述幾基還原酶基因在大腸桿菌 BL2UDE3)中表達(dá)，使工程菌過量表達(dá)幾基還原酶。
[0010] 本發(fā)明提供了一種所述的工程菌在W做-6-氯-5-哲基-3-幾基己酸叔了醋為 底物制備（3R，5S)-6-氯-3, 5-二哲基己酸叔了醋中的應(yīng)用。
[0011] 具體地，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)（3R，5S)-6-氯-3, 5-二哲基己酸叔了醋的方法， 包括：
[0012] (1)制備包含堿基序列如SEQ ID No. 3所示的幾基還原酶基因的工程菌；
[0013] (2)制備所述工程菌的靜息細(xì)胞懸液；
[0014] (3)將靜息細(xì)胞懸液和輔因子加入到底物（S)-6-氯-5-哲基-3-幾基己酸叔了 醋、氨供體和緩沖液的混合液中，反應(yīng)制得（3R，5S)-6-氯-3, 5-二哲基己酸叔了醋。
[0015] 本發(fā)明的反應(yīng)式為；
[0016]
【主權(quán)項】
1. 一種工程菌，包括宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因 為堿基序列如SEQ ID NO. 3所示的羰基還原酶基因。
2. 如權(quán)利要求1所述的工程菌在以（S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯為底物制 備（3R，5S) -6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯中的應(yīng)用。
3. -種生產(chǎn)（3R，5S) -6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯的方法，其特征在于，包括： (1) 制備包含堿基序列如SEQ ID No. 3所示的羰基還原酶基因的工程菌； (2) 制備所述工程菌的靜息細(xì)胞懸液； (3) 將靜息細(xì)胞懸液和輔因子加入到底物（S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯、氫 供體和緩沖液的混合液中，反應(yīng)制得（3R，5S)-6-氯-3, 5-二羥基己酸叔丁酯。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的氫供體為異丙醇。
5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)的溫度為25~37°C，反應(yīng)液的pH 值為6.0~7. 5。
6. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液或三乙醇胺 鹽緩沖液。
7. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的輔因子為NADP +/NADPH。
8. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述緩沖液的濃度為IOOmM~200mM。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種工程菌及其在制備(3R，5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯中的應(yīng)用，該工程菌包括宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的目的基因，所述目的基因為如SEQ ID NO.3所示的羰基還原酶基因。本發(fā)明將SEQ ID NO.3所示的羰基還原酶基因?qū)胨拗骷?xì)胞構(gòu)建的工程菌可表達(dá)羰基還原酶Dkr，通過該酶的催化作用可實現(xiàn)將(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯不對稱還原成(3R，5S)-6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯，該反應(yīng)條件溫和，操作簡便，采用異丙醇輔酶再生的方式，使反應(yīng)過程中無需進(jìn)行pH的實時調(diào)節(jié)，不僅避免了化學(xué)法存在的反應(yīng)條件苛刻、催化劑制備復(fù)雜等問題，還對生物法進(jìn)行了一定的改進(jìn)，具有重要的應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12P7-62, C12R1-19, C12N15-53, C12N1-21
【公開號】CN104630125
【申請?zhí)枴緾N201510014460
【發(fā)明人】楊立榮, 何秀娟, 陳少云, 吳堅平, 徐剛
【申請人】浙江大學(xué)
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年1月12日