共轉(zhuǎn)化Sps、Hmgr和Dxs基因培育花蕾高青篙素含量青蒿的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及利用基因工程培養(yǎng)植物領(lǐng)域，具體是一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育高青蒿 素含量的青蒿的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 青蒿（ArtemisiaeannieL.)，菊科，艾屬。學名黃花蒿，另lj名臭蒿、香蒿、苦蒿。生 長于山坡、林緣及荒地，為一年生草本。老百姓用于消暑、頭痛、退熱和感冒等的治療。提取 青蒿素則是利用青蒿地上部分葉片和未開放的花蕾，提取生產(chǎn)的有效生理活性成分如青蒿 素等產(chǎn)品，是低毒、高效、速效的抗瘧新藥（中國藥典，2005;鐘國躍，等，2007)。影響青蒿 青蒿素含量的因素有品種、土壤條件、播種時間、加工方法、收獲時間、種植密度、光照條件、 施肥水平以及青蒿植株的不同部位等。青蒿素合成和貯存的主要器官是花蕾，青蒿野生資 源豐富，但青蒿素含量不高。不同地域的青蒿品種，花蕾中青蒿素含量的變化極顯著，其中 以重慶地區(qū)酉陽和秀山青蒿的花蕾青蒿素含量最佳。為了降低制藥廠提取青蒿素的制藥成 本，除利用傳統(tǒng)育種方法，近年來研宄利用基因工程方法提高青蒿的青蒿素含量，培育高青 蒿素含量的生物工程品種成為熱點。
[0003] 青蒿主要藥用成分及作用青蒿素化學結(jié)構(gòu)含有過氧基團，是一種倍半萜內(nèi)酯， 青蒿素的多種衍生物如雙氫青蒿索（dihydroanemisin)、青蒿琥醋（anesunatc)、蒿甲醚 (ancmether)、蒿乙醚（aneether)，均是治療瘧疾的有效藥物.研宄表明，二氫青蒿素對大 鼠C6細胞有選擇性細胞毒作用.還可誘導(dǎo)肺癌細胞系PC-14細胞和SPC-A-1細胞凋亡。 青蒿琥酯對人大腸癌細胞有抑制作用，能抑制大腸癌細胞增殖和促進凋亡。蒿甲醚、蒿乙 醚和青篙琥酯作用于腫瘤細胞后，表達的mRNA與其對腫瘤細胞的抑制作用之間存在相關(guān) 性。結(jié)果顯示青蒿素衍生物的藥效作用方式與已知的抗癌藥物不盡一致.隨著對青蒿素類 藥物藥理作用研宄的不斷深人，已證實其具有抗纖維化、抗弓形蟲、抗瘧、抗孕、抗血吸蟲、 腫瘤細胞毒性和抗心律失常等作用。雖然該類藥物作用廣泛，但其作用機制、特點和應(yīng)用仍 處于初級階段，研宄表明青蒿素可通過抑制肺組織局部炎性反應(yīng)來減輕膿毒癥大鼠的肺損 傷。青蒿還含有揮發(fā)性成分，主要是揮發(fā)油包括篙酮、倍半褚醇、異篙酮、丁香烯、石竹烯氧 化物、按油精、旅烯、左旋樟腦、龍腦等成分。其中，篙酮、樟腦、丁香烯異篙酮、龍腦等含量較 高。揮發(fā)油具有抗菌消炎、解熱鎮(zhèn)痛、止咳平喘等功效。
[0004] 青蒿貓類化合物的合成主要通過MVA和DXP兩個途徑，S卩甲輕戊酸（mevalonate pathway，MVA)途徑和 1_ 脫氧木酮糖 5_ 磷酸合酶（l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS)或甲基赤蘚醇 4_ 磷酸（methylerythritol4-phosphatepathway，MEP) DXP途徑。3-輕基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3_methylglutaryl coenzymeAreductase，HMGR)是MVA途徑重要的限速酶，而1-脫氧木酮糖5-磷酸合 酶（l-deoxy-D-xylulose-5-phosphatesynthase，DXS)是DXP途徑的關(guān)鍵性酶。在 3 種直接前體物質(zhì)法呢基二磷酸（farnesyldiphosphate,FPP),香葉基二磷酸（geranyl diphosphate，GPP)和香葉基香葉基二磷酸（geranylgeranyldiphosphate，GGPP)合 成之后，即進入貓稀合成過程，幾種貓稀合酶（terpenesynthase，TPS)在此過程發(fā) 揮著重要的作用。GPP在單貓稀合酶（monoteterpenesynthase)作用下生成單貓稀 (monoterpene，CIO)，F(xiàn)PP在倍半貓稀合酶（sesquiterpenesynthase，SPS)作用下生成倍 半貓?。╯esquiterpene，C15)，GGPP在二貓稀合酶（diterpenesynthase)作用下成二貓稀 (diterpene，C20) 〇
[0005] 青蒿素是治療瘧疾的最主要的有效的臨床用藥，此外，藥理學的深入研宄表明， 青蒿素及其衍生物是一種廣譜性的天然藥物。研宄表明，每年世界上有超過100萬人死于 瘧疾。瘧原蟲耐藥性，使得抗瘧藥物氯喹的藥物效果受限，而青蒿素對瘧疾具有低毒和速 效的特點。目前青蒿素是公認有效的治療瘧疾首選藥物，這使得提取青蒿素的原材料青 蒿需求量非常大。生物工程技術(shù)成為提高青蒿素含量的可行途徑之一。Chen等利用在青 蒿中能夠過量表達PEP基因，轉(zhuǎn)化的青蒿植株中青蒿素含量比對照高3-5倍。Teoh等認 為cyp71avl基因在青蒿素生物合成途徑中是關(guān)b鍵的限速基因，并從特異cDNA中克隆到 cyp71avl基因。Ro等也克隆cyp71avl基因及其氧還伴侶基因cpr,并將cyp71avl基因和 cpr基因?qū)虢湍覆⒊晒Φ靥岣吡饲噍锼睾?。文獻中有利用A0C基因（唐克軒，等）以及 ADS，CYP71AV1，CPR(唐克軒，等）三個基因通過根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得生物工程青蒿的報道， 均是利用目的基因提高青蒿素含量的方法。
