使產(chǎn)ESBLs的多重耐藥菌敏感性恢復(fù)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種使耐藥菌菌敏感性恢復(fù)的方法，具體涉及一種使產(chǎn)ESBLs的多重 耐藥菌敏感性恢復(fù)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前全球進(jìn)入了抗生素后時(shí)代，國內(nèi)多重耐藥菌的檢出率超過50% ;2012年《中 華感染學(xué)雜志》刊出：產(chǎn)超廣譜酶的多重耐藥菌陽性率為52. 4% ;《藥物流行病學(xué)雜志》報(bào) 道肺炎克雷伯產(chǎn)超廣譜酶的陽性率為49. 3%，大腸桿菌產(chǎn)超廣譜酶的陽性率為45. 4% ;現(xiàn) 在多重耐藥菌感染已經(jīng)危及到兒童的健康，2010全國監(jiān)控網(wǎng)報(bào)道：0-14歲兒童肺炎克雷伯 產(chǎn)超廣譜酶的陽性率為64. 9%，大腸桿菌產(chǎn)超廣譜酶的陽性率為69. 9% .數(shù)據(jù)顯示產(chǎn)超廣 譜酶的陽性率兒童比成人高。
[0003] 其次，醫(yī)院由于使用抗生素和消毒液，醫(yī)院環(huán)境中大部分是多重耐藥菌，在醫(yī)院出 生的新生兒，其最初建立正常菌群時(shí)的細(xì)菌就可能就是多重耐藥菌，所以新生兒一旦生病， 做培養(yǎng)時(shí)大約四分之三都是多重耐藥菌，探索恢復(fù)多重耐藥細(xì)菌敏感性的方法已經(jīng)成為一 個(gè)嶄新的課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種使產(chǎn)ESBLs的多重耐藥菌敏感性恢復(fù)的方法，顯示多重耐藥菌 在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基傳代可以恢復(fù)部分抗生素敏感性，本發(fā)明的方法切實(shí)可行，其結(jié)果具 有準(zhǔn)確、可靠的優(yōu)點(diǎn)。
[0005] 一種使產(chǎn)ESBLs的多重耐藥菌敏感性恢復(fù)的方法，包括如下步驟：
[0006] (1)選取臨床產(chǎn)ESBLs的多重耐藥菌為原始菌株，保藏備用；
[0007] (2)將所述原始菌株經(jīng)增菌、分離制備成菌懸液；
[0008] (3)將所述菌懸液轉(zhuǎn)種到一個(gè)血液增菌肉湯管，同時(shí)轉(zhuǎn)種到一個(gè)分離平皿，分別傳 代培養(yǎng)18_24h，在所述分離平皿中形成菌落；然后觀察分離平皿中的所述菌落，若所述菌 落單純無污染，說明本次傳代合格，若所述菌落有污染，則重新進(jìn)行本次傳代，直到所述菌 落無污染為止；然后將所述血液增菌肉湯管中的菌懸液轉(zhuǎn)種到另一個(gè)血液增菌肉湯管中并 同時(shí)轉(zhuǎn)種到另一個(gè)分離平皿中；重復(fù)以上步驟至少至20代；
[0009] (4)將步驟（3)得到的最后一個(gè)血液增菌肉湯管中的菌懸液轉(zhuǎn)種到血培養(yǎng)皿中進(jìn) 行分離培養(yǎng)18_24h，產(chǎn)生典型菌落，對(duì)所述典型菌落進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，同時(shí)與所述原始菌株的 藥敏進(jìn)行比較，得出血液增菌肉湯管傳代培養(yǎng)得到的細(xì)菌的藥物敏感性恢復(fù)情況。
[0010] 本發(fā)明所述使產(chǎn)ESBLs的多重耐藥菌敏感性恢復(fù)的方法，其中，所述產(chǎn)ESBLs 的多重耐藥菌為肺炎克雷伯菌ESBL(Klebsiella peneumoniae ESBL)或大腸埃希菌 ESBL(Escherichia coli ESBL);所述肺炎克雷伯菌 ESBL，保藏號(hào) CCTCC NO :M 2014594,保 藏日期：2014年11月25日，現(xiàn)已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國武漢武漢大 學(xué)；所述大腸埃希菌ESBL，保藏號(hào)CCTCC NO :M 2014593,保藏日期：2014年11月25日，現(xiàn) 已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國武漢武漢大學(xué)。
[0011] 本發(fā)明所述使產(chǎn)ESBLs的多重耐藥菌敏感性恢復(fù)的方法，其中，所述步驟（1)具體 包括如下步驟：
