專利名稱：:一種控制水稻抽穗期基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一種控制水稻抽穗期基因，采用正向遺傳學(xué)的方法，篩選水稻T-DNA插入突變體庫，通過突變表型與T-DNA插入位點(diǎn)基因共分離檢測及互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明，分離克隆的OsCM2基因?yàn)榭刂扑境樗肫诨?。本發(fā)明還涉及含有該基因或其同源基因的載體和涉及利用該基因或其功能類似物調(diào)控植物的抽穗期在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：水稻作為重要的糧食作物，世界上三分之一以上的人以其為主食。同時(shí)，由于水稻具有基因組小、精細(xì)的遺傳和物理圖譜、相對容易的轉(zhuǎn)基因技術(shù)及與其它禾本科作物的共線性，而被作為基因組研究的模式植物。隨著包括水稻在內(nèi)的多種生物基因組測序的完成，人類開始進(jìn)入后基因組時(shí)代。全面開展功能基因組研究已成為生命科學(xué)的前沿領(lǐng)域。水稻基因功能的研究對社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生物學(xué)研究具有重大意義。水稻抽穗期是決定品種地區(qū)與季節(jié)適應(yīng)性的重要農(nóng)藝性狀，能否適應(yīng)特定地區(qū)生態(tài)環(huán)境、栽培耕作制度，主要取決于該品種在當(dāng)?shù)氐纳?。選育早熟高產(chǎn)的水稻品種一直為水稻育種家所重視，水稻早熟基因的發(fā)現(xiàn)和利用將有助于解決早熟與豐產(chǎn)難以兼顧的矛盾，也有利于克服秈粳亞種間F1超親遲熟的障礙。水稻秈粳亞種間雜種具有強(qiáng)大的雜種優(yōu)勢。但目前亞種間強(qiáng)優(yōu)組合的廣泛選配和實(shí)際利用仍受到諸多限制，其中生育期超親就是最主要的制約因素之一。抽穗期遺傳研究對指導(dǎo)育種實(shí)踐、品種改良及品種推廣均具有重要意義，另外越來越頻繁的自然災(zāi)害使選育合適生育期以及抽穗期受環(huán)境影響較小的品種在避災(zāi)利用中顯得尤其重要。因此發(fā)掘和鑒定水稻抽穗期基因包括QTL(quantitativetraitlocus)，并深入探討水稻抽穗期基因的分子作用機(jī)理，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。此外，分析抽穗期感光基因在栽培稻主要生態(tài)型中的分布頻率，對探討水稻類型的演化、起源與進(jìn)化，以及種質(zhì)的合理利用也具有重大意義。同時(shí)水稻作為單子葉模式植物，這方面研究也對同類植物特別是禾本科糧食作物的抽穗期基因和QTL研究具有指導(dǎo)意義。研究水稻抽穗期基因和QTL的最終目的是促進(jìn)水稻遺傳育種，實(shí)現(xiàn)水稻早熟高產(chǎn)。(董春林等，水稻抽穗期基因研究進(jìn)展。中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21(6)75-78；岳兵，邢永忠，水稻抽穗期分子遺傳研究進(jìn)展。分子植物育種，2005，3(2)222-228；鄧曉建等，水稻品種生育期的遺傳和基因定位。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，19(2)172-178)抽穗期的長短主要由品種的基本營養(yǎng)生長、感光性和感溫性決定，但感溫性與水稻的抽穗期沒有直接關(guān)系。在生理上，水稻生育期可分為營養(yǎng)生長階段和生殖生長階段，營養(yǎng)生長階段又可分為基本營養(yǎng)階段(basicvegetativephase，BVP)和感光階段(photoperiodsensitivephase，PSP)。水稻的生殖生長期和成熟期對大多數(shù)水稻品種來說都較穩(wěn)定，而營養(yǎng)生長期則變化較大。因此，水稻品種生育期的不同主要是營養(yǎng)生長期變化所致，通?？捎贸樗肫诩床シN到抽穗的天數(shù)來反映生育期長短。由營養(yǎng)生長階段轉(zhuǎn)入生殖生長階段是水稻感受外界信號完成其生活史的重要過程，植物感受外界光溫信號后，通過一系列信號傳導(dǎo)及放大最終引起營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變。感光性和基本營養(yǎng)生長性組合的多樣性及強(qiáng)弱的不同，使得抽穗期呈現(xiàn)多種多樣的變化，同時(shí)抽穗期容易受到環(huán)境條件的影響，其遺傳基礎(chǔ)較為復(fù)雜，一般認(rèn)為抽穗期是由主效基因和微效基因共同控制的(岳兵，邢永忠，水稻抽穗期分子遺傳研究進(jìn)展。分子植物育種，2005，3(2)222-228；羅林廣等，水稻抽穗期的遺傳學(xué)研究。江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2001，17(2)119～126；鄧曉建等，水稻品種生育期的遺傳和基因定位。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，19(2)172-178)。由于抽穗期的重要性，人們對抽穗期的研究已較為深入。特別是DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，借助高密度的分子連鎖圖譜，使數(shù)量性狀基因定位工作發(fā)展很快。利用分子標(biāo)記進(jìn)行水稻抽穗期QTL定位已有不少研究報(bào)道。其它禾谷類作物抽穗期QTL定位工作也已廣泛開展。已有的遺傳研究表明在控制水稻抽穗期基因中，感光基因及其修飾基因有18個(gè)顯性感光基因有Se-1、Se-3(t)、Se-4(t)、Se-5、E1、E2、E3、E4和U，隱性感光基因有se-2、se-6(t)、se-7(t)、se-9(t)和ef-2(t)，感光修飾基因有i-Se-1、Su-Se-1(t)、En-Se-1(t)和se-pat(t)。感光基因中，效應(yīng)較大的是位于第6染色體的Se-1和位于第7染色體的E1，可能是控制水稻感光性的2個(gè)最主要基因。在已報(bào)道的11個(gè)非感光基因及其修飾基因中，顯性早熟基因有Ef-1、Ef-x(t)、Ef-y(t)和Ef-cd(t)，隱性早熟基因有ef(t)，隱性遲熟基因有ef-3(t)、ef-4(t)和1ff-3(t)，修飾基因有m-Ef-1w-Ef-1(t)和Su-Ef-cd(t)。而基本營養(yǎng)生長期則由2至3個(gè)基因控制。(董春林等，水稻抽穗期基因研究進(jìn)展。中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21(6)75-78)同時(shí)不同基因間還存在互作關(guān)系，顯性早熟基因位點(diǎn)Ef-1，有增強(qiáng)其早熟效應(yīng)的修飾基因ma-和mb-Ef-1，及減弱Ef-1早熟效應(yīng)的修飾基因w-Ef-1。非感光基因之間，如Ef-1與ef-3或ef-4結(jié)合時(shí)，二者的早、遲熟效應(yīng)相互抵消，ef-3與ef-4結(jié)合時(shí)，二者的遲熟效應(yīng)累加。感光基因與非感光基因之間也存在互作或修飾。如隱性感光基因se-6和se-7在與顯性早熟基因Ef-1結(jié)合時(shí)，二者的效應(yīng)可被Ef-1抑制。隱性感光基因ef-2與Ef-1結(jié)合時(shí)，二者的遲、早熟效應(yīng)相互抵消，與ef-3或ef-4結(jié)合時(shí)，二者的遲熟效應(yīng)累加。強(qiáng)感光基因E1的隱性等位基因e1則是Ef-1的修飾基因。此外隱性基因ef-1和se-1的同時(shí)存在可顯著延長水稻的基本營養(yǎng)生長期。控制水稻感光性的基因E1、E2、E3，其中E1基因的作用遠(yuǎn)比E2和E3大，但E3的存在，特別是E2和E3同時(shí)存在時(shí)，E1的感光性效應(yīng)顯著增強(qiáng)。而隱性感光抑制基因i-Se-1的存在，可抑制Se-1的感光性，使得水稻在長日照下提前抽穗。已有研究表明，大多數(shù)早秈品種雖然帶有感光基因但不表現(xiàn)出感光特性，原因就在于這些品種存在隱性感光抑制基因i-Se-1。(羅林廣等，水稻抽穗期的遺傳學(xué)研究。江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2001，17(2)119-126；徐俊鋒等，水稻光溫敏雄性不育系培矮64S的抽穗期基因型分析。遺傳學(xué)報(bào)，2005，32(1)57-65；鄧曉建等，水稻品種生育期的遺傳和基因定位。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，19(2)172-178)根據(jù)Gramene網(wǎng)站(http://www.gramene.org/qtl/index.html)最新公布的數(shù)據(jù)，水稻抽穗期QTL定位方面，目前共定位了653個(gè)QTLs，分布于水稻12條染色體上，其中第3、7染色體上定位的QTL較多，而第10染色體上發(fā)現(xiàn)的最少。對定位的水稻抽穗期QTL構(gòu)建近等基因系并進(jìn)行精細(xì)定位后，可用圖位克隆法加以克隆。目前有許多控制抽穗期基因已被克隆，如Hdl基因(YanoM.etal.，Hdl，amajorphotoperiodsensitivityquantitativetraitlocusinrice，iscloselyrelatedtotheArabidopsisfloweringtimegeneCONSTANS，ThePlantCell，2000，122473-2483)；SE5基因(IzawaT.etal.，Phytochromesconferthephotoperiodiccontroloffloweringinrice(ashort-dayplant)，PlantJ.，2000，22391-399)；Hd6基因(TakahashiY.etal.