[0006] 從中藥材青蒿花蕾中提取的青蒿素（ArtemisiaannuaL.)用于抗皰疾，原材料 青蒿需求量大，但野生青蒿得青蒿素含量很低，只占青蒿植株干重〇. 01-0. 1%，如何提高 青蒿素含量，成為熱點課題，通過生物工程辦法改造提高青蒿素含量是一種有效途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對現(xiàn)有生產(chǎn)中對高青蒿素含量青蒿的需求，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是在青 蒿基因組中導(dǎo)入能增加青蒿素合成的基因，并增強其原有基因的表達，獲得轉(zhuǎn)基因青蒿新 品系，以提高其青蒿素合成能力，使其花蕾中能超量蓄積青蒿素，使這種轉(zhuǎn)基因青蒿品系成 為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的原材料。
[0008] 倍半貓稀合酶（sesquiterpenesynthase，Sps,EC4. 3. 1. 8)是青蒿植株合 成青蒿素的關(guān)鍵酶，而3-輕基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3_methyl glutarylcoenzymeAreductase,HMGR,EC: 1. 1. 1. 34)，1-脫氧木酮糖 5_ 磷酸合酶 (1-deoxy-D-xylulose5-phosphatesynthase，DXS,EC4. 1.3. 37)，是合成青蒿素的限速 酶。增強Sps，HMGR和DXS三個酶的活性，可以提高植株青蒿素的含量，本發(fā)明將關(guān)鍵酶基 因Sps，Hmgr和Dxs三基因轉(zhuǎn)化青蒿，提高青蒿中的青蒿素合成，獲得高青蒿素含量的基因 工程青蒿品種，為培育高青蒿素含量的青蒿提供一種新的方法。本發(fā)明旨在構(gòu)建Sps，Hmgr 和Dxs三基因的兩兩組合構(gòu)建植物表達載體，并獲得重組工程植株，利用生物工程技術(shù)培 育高青蒿素含量的青蒿奠定基礎(chǔ)。
[0009] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：共轉(zhuǎn)化Sps、Hmgr和Dxs基因培育花 蕾高青篙素含量青蒿的方法，包括如下步驟：
[0010] 1)克隆倍半萜烯合酶的基因片段，記為Sps基因片段，并將Sps基因片段構(gòu)建成 Anti-Sps基因植物表達載體；
[0011] 2)克隆3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶的基因片段，記為Hmgr基因片段，并 將Hmgr基因片段構(gòu)建成Anti-Hmgr基因植物表達載體；
[0012] 2)克隆1-脫氧木酮糖5-磷酸合酶的基因片段，記為Dxs基因片段，并將Dxs基因 片段構(gòu)建成Anti-Dxs基因植物表達載體；
[0013] 4)將利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將Anti-Sps、Anti-Hmgr和Anti-Dxs導(dǎo)入青蒿，獲得包含 Sps、Hmgr基因和Dxs基因的青蒿植株。該步中可以將Anti-Sps、Anti-Hmgr和Anti-Dxs 同時導(dǎo)入同一青蒿，獲得包括SpS、Hmgr和Dxs基因片段的轉(zhuǎn)基因青蒿。還可以采用電擊法 將Anti-Sps、Anti-Hmgr和Anti-Dxs導(dǎo)入同一農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞LBA4404,然后采用農(nóng)桿 菌介導(dǎo)法將所述農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞LBA4404導(dǎo)入青蒿，構(gòu)成包含Sps、Hmgr和Dxs基因的青 蒿植株。
[0014] 本發(fā)明所述的構(gòu)建Sps、Hmgr和Dxs基因植物表達載體包括：從亞克隆中酶切出 目的基因片段，電泳回收后與植物表達載體，例如PCAMBIA2301連接成轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化 (AgrobacteriumTumefaciens)大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，并進行抗性篩選。按照英文影印 版5擬南芥實驗手冊6.DetlefweigelandJaneGlaZebrook.化學工業(yè)出版社.2004年3月 第1版，第1次印刷的方法制備）
[0015] 本發(fā)明所述的生物工程方法，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。其中，優(yōu)選農(nóng)桿菌介導(dǎo)法（參見 SambrookT，TanaKaK，MonmaT.MolecularCloning:ALaboratoryManual.ColdSpring HarborLaboratorypress，NewYork，1989)。經(jīng)由農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞LBA4404感染的青蒿 外植體（如無菌苗下胚軸）再生為正常植株。
[0016] 本發(fā)明用于作為Sps、Hmgr和Dxs基因受體親本的青蒿素含量相對高的青蒿是同 一品種。利用本發(fā)明獲得花蕾青篙素含量提高的轉(zhuǎn)基因青篙植株，在非轉(zhuǎn)化對照青篙含量 為6. 20mg/g干重時，本發(fā)明得到的基因工程青篙植株中花蕾青篙素含量最高12. 10mg/g 干重，其含量是非轉(zhuǎn)化對照青篙含量的1. 95倍，本發(fā)明的方法對于以青篙為原料的藥廠 節(jié)約成本具有重要意義。
【附圖說明】
[0017] 圖1植物雙元表達載體載體結(jié)構(gòu)圖；
[0018] 圖中A為pCAMBIA23(U-Sps-Hmgr，B為