[0012] 取所述原始菌株的典型菌落接種到含有菌種保存液的尖底微量離心管內(nèi)，-20°C 低溫保存，所述菌種保存液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%甘油胰化酪蛋白大豆湯，其具體成分為：胰 化酪蛋白17g/L，大豆胨3g/L，氯化鈉5g/L，磷酸氫二鉀2. 5g/L，葡萄糖2. 5g/L，其余為蒸餾 水。
[0013] 本發(fā)明所述使產(chǎn)ESBLs的多重耐藥菌敏感性恢復(fù)的方法，其中，所述步驟（2)具體 包括如下步驟：
[0014] 首先把所述冷藏的尖底微量離心管內(nèi)的菌株經(jīng)過增菌培養(yǎng)，所述增菌培養(yǎng)為取少 量所述菌株加入增菌培養(yǎng)管內(nèi)，置于35土rc培養(yǎng)18-24h;然后再進(jìn)行分離培養(yǎng)，所述分離 培養(yǎng)具體步驟如下：用接種環(huán)蘸取所述增菌培養(yǎng)后的菌懸液，劃線接種到營養(yǎng)瓊脂平皿上， 置于35±1°C培養(yǎng)18-24h，可見單一菌落，判定所述菌株有無污染，如無污染則該增菌培養(yǎng) 物即為試驗(yàn)用菌懸液，若有污染則重新做上述步驟，直至無污染為止。
[0015] 本發(fā)明所述使產(chǎn)ESBLs的多重耐藥菌敏感性恢復(fù)的方法，其中，所述步驟（3)具體 包括如下步驟：
[0016] a、將所述菌懸液轉(zhuǎn)種到所述血液增菌肉湯管，同時(shí)轉(zhuǎn)種到所述分離平皿，分別傳 代培養(yǎng)，所述傳代培養(yǎng)為在35±1°C條件下培養(yǎng)18_24h，所述分離平皿中形成菌落；
[0017] b、觀察所述分離平皿中的菌落，若所述菌落單純無污染，說明本次傳代合格，若所 述菌落有污染，則重新進(jìn)行本次傳代，直到所述菌落無污染為止；
[0018] c、將所述血液增菌肉湯管和分離平皿分別編號(hào)為AjPB1;
[0019] 將所述A1血液增菌肉湯管中的菌懸液按照所述步驟a和b進(jìn)行傳代，并將轉(zhuǎn)種的 血液增菌肉湯管和分離平皿分別編號(hào)為4和B 2;
[0020] 將所述A2血液增菌肉湯管中的菌懸液按照所述步驟a和b進(jìn)行傳代，并將轉(zhuǎn)種的 血液增菌肉湯管和分離平皿分別編號(hào)為^和B 3;
[0021] 將所述A3血液增菌肉湯管中的菌懸液按照所述步驟a和b進(jìn)行傳代，并將轉(zhuǎn)種的 血液增菌肉湯管和分離平皿分別編號(hào)為?和B 4;
[0022] 按照上述方法連續(xù)傳代30次，最后一次傳代的血液增菌肉湯管和分離平皿分別 編號(hào)為AdP B3tl。
[0023] 本發(fā)明所述使產(chǎn)ESBLs的多重耐藥菌敏感性恢復(fù)的方法，其中，所述步驟（4)具體 包括如下步驟：
[0024] 將步驟（3)得到的A3tl血液增菌肉湯管中的菌懸液轉(zhuǎn)種到血培養(yǎng)皿中進(jìn)行分離培 養(yǎng)18-24h，產(chǎn)生典型菌落，對(duì)所述典型菌落進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，同時(shí)與所述原始菌株的藥敏進(jìn)行 比較，得出血液增菌肉湯管傳代培養(yǎng)得到的細(xì)菌的藥物敏感性恢復(fù)情況。
[0025] 中測(cè)定藥敏所用的儀器為法國梅里埃全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏分析儀，型號(hào)：ViETK 2Compact〇
[0026] 本發(fā)明所述使產(chǎn)ESBLs的多重耐藥菌敏感性恢復(fù)的方法，其中，所述其血液增 菌肉湯管中含有血液增菌肉湯，其組分為：蛋白胨10. 〇g/L ;牛肉浸出粉3. Og/L;氯化鈉 5. Og/L;葡萄糖I. Og/L;枸櫞酸鈉3. Og/L;磷酸氫二鉀2g g/L;對(duì)氨基苯甲酸0. 05g/L;硫 酸鎂2. 4g/L ;酚紅0. 024g/L ;其余為蒸餾水；血液增菌肉湯pH值為7. 3?7. 5 ;經(jīng)121°C滅 菌15min和35°C，24h無菌試驗(yàn)備用。
[0027] 本發(fā)明所述使產(chǎn)ESBLs的多重耐藥菌敏感性恢復(fù)的方法，其中，所述菌種保存液 制法為：將所述菌種保存液各成分混均勻，加熱溶解得到混合液，校正所述混合液的PH值 至7. 0?7. 5后，過濾所述混合液并將濾液分裝于I. 5ml尖底微量離心管內(nèi)，每管0. 6ml， 121°C條件下高壓滅菌15分鐘。
[0028] 本發(fā)明方法操作過程中應(yīng)注意的問題如下：
[0029] 排除污染：未使用的血液增菌肉湯管預(yù)先放到孵育箱預(yù)培養(yǎng)2天，以排除肉湯管 的污染，隔離衣經(jīng)高壓滅菌，使用一次性口罩和帽子.