，Hd6，aricequantitativetraitlocusinvolvedinphotoperiodsensitivity，encodestheasubunitofproteinkinaseCK2，Proc.Natl.Acad.Sci.，2001，987922-7927)；Hd3a基因(KojimaS.etal.，Hd3a，ariceorthologoftheArabidopsisFTgene，promotestransitiontofloweringdownstreamofHdlundershort-dayconditions，PlantCellPhysiol，2002，431096-1105)；Ehdl基因(DoiK.etal.，Ehdl，aB-typeresponseregulatorinrice，confersshort-daypromotionoffloweringandcontrolsFT-likegeneexpressionindependentlyofHdl，GenesDev.，2004，18(8)926-936)。以上這些抽穗期基因或QTL都是通過傳統(tǒng)圖位克隆法克隆到，首先必須構(gòu)建一個(gè)很好的群體，如重組自交系，DH群體或近等基因系等，再上大量標(biāo)記，通過基因與標(biāo)記的共分離，逐漸縮小目標(biāo)區(qū)段，是一個(gè)耗時(shí)耗力的過程。而通過T-DNA標(biāo)簽技術(shù)克隆基因，完全從另一個(gè)不同的角度，打開了克隆抽穗期基因的一扇窗。大量研究表明，農(nóng)桿菌T-DNA是隨機(jī)整合到植物基因組中，由于T-DNA序列已知，猶如給基因組“貼”了一個(gè)序列標(biāo)簽，為分離側(cè)翼序列帶來方便?？梢酝ㄟ^創(chuàng)建T-DNA插入突變體，觀察突變體抽穗期變異，檢測T-DNA與突變表型共分離，根據(jù)分離到的側(cè)翼序列，可知道是什么基因發(fā)生突變，再做互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證就可以克隆到抽穗期基因。本發(fā)明通過T-DNA標(biāo)簽技術(shù)克隆到了控制水稻抽穗期的基因OsCM2。水稻抽穗期遺傳基礎(chǔ)的揭示最終依賴于所有抽穗期基因的克隆及功能分析。對擬南芥的成花基因研究發(fā)現(xiàn)，至少存在生物鐘、光周期、春化作用及自主促進(jìn)開花等路徑。另外，Cerdan和Chory發(fā)現(xiàn)還存在一個(gè)光質(zhì)調(diào)控植物開花的路徑(CerdanP.D.，andChoryJ.，Regulationoffloweringtimebylightquality，Nature，2003，423881-885)。水稻與擬南芥在誘導(dǎo)開花的基因上具有保守性，水稻作為短日模式植物將與長日模式植物擬南芥一起，在最終揭開植物成花的機(jī)理的研究中將發(fā)揮不可替代的作用。(岳兵，邢永忠，水稻抽穗期分子遺傳研究進(jìn)展。分子植物育種，2005，3(2)222-228)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種控制水稻抽穗期基因OsCM2，該基因從T-DNA插入突變體中鑒定并分離克隆，具有如SEQ.ID.No.1所示的核苷酸序列，或至少50％同源性的序列。以及上述DNA片段編碼的蛋白或經(jīng)過改造修飾的具有相同功能的蛋白。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供OsCM2基因在控制水稻抽穗期中的應(yīng)用，通過OsCM2基因，SEQ.ID.NO1或與其功能等同的同源基因在水稻植株中超量表達(dá)或抑制表達(dá)，一種分離的蛋白質(zhì)，其具有SEQIDNO2所示氨基酸序列至少50％同源性的序列，來達(dá)到控制水稻抽穗期的目的，從而提高水稻品種的地區(qū)與季節(jié)適應(yīng)性。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)如下創(chuàng)建水稻T-DNA插入突變體庫T0代(Wu等，Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.PlantJ.2003，35418-27.)。從T0代突變體庫中選出3000份種子(T1代)，正常大田條件下種植，每份種20株(稱為1個(gè)家系)。觀察突變體抽穗期變化，共觀察到約72個(gè)家系有抽穗期突變。用PCR(polymerasechainreaction)方法檢測突變家系與T-DNA是否共分離，72個(gè)突變家系中有35個(gè)為PCR陽性共分離。并對每個(gè)共分離家系所種的20個(gè)單株做PCR陽性檢測，大致估算T-DNA拷貝數(shù)，根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律單位點(diǎn)基因會出現(xiàn)3∶1分離，當(dāng)陽性∶陰性＝3∶1為單拷貝，檢測結(jié)果約有30％家系為單拷貝。對35個(gè)T-DNA共分離家系做Tail-PCR(ThermalasymmetricinterlacedPCR)(LiuYG，WhittierRF.ThermalasymmetricinterlacedPCRAutomatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromP1andYACclonesforchromosomewalking.Genomics，1995，25674-681)分離側(cè)翼序列。有12個(gè)家系分離到側(cè)翼序列，分析側(cè)翼序列發(fā)現(xiàn)6個(gè)家系的側(cè)翼序列能很好的定位在水稻基因組上。接著設(shè)計(jì)引物做進(jìn)一步共分離驗(yàn)證，如圖2，A表示在插入位點(diǎn)上游設(shè)計(jì)的引物，B表示在插入位點(diǎn)下游設(shè)計(jì)的引物，C表示根據(jù)T-DNA邊界序列設(shè)計(jì)的引物。在T1代植株中，T-DNA位點(diǎn)純合植株只有A和C配對可以擴(kuò)增出電泳帶，因?yàn)橛蠺-DNA插入A與B配對的產(chǎn)物太大無法得到擴(kuò)增片段，野生型的植株由于沒有T-DNA的插入，只有A和B配對可以得到產(chǎn)物，雜合植株則A和C配對以及A和B配對時(shí)都可以擴(kuò)增得到產(chǎn)物。結(jié)果6個(gè)家系中只有一個(gè)家系證明突變表型與T-DNA插入共分離。該突變體比正常植株抽穗遲20天。為了驗(yàn)證該突變體的遺傳穩(wěn)定性及進(jìn)一步驗(yàn)證共分離情況，又繁殖了一代，結(jié)果T2代仍然表現(xiàn)出穩(wěn)定的突變表型，且表型與基因型完全符合。該突變體T-DNA插入在水稻第2染色體上，為單拷貝，GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中對應(yīng)的克隆號AP004087，插入該克隆第22640位堿基旁，分析插入位點(diǎn)附近序列發(fā)現(xiàn)，T-DNA插入一個(gè)假定的分枝酸變位酶基因中。由于T-DNA上含有EnhancerTrap(SpringerPS.GeneTrapsToolsforplantdevelopmentandgenomics.PlantCell，2000，121007-1020)，其上的報(bào)告基因帶有一個(gè)剪切過的小啟動子，僅含TATAbox和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，不足以啟動報(bào)告基因β-glucuronidaseA(GUS)表達(dá)，而只有借助鄰近的增強(qiáng)子元件才能表達(dá)。通過檢測報(bào)告基因的表達(dá)模式，可以判斷該增強(qiáng)子元件所控制基因的表達(dá)模式。對突變體GUS染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)在根、莖、葉中全部有GUS表達(dá)，這與該基因在擬南芥中的表達(dá)模式相同(JennyEberhardetal.，Cloningandexpressioninyeastofahigherplantchorismatemutasemolecularcloning，sequencingofthecDNAandcharacterizationoftheArabidopsisthalianaenzymeexpressedinyeast.PlantJournal，1996，334(2)233-236)。對正常水稻做RNAi(RNAinterference)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約有1/5的轉(zhuǎn)化子抽穗時(shí)間推遲約17-22天，其它抽穗時(shí)間介于突變與正常之間。同時(shí)做互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證OsCM2基因功能，用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI(Takara公司)酶切日本晴BAC克隆OSJNBa0037D03(http://www.genome.arizona.edu)可以切出含有OsCM2基因的約11.5KB的片段，連接到載體pCAMBIA2301上(pCAMBIA2301由澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoIntemationalAgriculture)惠贈，采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將構(gòu)建好的互補(bǔ)載體導(dǎo)入抽穗遲突變體。最后獲得互補(bǔ)轉(zhuǎn)化的組培苗100株，作為對照的由突變體愈傷不經(jīng)過轉(zhuǎn)化直接分化得到的30株苗子，以及野生型粳稻品種中花11號愈傷分化苗子30株，都種于大田，結(jié)果沒經(jīng)過互補(bǔ)的突變苗全部表現(xiàn)抽穗遲，野生型粳稻品種中花11號愈傷分化苗抽穗正常，30株互補(bǔ)的轉(zhuǎn)化苗有50％恢復(fù)正常。說明OsCM2基因具有控制抽穗期的功能。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.采用T-DNA標(biāo)簽法克隆基因速度快，效率高。2.雖然在低等生物和擬南芥中克隆到了分枝酸變位酶基因(chorismatemutase，CM)，但只是對其做酶學(xué)特性和生化途徑中的作用進(jìn)行分析，甚至對CM-2在生化途徑中的作用也很模糊，更不知其具體的生物學(xué)功能，目前在水稻中還沒有對CM-2具體研究的報(bào)道，本發(fā)明克隆的OsCM2基因?qū)λ境樗肫谟酗@著的影響，這對闡明分枝酸變位酶基因的生物學(xué)功能有重要意義。3.該突變體使抽穗期推遲20天，說明OsCM2基因?qū)Ω淖兂樗肫谛Ч苊黠@，通過基因工程技術(shù)提高或減弱OsCM2基因的表達(dá)量能夠控制植物抽穗期。4.水稻抽穗期決定了品種的地區(qū)與季節(jié)適應(yīng)性，一個(gè)品種能否適應(yīng)特定地區(qū)生態(tài)環(huán)境、栽培耕作制度，主要取決于該品種在當(dāng)?shù)氐纳?。通過基因工程技術(shù)提高或減弱OsCM2基因的表達(dá)量能夠達(dá)到控制植物抽穗期的目的，OsCM2基因的克隆將有助于提高水稻品種的地區(qū)與季節(jié)適應(yīng)性。5.選育早熟高產(chǎn)的水稻品種一直為水稻育種家所重視，水稻早熟基因的發(fā)現(xiàn)和利用將有助于解決早熟與豐產(chǎn)難以兼顧的矛盾，通過超量表達(dá)OsCM2基因可以達(dá)到早熟的目的，從而解決早熟與豐產(chǎn)的矛盾。6.水稻秈粳亞種間雜種具有強(qiáng)大的雜種優(yōu)勢，但目前亞種間強(qiáng)優(yōu)組合的廣泛選配和實(shí)際利用仍受到諸多限制，其中生育期超親就是最主要的制約因素之一。OsCM2基因的克隆有利于克服秈粳亞種間F1超親遲熟的障礙。7.越來越頻繁的自然災(zāi)害使選育合適生育期以及抽穗期受環(huán)境影響較小的品種在避災(zāi)利用中顯得尤其重要。OsCM2基因的克隆將有助于培育更適合的品種。8.抽穗期遺傳研究對指導(dǎo)育種實(shí)踐、品種改良及品種推廣均具有重要意義，因此發(fā)掘和鑒定水稻抽穗期基因，并深入探討水稻抽穗期基因的分子作用機(jī)理，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)水稻作為單子葉模式植物，這方面研究也對同類植物特別是禾本科糧食作物的抽穗期基因研究具有指導(dǎo)意義。水稻抽穗期遺傳基礎(chǔ)的揭示最終依賴于所有抽穗期基因的克隆及功能分析。對擬南芥的成花基因研究發(fā)現(xiàn)，至少存在生物鐘、光周期、春化作用及自主促進(jìn)開花等路徑。水稻與擬南芥在誘導(dǎo)開花的基因上具有保守性，水稻作為短日模式植物將與長日模式植物擬南芥一起，在最終揭開植物成花的機(jī)理的研究中將發(fā)揮不可替代的作用。圖1.創(chuàng)建突變體庫所用載體圖pSMR-J18R(http://rmd.ncpgr.cn/)。圖2.根據(jù)插入位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物驗(yàn)證共分離示意圖。A表示在插入位點(diǎn)上游設(shè)計(jì)的引物，B表示在插入位點(diǎn)下游設(shè)計(jì)的引物，C表示根據(jù)T-DNA邊界序列設(shè)計(jì)的引物。在T1代植株中，T-DNA插入位點(diǎn)純合突變體只有A和C配對可以擴(kuò)增的出，因?yàn)橛蠺-DNA插入A與B配對的產(chǎn)物太大無法得到擴(kuò)增片段，野生型的植株由于沒有T-DNA的插入，只有A和B配對可以得到產(chǎn)物，T-DNA插入位點(diǎn)雜合植株則A和C配對以及A和B配對時(shí)都可以擴(kuò)增得到產(chǎn)物。圖3.T1代單株根據(jù)插入位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增的結(jié)果。上一行引物A+B，下一行引物C+B，M表示2KBMaker，其中泳道1，2，3，5，7，9，11，16，19，20，為T-DNA插入位點(diǎn)純合植株DNA樣品；4，12，13，14，15為T-DNA插入位點(diǎn)雜合植株DNA樣品；6，8，10，17，18為該位點(diǎn)不含T-DNA插入的DNA樣品。PCR擴(kuò)增結(jié)果與該植株田間表型對應(yīng)發(fā)現(xiàn)，T-DNA插入位點(diǎn)純合植株均表現(xiàn)為遲抽穗；T-DNA插入位點(diǎn)雜合與T-DNA陰性植株均表現(xiàn)為抽穗正常。圖4.遲抽穗突變體Oscm2的照片。圖5.T2代驗(yàn)證共分離的PCR結(jié)果。上一行引物A與B配對，下一行引物C與B配對，M表示2KBMaker，泳道1，5，8，12，15，17，21，29，31，36，37為T-DNA插入位點(diǎn)純合植株；2，4，7，11，13，14，16，19，20，22，25，27，28，30，33，34，35，40為T-DNA插入位點(diǎn)雜合單株；3，6，9，10，18，23，24，26，32，38，39為T-DNA陰性單株。與田間表型對照，T-DNA純合植株表型為抽穗遲；T-DNA雜合與T-DNA陰性植株表型為抽穗正常。圖6.OsCM2基因結(jié)構(gòu)圖。圖7.莽草酸途徑。(LarsM.Voll，TheArabidopsisphenylalanineinsensitivegrowthMutantExhibitsaDeregulatedAminoAcidMetabolism.PlantPhysiology，2004，136，3058-3069)。圖8.抽穗遲Oscm2突變體GUS染色結(jié)果。圖9.pHellsgate8載體圖(http://www.pi.csiro.au/tech_licensing_biol/MapsProtocol.htm)。圖10.粳稻品種中花11號RNAi干涉基因OsCM2后的表型。具體實(shí)施方式實(shí)施例1OsCM2基因的分離克隆1.創(chuàng)建突變體庫(T0代)所用載體pSMR-J18R由澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室(CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriculture)惠贈，如圖1，以農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)方式在粳稻水稻品種中花11號(OryzasativaL.subsp.japonicacv.Znonghua11)基因組中隨機(jī)插入T-DNA(含EnhancerTrap)(SpringerPS.GeneTrapsToolsforplantdevelopmentandgenomics.PlantCell，2000，121007-1020)創(chuàng)建突變體庫，突變體庫的構(gòu)建是按照Wu等所描述的方法構(gòu)建而成(Wu等，Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.PlantJ，2003，35418-427)。目前約得到10萬株獨(dú)立轉(zhuǎn)化子。2.T1代分蘗性狀大田篩選從T0代突變體庫中選出3000份T1代種子，先在秧田劃5×8寸的格子播種，20天后再移栽至大田篩選。每份材料種2行，每行10株，共20株(為1家系)，行與行間間距8寸，株與株間間距5寸。從開始抽穗起，每隔一天下田觀察登記抽穗日期。共觀察到約72個(gè)家系有抽穗期突變(與正常中花11抽穗期相比早或遲7天以上)。3.突變株系與T-DNA共分離檢測及T-DNA拷貝數(shù)初步分析。用PCR方法檢測突變家系與T-DNA是否共分離，即突變株必需是T-DNA陽性。所用引物GAL4-L5’AGACCGGCAACAGGATTCAATC3’，GAL4-R5’TTCGTCCAGGACAACGTGAACA3’，反應(yīng)體系的總體積為20μl，DNA模板1ul(約50ng)、1×Taq酶反應(yīng)緩沖液、25mMMgCL21.2ul、2mMdNTP1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3UTaq酶，加ddH2O(無菌去離子水)至20μl。反應(yīng)程序?yàn)?4℃變性5min，94℃45s、55℃45s、72℃1min30cycles，72℃延伸5min。擴(kuò)出的片段為T-DNA上的一個(gè)片段，大小為611bp。72個(gè)突變家系中有35個(gè)為PCR陽性共分離。并對每個(gè)共分離家系所種的20個(gè)單株做陽性檢測，大致估算T-DNA拷貝數(shù)，根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律單位點(diǎn)基因會出現(xiàn)3∶1分離，當(dāng)陽性∶陰性＝3∶1時(shí)為單拷貝。檢測結(jié)果約有30％家系為單拷貝。4.分離側(cè)翼序列對35個(gè)T-DNA共分離家系按Liu等的Tail-PCR方法(LiuYG，WhittierRF.ThermalasymmetricinterlacedPCRAutomatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromP1andYACclonesforchromosomewalking.Genomics，1995，25674-681)分離側(cè)翼序列。利用CTAB法抽提突變體總DNA，方法如SAGHAI-MAROOF等(SAGHAI-MAROOFetal.，RibosomalDNAspacer-lengthpolymorphismsinbarleyMendelianinheritance，chromosomallocation，andpopulationdynamics.