[0030] 檢查實(shí)驗(yàn)設(shè)備的完好性：35±1°C孵育箱；試驗(yàn)前用75%酒精消毒擦拭孵育箱，細(xì) 菌室專用臺(tái)式高壓滅菌器；法國梅里埃全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏分析儀等；
[0031] 操作環(huán)境的準(zhǔn)備：試驗(yàn)在二級(jí)生物安全室進(jìn)行，每次實(shí)驗(yàn)前首先打開房間和超凈 臺(tái)的紫外線消毒40分鐘以上，消毒前預(yù)先把接種環(huán)、接種針、臨床的檢出的產(chǎn)ESBLs的多重 耐藥菌菌懸液（已編碼的）放進(jìn)超凈臺(tái)；嚴(yán)格無菌操作：洗凈雙手，穿滅菌隔離衣，帶一次 性口罩、帽子、帶無菌手套。
[0032] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0033] 本發(fā)明方法是探索多重耐藥菌恢復(fù)對(duì)抗生素的敏感性，為臨床提供可靠的藥物敏 感試驗(yàn)信息，指導(dǎo)抗生素應(yīng)用，本發(fā)明方法用血液增菌培養(yǎng)管對(duì)多重耐藥菌轉(zhuǎn)種傳代20-30 代，了解多重耐藥菌在脫離抗生素的高營養(yǎng)環(huán)境中對(duì)抗生素的敏感性恢復(fù)情況。
[0034] 本發(fā)明方法用多重耐藥菌在血液增菌肉湯管內(nèi)連續(xù)20-30代傳代，通過實(shí)驗(yàn)證明 產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌脫離抗生素環(huán)境，在營養(yǎng)豐富的血液增菌肉湯管培養(yǎng)， 對(duì)部分抗生素的敏感性恢復(fù)了，可以預(yù)測(cè)人類患病治療后體內(nèi)殘存的少許多重耐藥菌，或 者是在醫(yī)院生產(chǎn)的新生兒的攜帶的多重耐藥菌，脫離抗生素環(huán)境一段比較長的時(shí)間后其敏 感性能夠恢復(fù)。
[0035] 本發(fā)明方法中細(xì)菌的傳代是在血液增菌肉湯管中進(jìn)行的（類似人體環(huán)境），得到 的數(shù)據(jù)更加真實(shí)可靠，對(duì)今后人類抗生素的使用有指導(dǎo)意義。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 實(shí)施例1
[0037] 一種使產(chǎn)ESBLs的多重耐藥菌敏感性恢復(fù)的方法，包括如下步驟：
[0038] (1)選取臨床產(chǎn)ESBLs的多重耐藥菌為原始菌株，保藏備用；
[0039] (2)將所述原始菌株經(jīng)增菌、分離制備成菌懸液；
[0040] (3)將所述菌懸液轉(zhuǎn)種到一個(gè)血液增菌肉湯管，同時(shí)轉(zhuǎn)種到一個(gè)分離平皿，分別傳 代培養(yǎng)18_24h，在所述分離平皿中形成菌落；然后觀察分離平皿中的所述菌落，若所述菌 落單純無污染，說明本次傳代合格，若所述菌落有污染，則重新進(jìn)行本次傳代，直到菌落無 污染為止；然后將所述血液增菌肉湯管中的菌懸液轉(zhuǎn)種到另一個(gè)血液增菌肉湯管中并同時(shí) 轉(zhuǎn)種到另一個(gè)分離平皿中；重復(fù)以上步驟至少至20代；
[0041] (4)將步驟（3)得到的最后一個(gè)血液增菌肉湯管中的菌懸液轉(zhuǎn)種到血培養(yǎng)皿中進(jìn) 行分離培養(yǎng)18_24h，產(chǎn)生典型菌落，對(duì)所述典型菌落進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，同時(shí)與所述原始菌株的 藥敏進(jìn)行比較，得出血液增菌肉湯管傳代培養(yǎng)得到的細(xì)菌的藥物敏感性恢復(fù)情況。
[0042] 實(shí)施例2
[0043] -種使產(chǎn)ESBLs的多重耐藥菌敏感性恢復(fù)的方法，包括如下步驟：
[0044] (1)選取產(chǎn)肺炎克雷伯菌ESBL或大腸埃希菌ESBL為原始菌株，保藏備用：所述產(chǎn) ESBLs的多重耐藥菌為肺炎克雷伯菌ESBL或大腸埃希菌ESBL ;所