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1984，818014-8018)。根據(jù)轉(zhuǎn)化載體pSMR-J18R的T-DNA左側(cè)末端設(shè)計(jì)的嵌套式特異引物序列和引物在載體上對應(yīng)的位置如下引物L(fēng)SP25’-GAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACC-3’6701-6677；LBT2引物5’-ATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCAT-3’6550-6524；LBT3引物5’-CCAGTACTAAAATCCAGATCCCCCGAAT-3’6447-6420。用于分離側(cè)翼序列的簡并引物及其序列為引物AD2a5’-(AGCT)GTCGA(GC)(AT)GA(AGCT)A(AT)GAA-3’。反應(yīng)體系為第一輪DNA模板1.0μl；10×buffer2.0μl；2MmdNTP2.0μl；25MmMgCl22.0μl；10μM特異性引物0.2μ1；100μM簡并引物0.2μl；Taq酶lu；加ddH2O至20μl。第二輪DNA模板1.0μl；10×buffer2.0μl；2MmdNTP2.0μl；25MmMgCl22.0μl；50％甘油2.0μl；10μM特異性引物0.2μl；100μM簡并引物0.2μl；Taq酶lu；加ddH2O至20μl。第三輪DNA模板1.0μl；10×buffer2.0μl；2mMdNTP1.5μl；25mMMgCl21.2μl；50％甘油2.0μl；10μM特異性引物0.2μl；100μM簡并引物0.2μl；Taq酶1u；加ddH20至20μl。反應(yīng)程序按照Liu等的方法進(jìn)行。反應(yīng)完成后，取第三輪反應(yīng)產(chǎn)物5μl在0.8％的瓊脂糖凝膠上檢測。采用低熔點(diǎn)瓊脂糖挖膠回收的方法純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物。純化方法為將第三輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1％的低熔點(diǎn)瓊脂糖上電泳，把擴(kuò)增產(chǎn)物條帶從膠上切下放入1.5mlEppendoff離心管中，65℃水浴15min，加入等體積PH7.9苯酚，顛倒搖勻5min，13000r/min離心8min，取上清，加入等體積氯仿異戊醇(體積比24∶1)顛倒搖勻5min，13000r/min離心8min，取上清，加入1/10體積3M醋酸鈉(PH5.2)，2倍體積預(yù)冷的95％乙醇，混勻后置-20℃冰箱中20min以上，13000r/min離心15min，倒掉95％乙醇后再用75％乙醇浸洗沉淀，自然風(fēng)干，DNA沉淀溶于20μl無菌去離子水。把回收產(chǎn)物測序，測序引物序列及在載體上位置為引物NTLB55’-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3’6437-6418，有12個(gè)家系分離到側(cè)翼序列，分析側(cè)翼序列發(fā)現(xiàn)有6個(gè)家系的側(cè)翼序列能很好的定位在水稻基因組上。5.根據(jù)側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)一步做共分離檢測根據(jù)側(cè)翼序列與水稻基因組的匹配情況，確定插入位點(diǎn)，在插入位點(diǎn)的兩邊設(shè)計(jì)一對引物A和B，及T-DNA上設(shè)計(jì)一條引物C，如圖2，A表示在插入位點(diǎn)上游設(shè)計(jì)的引物，B表示在插入位點(diǎn)下游設(shè)計(jì)的引物，C表示根據(jù)T-DNA內(nèi)部序列設(shè)計(jì)的引物。在T1代植株中，T-DNA純合植株只有A和C配對可以擴(kuò)增的出，因?yàn)橛蠺-DNA插入A與B配對的產(chǎn)物太大無法得到擴(kuò)增片段，野生型的植株由于沒有T-DNA的插入，只有A和B配對可以得到產(chǎn)物，雜合植株則A和C配對以及A和B配對時(shí)都可以擴(kuò)增得到產(chǎn)物。如果突變性狀是隱性的，那所有突變株用A和B配對擴(kuò)不出的為共分離。如果突變性狀是顯性的，那所有突變單株用C和B配對都擴(kuò)出，正常單株用C和B配對都擴(kuò)不出的為共分離。結(jié)果6個(gè)家系中只有一個(gè)家系是共分離。該家系突變表型，如圖4，該突變體比正常植株抽穗遲20天。其分離的側(cè)翼序列全長520bp如下atgctcttattagtaattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcttaccagctgtggcttattgcttggccgaatggtgctgcaaagtgacattctgaccgccatcctgactctttcgccaaaatattttcagctgcaaatatgatgaacacaattatgtaagcacatataaatagacttattgaatgtggcatgaggaaatccatcaagaacagctaacagcggtgacttgctgtagaatttccggtactgtatcttggatctttcttcatctctctcgaccatctcgtaccggattttggttttaggaattagaaattttattgatatatttatttaagaaatgcaaatacatagtaagggtttcttatacgctcaacacatgagcgaaaccctataggaaacatttttgcccttatctgggaaacttcctcccacatattttatggaaaacctcaatttttcccaataaaaaaatcccctggcggaaatctgccttttttttttttt采用BLAST分析方法(AltschulSFetal.，Basiclocalalignmentsearchtool.J.Mol.Biol.，1990，215403-410)發(fā)現(xiàn)側(cè)翼序列16-54與載體左末端匹配，93-110，125-285分別和GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫中的克隆AP004087的22640-22657，22492-22332匹配，同源性高達(dá)100％。根據(jù)插入位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物序列為A(引物)5’CCACTAATCCGTGCAAAGGT3’。B(引物)5’CCCTCAGTATCAGCCACCAC3’。C(引物)5’AATCCAGATCCCCCGAATTA3’，PCR反應(yīng)體系的總體積為20μl，DNA模板1ul(約50ng)、1×Taq酶反應(yīng)緩沖液、25mMMgCL21.2ul、2mMdNTP1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3單位Taq酶，加ddH2O至20μl。反應(yīng)程序?yàn)?4℃變性5min，94℃45s、55℃45s、72℃1min30cycles，72℃延伸5min。PCR結(jié)果，如圖3，其中泳道1，2，3，5，7，9，11，16，19，20，為T-DNA純合；4，12，13，14，15為T-DNA雜合；6，8，10，17，18為T-DNA陰性。與田間表型對照，T-DNA純合植株表型為抽穗遲；T-DNA雜合與T-DNA陰性植株表型為抽穗正常。其中突變株偏多，可能是群體偏小，或者是插秧時(shí)不完全隨機(jī)造成。而到T2代就是3∶1分離。說明該突變表型確實(shí)是T-DNA插入造成的。6.T2代進(jìn)一步做共分離驗(yàn)證為了驗(yàn)證該突變體的遺傳穩(wěn)定性及進(jìn)一步驗(yàn)證共分離情況，又繁殖了一代即T2代(將T1代收獲的種子播種得到T2代)，分別種了突變體，雜合子及正常3種類型，突變單株(即T-DNA純合)下一代不再分離，表型一致都是抽穗遲；雜合單株下一代出現(xiàn)3∶1的表型分離，即正?！贸樗脒t＝3∶1；正常植株下一代沒有出現(xiàn)分離，全部正常。同時(shí)PCR檢測也表明基因型與表現(xiàn)型吻合，如圖5，泳道1，5，8，12，15，17，21，29，31，36，37為T-DNA純合植株；2，4，7，11，13，14，16，19，20，22，25，27，28，30，33，34，35，40為T-DNA雜合單株；3，6，9，10，18，23，24，26，32，38，39為T-DNA陰性單株。與田間表型對照，T-DNA純合植株表型為抽穗遲；T-DNA雜合與T-DNA陰性植株表型為抽穗正常。由此證明，這個(gè)突變體是由于T-DNA插入造成的單位點(diǎn)隱性突變。7.確定突變位點(diǎn)，獲得候選基因，并進(jìn)行功能分析。采用BLAST分析發(fā)現(xiàn)，該突變體T-DNA插入水稻第2染色體，對應(yīng)GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫中的克隆號為AP004087，插入該克隆第22640位堿基旁，分析插入位點(diǎn)附近序列發(fā)現(xiàn)，T-DNA插入一個(gè)假定的分枝酸變位酶基因CM-2(putativechorismatemutase2)的外顯子中，該基因有全長cDNA，在KOME網(wǎng)站(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)對應(yīng)的克隆號AK101220，全長cDNA序列如下cgtgtggaggatcagcagcagcagctttcccttagctcgcgagctcatcagtcatcacagggcggatcgagagatcatcgatgggcgaggcggagctgagcctggcggcggtgcgcgacgcgctggtgcgggaggaggactccatcgtcttcgccctcatcgagcgcgccaggcgcccgcgcaacgcgccggcatacgcggccgccgccgccgccggcggccgatccctcgccgagttcttcgtccgggaagccgaggttctgcacgccaaggccggacaataccaaaagccagaagatgttccattctttccccaagatctcccttcacctctatttcctaccaaagattacccaaaggttttgcactcttttgcatcatcagtcagtgtgaatgatgcaatatggaagatgtatttcaacgagttgcttccactattcactgtggatggagatgatggtaactatgcagaaacagttgcattagattttgcatgtctgaaggccctgtcaagaagaattcatattggtaaatatgttgctgaggtgaagttcaaagatgcttcccaagattatagtccactaatccgtgcaaaggataccaaggctctgatgaatctgctaacattcaaggcggttgaagagaaggtgaaaaggagagtagagaagaaggccaggatatttggtcagaatgtcactttggaggacaatgctgacaagcaagaaggcaatgcaggtgacagtgagtgcaaagttaatcctgaagtgctatctaagctatatgatctgtgggtaatgcctttgacgaaggatgttgaagttgagtatcttctccgccgtcttgactgattcgccaaaatattttcagctgcaaatatgatgaacacaattatgtaagcacatataaatagacttattgaatgtggcatgaggaaatccatcaagaacagctaacagcggtgacttgctgtagaatttccggtactgtatcttggatctttcttcatctccgttttcggagctgagacatatagggcctgtttggtacagctctaactcctaaatttagctccaagagttgggtctggagtggagttgtggagctgcctaaacccagctccacaactctagttcattttgtgagagagctccacccagctccactcccagttttggtggagctgaaactgtttggctgagctccagctccaggaggggtagagctggagctggagctgtgccaaaacaggcccatagattgatggcaatgatctgcaacccaaaaggttcatcctacctaactgtggtggctgatactgagggcctggtgaattcccagcaaagatgctgcaactccagtttctgtaacaatctgtaactcctgttattatatcaccatagttttgtgctacttcttggtagtagcatttctgttc。該基因結(jié)構(gòu)如圖6。其編碼的蛋白與擬南芥的CM-2有50％同源性。分枝酸變位酶CM(Chorismatemutase，EC5.4.99.5)是莽草酸途徑中分枝部位的第一個(gè)酶，當(dāng)代謝終產(chǎn)物苯丙氨酸，酪氨酸過量時(shí)會抑制分枝酸變位酶活性，同時(shí)另一分枝代謝產(chǎn)物色氨酸過量時(shí)會激活分枝酸變位酶活性，如圖7。生物體中許多物質(zhì)都含有苯環(huán)，它們主要來自莽草酸途徑。構(gòu)成蛋白質(zhì)的3種芳香族氨基酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，都是莽草酸途徑的初級代謝產(chǎn)物，同時(shí)這3種芳香族氨基酸還是各種含苯環(huán)的次級代謝物的前體，通過次級代謝可生成如生長素，生物堿，類黃酮等。有些次級代謝產(chǎn)物還是防御反映的信號分子，如創(chuàng)傷，輻射，病源感染等會造成芳香族氨基酸及次級代謝產(chǎn)物的增強(qiáng)(EvelynM.Mobleyetal.，Identification，characterizationandcomparativeanalysisofanovelchorismatemutasegeneinArabidopsisthalianaGene，1999，240(1999)115-123)。在許多真菌和細(xì)菌中都鑒定到分枝酸變位酶活性，但各自在結(jié)構(gòu)和活性上都有很大差異，對應(yīng)的一些基因也已被克隆。在擬南芥中已分離到3種分枝酸變位酶基因CM-1，CM-2，CM-3，它們在結(jié)構(gòu)和活性上有一定的差異(JennyEberhardetal.，CloningandexpressioninyeastofahigherplantchorismatemutaseMolecularcloning，sequencingofthecDNAandcharacterizationoftheArabidopsisthalianaenzymeexpressedinyeast.FEBS，1993，334(2)233-236；JennyEberhardetal.，CytosolicandplastidicchorismatemutaseisozymesfromArabidopsisthalianamolecularcharacterizationandenzymaticproperties.PlantJournal，1996，10(5)815-821；EvelynM.Mobleyetal.，Identification，characterizationandcomparativeanalysisofanovelchorismatemutasegeneinArabidopsisthalianaGene，1999，240(1999)115-123)，之前的這些研究只是集中在對分枝酸變位酶酶學(xué)特性和生化途徑中的作用進(jìn)行分析，甚至對CM-2在生化途徑中的作用也很模糊，更不知其具體的生物學(xué)功能，目前在水稻中還沒有對CM-2具體研究的報(bào)道。實(shí)施例2基因表達(dá)分析本發(fā)明所得的突變體是由T-DNA隨機(jī)插入水稻基因組造成的，該T-DNA上含有EnhancerTrap，其上的報(bào)告基因帶有一個(gè)剪切過的小啟動子，僅含TATAbox和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，不足以啟動報(bào)告基因表達(dá)，而只有借助鄰近的增強(qiáng)子元件才能表達(dá)。同過檢測報(bào)告基因的表達(dá)模式可以，可以判斷該增強(qiáng)子元件所控制基因的表達(dá)模式。對突變體GUS染色結(jié)果，如圖8，在根、莖、葉中全部表達(dá)，這與該基因在擬南芥中的表達(dá)模式相同(JennyEberhardetal.，CytosolicandplastidicchorismatemutaseisozymesfromArabidopsisthaliahamolecularcharacterizationandenzymaticproperties.PlantJournal，1996，10(5)815-821)。這也從另一角度證明了T-DNA是插在該基因上。實(shí)施例3RNAi(RNAinterference)轉(zhuǎn)化驗(yàn)證基因功能在OsCM2基因的第一個(gè)外顯子和最后一個(gè)外顯子設(shè)計(jì)RNAi片段。引物序列1588Si15’ggggaccactttgtacaagaaagctgggtAAACGGAGATGAAGAAAGATCC3’，1588Ai15’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctGTCACTTTGGAGGACAATGCTG3’，1588Si25’ggggaccactttgtacaagaaagctgggtCTTACCTTGGCGTGCAGAAC3’，1588Ai25’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctGAGCTGTGGAGGATCAGCAG3’。PCR反應(yīng)體系的總體積為20μl，水稻基因組DNA模板1ul(約50ng)、1×Taq酶反應(yīng)緩沖液、25mMMgCL21.2ul、2mMdNTP1.5ul、10uM引物0.2ul、50％甘油2ul、0.3單位rTaq酶(Takara公司)，加ddH2O至20μl。反應(yīng)程序?yàn)?4℃變性3min，94℃50s、55℃80s、72℃90s35cycles，72℃延伸5min，2個(gè)片段各擴(kuò)增10管，分別收集PCR產(chǎn)物于2個(gè)1.5ml離心管純化，加等體積24∶1氯仿異戊醇，輕搖5分鐘，12000rpm離心15分鐘，吸上清，加2倍體積95％乙醇，1/10體積3M醋酸鈉(PH5.2)，-20℃放置30分鐘，12000rpm離心20分鐘，棄上清，加500ul75％乙醇放置5min，12000rpm離心5分鐘，棄上清，晾干，每管加10ulddH2O溶解。把純化的2個(gè)DNA片段分別連接到RNAi載體pHellsgate8上，如圖9，連接體系為gatwayBPclonase1ul，pHellsgate8載體0.5ul，BPreactionbuffer1ul，PCR純化產(chǎn)物2.5ul，25℃反應(yīng)10小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束加0.5ulproteinaseK，37℃，10分鐘。取1ul電轉(zhuǎn)大腸桿菌DH10B，挑單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)抽質(zhì)粒，PCR驗(yàn)證是否含有目標(biāo)片段，把構(gòu)建好的載體電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌EHA105，構(gòu)建好的載體分別命名為pH1588i1，pH1588i2，采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Hiei等，Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA，PlantJournal1994，6271-282)，轉(zhuǎn)到正常的中花11水稻品種中。RNAi結(jié)果發(fā)現(xiàn)約有1/5的轉(zhuǎn)化子抽穗遲約17-22天，其它抽穗時(shí)間介于突變體與野生型植株之間，具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1、表2。表型照片如圖10。說明OsCM2基因具有控制水稻抽穗期的功能。表1RNAi轉(zhuǎn)化植株的抽穗期統(tǒng)計(jì)表表2RNAi轉(zhuǎn)化植株遲抽穗的天數(shù)實(shí)施例4互補(bǔ)驗(yàn)證1.互補(bǔ)載體的構(gòu)建所用載體是pCAMBIA2301。日本晴BAC克隆0SJNBa0037D03用BamH1和Pst1可以酶切出含有OsCM2基因的約11.5KB的片段，接種BAC克隆0SJNBa0037D03于含氯霉素的250ml的LB，37℃，210轉(zhuǎn)/分鐘搖床，過夜。用1.5ml離心管收集菌液2次，約83管，抽質(zhì)粒。最后每管加20ulddH2O溶解。收集質(zhì)粒溶液，分3管純化加等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，輕搖5分鐘，12000rpm離心15分鐘，吸上清，加2倍體積95％乙醇，1/10體積3M醋酸鈉(PH5.2)，-20℃冷凍30分鐘，再12000rpm離心20分鐘，棄上清，75％乙醇浸洗，涼干，每管加25ulddH2O溶解。收集質(zhì)粒溶液酶切，體系總體積100ul，質(zhì)粒75ul，BamH130U，Pst130U，10XKbuffer10ul，ddH2O11ul，37℃酶切5小時(shí)。1％瓊脂糖TAE膠電泳，電壓40V，24小時(shí)。挖膠，透析袋回收，步驟見科學(xué)出版社《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第二版，321-322頁。回收液加等體積24∶1氯仿異戊醇，輕搖5分鐘，12000rpm離心15分鐘，吸上清，加2倍體積95％乙醇，1/10體積3M醋酸鈉(PH5.2)，-20℃冷凍30分鐘，再12000rpm離心20分鐘，棄上清，75％乙醇浸洗，晾干，加10ulddH2O溶解。取1ul測濃度，剩下9ul全部用于連接反應(yīng)，載體0.5ul，2UT4ligase，5Xbuffer3ul，總15ul體積，連接24小時(shí)。取0.5ul連接產(chǎn)物，電壓18000V，電轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH10B，加800ulLB，復(fù)蘇45分鐘，取200ul涂于含卡那霉素、X-gal、IPTG的LA平板，37℃，過夜。挑單克隆做細(xì)菌PCR，先在0.2mlPCR離心管加10ulddH2O，用20ul槍頭挑菌斑，在離心管中攪拌，取出槍頭在加有卡那霉素的LA平板上畫線作為備份。引物A5’CCACTAATCCGTGCAAAGGT3’，引物B5’CCCTCAGTATCAGCCACCAC3’，PCR反應(yīng)體系的總體積為20μl，1×Taq酶反應(yīng)緩沖液、25mMMgCL21.2ul、2mMdNTP1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3UTaq酶。反應(yīng)程序?yàn)?4℃變性5min，94℃45s、55℃45s、72℃1min30cycles，72℃延伸5min。跑膠觀察，挑陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，抽質(zhì)粒，再做PCR和酶切驗(yàn)證。把構(gòu)建好的載體(命名為pC1588c)電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌EHA105，抽質(zhì)粒，PCR驗(yàn)證，取750ul農(nóng)桿菌菌液加等體積的50％甘油混勻，-70℃保存。2.遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將互補(bǔ)載體導(dǎo)入抽穗遲突變體。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟和試劑如下(1)試劑和溶液縮寫6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-芐基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧芐青霉素)；KT(Kinetin，激動素)；NAA(Napthaleneaceticacid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-aceticacid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(CaseinEnzymaticHydrolysate，水解酪蛋白)；G418(卡拉霉素)；DMSO(DimethylSulfoxide，二甲基亞砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS小量成分溶液)(2)組織培養(yǎng)的溶液配方1)N6max母液[10倍濃縮液(10X)]硝酸鉀(KNO3)28.3g磷酸二氫鉀(KH2PO4)4.0g硫酸銨((NH4)2SO4)4.63g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)1.85g氯化鈣(CaCl2·2H2O)1.66g逐一溶解，然后20-25℃下定容至1000ml。2)N6mix母液[100倍濃縮液(100X)]碘化鉀(KI)0.08g硼酸(H3BO3)0.16g硫酸錳(MnSO4·4H2O)0.44g硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)0.15g20-25℃下下溶解并定容至1000ml。3)Fe2EDTA貯存液(100X)在一個(gè)大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeSO4·7H2O)2.78g在另一個(gè)大三角瓶中加入300ml蒸餾水并加熱至70℃，然后加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O)3.73g在它們都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小時(shí)，定容至1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?)維生素貯存液(100X)煙酸(Nicotinicacid)0.1g維生素B1(ThiamineHCl)0.1g維生素B6(PyridoxineHCl)0.1g甘氨酸(Glycine)0.2g肌醇(Inositol)10g加水定容至1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?)MSmax母液(10X)硝酸銨(NH4NO3)16.5g硝酸鉀19.0g磷酸二氫鉀1.7g硫酸鎂3.7g氯化鈣4.4g20-25℃下溶解并定容至1000ml。6)MSmix母液(100X)碘化鉀0.083g硼酸0.62g硫酸錳0.86g鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)0.025g硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.0025g20-25℃下溶解并定容至1000ml。7)2，4-D貯存液(1mg/ml)2，4-D100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，20-25℃下保存。8)6-BA貯存液(1mg/ml)6-BA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，20-25℃下保存。9)NAA貯存液(1mg/ml)NAA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4℃保存?zhèn)溆谩?0)IAA貯存液(1mg/ml)IAA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4℃保存?zhèn)溆谩?1)葡萄糖貯存液(0.5g/ml)葡萄糖125g蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?2)AS貯存液AS0.392gDMSO10ml分裝至1.5ml離心管內(nèi)，4℃保存?zhèn)溆谩?3)1N氫氧化鉀貯存液氫氧化鉀5.6g蒸餾水溶解定容至100ml，20-25℃下保存?zhèn)溆谩?4)KT貯存液(1mg/ml)KT100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，在20-25℃下保存。(3)培養(yǎng)基配方1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml2，4-D貯存液2.5ml脯氨酸(Proline)0.3gCH0.6g蔗糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸(100℃)并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。2)繼代培養(yǎng)基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml2，4-D貯存液2.0ml脯氨酸0.5gCH0.6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸(100℃)并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。3)預(yù)培養(yǎng)基N6max母液(10X)12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.75mlCH0.15g蔗糖5g瓊脂粉(Agarose)1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250μlAS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。4)共培養(yǎng)基N6max母液(10X)12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.75mlCH0.2g蔗糖5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250μlAS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。5)懸浮培養(yǎng)基N6max母液(10X)5mlN6mix母液(100X)0.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)0.5ml維生素貯存液(100X)1ml2，4-D貯存液0.2mlCH0.08g蔗糖2g加蒸餾水至100ml，調(diào)節(jié)pH值到5.4，分裝到兩個(gè)100ml的三角瓶中，封口滅菌。使用前加入1ml葡萄糖貯存液和100μlAS貯存液。6)選擇培養(yǎng)基N6max母液(10X)25mlN6mix母液(100X)2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.625mlCH0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，調(diào)節(jié)pH值到6.0，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250μl50mg/ml的抗生素G-418(Sulfate)和400ppm頭孢霉素，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。7)預(yù)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X)25mlN6mix母液(100X)2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml6-BA貯存液0.5mlKT貯存液0.5mlNAA貯存液50μlIAA貯存液50μlCH0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250μl50mg/ml的抗生素G-418(Sulfate)和400ppm頭孢霉素，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。8)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml6-BA貯存液2mlKT貯存液2mlNAA貯存液0.2mlIAA貯存液0.2mlCH1g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6.0。煮沸(100℃)并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。9)生根培養(yǎng)基MSmax母液(10X)50mlMSmix母液(100X)5mlFe2+EDTA貯存液(100X)5ml維生素貯存液(100X)5ml蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.8。煮沸(100℃)并定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。10)LA培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基不含瓊脂粉)蛋白胨2.5g酵母粉1.25g氯化鈉2.5g瓊脂粉3.2g蒸餾水溶解定容至250ml，裝于500ml三角瓶，滅菌后20-25℃保存?zhèn)溆谩?4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟4.1愈傷誘導(dǎo)(1)將成熟的水稻種子去殼，然后依次用70％的乙醇處理1分鐘，0.15％氯化汞(HgCl2)15分鐘；(2)滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(4)置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度24-26℃。4.2愈傷繼代挑選亮黃色、緊實(shí)且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度24-26℃。4.3預(yù)培養(yǎng)挑選緊實(shí)且相對干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度24-26℃。4.4農(nóng)桿菌培養(yǎng)(1)在帶有對應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105兩天，溫度28℃；(2)將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28℃搖床上培養(yǎng)2-3小時(shí)。4.5農(nóng)桿菌侵染(1)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；(2)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD6000.8-1.0；(3)將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20℃。4.6愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)(1)滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；(2)浸泡在含400ppm羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；(3)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇2-3次，每次2周。(G418篩選濃度為50μm)4.7分化(1)將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7周；(2)轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)(20001x)，溫度26℃。4.8生根(1)拔出分化好的幼苗，剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根；(2)然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26℃。4.9移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最初的幾天保持水分濕潤。最后獲得互補(bǔ)轉(zhuǎn)化的組培苗100株，作為對照的由突變體愈傷不經(jīng)過轉(zhuǎn)化直接分化得到30株苗子，以及正常中花11愈傷分化苗子30株，都種于大田，結(jié)果沒經(jīng)過互補(bǔ)的突變苗全部表現(xiàn)抽穗遲，互補(bǔ)的轉(zhuǎn)化苗約有50％恢復(fù)正常，抽穗期統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。說明OsCM2基因具有控制水稻抽穗期的功能，通過基因工程技術(shù)提高或減弱OsCM2基因的表達(dá)量能夠控制植物抽穗期，從而提高品種的地區(qū)與季節(jié)適應(yīng)性。表3互補(bǔ)轉(zhuǎn)化植株的抽穗期統(tǒng)計(jì)結(jié)果SEQ.ID.No.1<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種控制水稻抽穗期基因及應(yīng)用<130>Patent<140>1<141>2005-10-25<160>2<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>2881<212>DNA<213>Oryzasativa<220><221>CDS<222>(81)..(272)<223><220><221>CDS<222>(1144)..(1230)<223><220><221>CDS<222>(1318)..(1461)<223><220><221>CDS<222>(1668)..(1760)<223><220><221>CDS<222>(2044)..(2292)<223><400>1cgtgtggaggatcagcagcagcagctttcccttagctcgcgagctcatcagtcatcacag60ggcggatcgagagatcatcgatgggcgaggcggagctgagcctggcggcggtg113MetGlyGluAlaGluLeuSerLeuAlaAlaVal1510cgcgacgcgctggtgcgggaggaggactccatcgtcttcgccctcatc161ArgAspAlaLeuValArgGluGluAspSerIleValPheAlaLeuIle152025gagcgcgccaggcgcccgcgcaacgcgccggcatacgcggccgccgcc209GluArgAlaArgArgProArgAsnAlaProAlaTyrAlaAlaAlaAla303540gccgccggcggccgatccctcgccgagttcttcgtccgggaagccgag257AlaAlaGlyGlyArgSerLeuAlaGluPhePheValArgGluAlaGlu455055gttctgcacgccaaggtaagcccgccacctctcgttgttcttgagtcttgactcc312ValLeuHisAlaLys60ccattgattcatgattcagtatcctgcccaactagatccccttacgttttctttaccaaa372atcgatcctttttataccatgttgtagtgtagcatagccatgatgaacttgtacaggaag432atttttttttgcctggtgaaatttctgaggccaatctttctattcagtcaccttagtgat492tagtaaactcatggctgaggaattcgtatgtgaaattcagtcacacagatcttacaggct552aggcttgtatttcgttaccacattgtttttttggcagtagtttatctaccttggtctcca612ctgtaccatgatgaattgaaagatagcatcggagggtaagatgctgatatgtccattctg672gtaatcatgcggcattgcggcttatgttggcttgacgaattcattttgagtacctcgaac732ggacacacagtatcggatgagatttatattaacaaaagaatggctatgctacatgtgtag792gtaaatcatgtgttttaaaggcacttccatttacggatcattcaacaagtgaaagtgatc852agaagggaaaaatagtgacgatggagaaaaaaagtttgaaccgtaccatcccctattaat912aatagaaaacataaatgatttactattatttttcttgtactttactaaatgggaaatttt972gttatgctatttttcaacttgtatatcttatccagcatcctattaaaactgtcaaaatca1032atcaacataaaatacagcattggtatagctatgttgacagtcagatattagcatattacc1092atttccaagcatccctctacagaatctaattacatctgtgaaatctgataggccgga1149AlaGly65caataccaaaagccagaagatgttccattctttccccaagatctccct1197GlnTyrGlnLysProGluAspValProPhePheProGlnAspLeuPro707580tcacctctatttcctaccaaagattacccaaaggtaaatactaagctttacaa1250SerProLeuPheProThrLysAspTyrProLys8590tattagttacaatgaactgatgactaatgattgttgaggttctgagtttttattgctttg1310ttgttaggttttgcactcttttgcatcatcagtcagtgtgaatgatgca1359ValLeuHisSerPheAlaSerSerValSerValAsnAspAla95100105atatggaagatgtatttcaacgagttgcttccactattcactgtggat1407IleTrpLysMetTyrPheAsnGluLeuLeuProLeuPheThrValAsp110115120ggagatgatggtaactatgcagaaacagttgcattagattttgcatgt1455GlyAspAspGlyAsnTyrAlaGluThrValAlaLeuAspPheAlaCys125130135ctgaaggtacatgttctgtgtttattgtttcttttagatattccatcaatttggtc1511LeuLys140gttctttaaaaaaaacataaatctagttgctactaggatatgttctttcaatctttcagc1571acgcgaaagcaaaatttgcacaaattattgcaaattaatggtaaattgtttccaatcagt1631gtatatctgtgaaatgtattgatcatttctttgtaggccctgtcaagaagaatt1685AlaLeuSerArgArgIle145catattggtaaatatgttgctgaggtgaagttcaaagatgcttcccaa1733HisIleGlyLysTyrValAlaGluValLysPheLysAspAlaSerGln150155160gattatagtccactaatccgtgcaaaggttgtttttagttaacatct1780AspTyrSerProLeuIleArgAlaLys165170catactcactacaccaaattttcttaaacatcttgcaataaacggttgatttatagaaat1840tgtgaatactccttggtcttattctgattagcttcattcttatctagcttctacttagtt1900tcatgtgttagatgtttaactcctgcatacactccatttcttggtaggaactgcctgcta1960ggctgctagcattgggcctttaaatctttaatttattttttgaagctgatctttaattta2020ttatatccctctcttttcaacaggataccaaggctctgatgaatctgctaaca2073AspThrLysAlaLeuMetAsnLeuLeuThr175180ttcaaggcggttgaagagaaggtgaaaaggagagtagagaagaaggcc2121PheLysAlaValGluGluLysValLysArgArgValGluLysLysAla185190195aggatatttggtcagaatgtcactttggaggacaatgctgacaagcaa2169ArgIlePheGlyGlnAsnValThrLeuGluAspAsnAlaAspLysGln200205210gaaggcaatgcaggtgacagtgagtgcaaagttaatcctgaagtgcta2217GluGlyAsnAlaGlyAspSerGluCysLysValAsnProGluValLeu215220225230tctaagctatatgatctgtgggtaatgcctttgacgaaggatgttgaa2265SerLysLeuTyrAspLeuTrpValMetProLeuThrLysAspValGlu235240245gttgagtatcttctccgccgtcttgactgattcgccaaaatattttc2312ValGluTyrLeuLeuArgArgLeuAsp250255agctgcaaatatgatgaacacaattatgtaagcacatataaatagacttattgaatgtgg2372catgaggaaatccatcaagaacagctaacagcggtgacttgctgtagaatttccggtact2432gtatcttggatctttcttcatctccgttttcggagctgagacatatagggcctgtttggt2492acagctctaactcctaaatttagctccaagagttgggtctggagtggagttgtggagctg2552cctaaacccagctccacaactctagttcattttgtgagagagctccacccagctccactc2612ccagttttggtggagctgaaactgtttggctgagctccagctccaggaggggtagagctg2672gagctggagctgtgccaaacaggcccatagattgatggcaatgatctgcaacccaaaagg2732ttcatcctacctaactgtggtggctgatactgagggcctggtgaattcccagcaaagatg2792ctgcaactccagtttctgtaacaatctgtaactcctgttattatatcaccatagttttgt2852gctacttcttggtagtagcatttctgttc2881SEQIDNo.2<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種控制水稻抽穗期基因及應(yīng)用<130>Patent<141>2005-10-25<170>Patentlnversion3.1<210>2<211>255<212>PRT<213>Oryzasativa<400>2MetGlyGluAlaGluLeuSerLeuAlaAlaValArgAspAlaLeuVal151015ArgGluGluAspSerIleValPheAlaLeuIleGluArgAlaArgArg202530ProArgAsnAlaProAlaTyrAlaAlaAlaAlaAlaAlaGlyGlyArg354045SerLeuAlaGluPhePheValArgGluAlaGluValLeuHisAlaLys505560AlaGlyGlnTyrGlnLysProGluAspValProPhePheProGlnAsp65707580LeuProSerProLeuPheProThrLysAspTyrProLysValLeuHis859095SerPheAlaSerSerValSerValAsnAspAlaIleTrpLysMetTyr100105110PheAsnGluLeuLeuProLeuPheThrValAspGlyAspAspGlyAsn115120125TyrAlaGluThrValAlaLeuAspPheAlaCysLeuLysAlaLeuSer130135140ArgArgIleHisIleGlyLysTyrValAlaGluValLysPheLysAsp145150155160AlaSerGlnAspTyrSerProLeuIleArgAlaLysAspThrLysAla165170175LeuMetAsnLeuLeuThrPheLysAlaValGluGluLysValLysArg180185190ArgValGluLysLysAlaArgIlePheGlyGlnAsnValThrLeuGlu195200205AspAsnAlaAspLysGlnGluGlyAsnAlaGlyAspSerGluCysLys210215220ValAsnProGluValLeuSerLysLeuTyrAspLeuTrpValMetPro225230235240LeuThrLysAspValGluValGluTyrLeuLeuArgArgLeuAsp245250255權(quán)利要求1.一種分離的基因，其具有SEQIDNo.1所示核苷酸序列至少50％同源性的序列。2.一種分離的蛋白質(zhì)，其具有與SEQIDNo.2所示氨基酸序列至少50％同源性的序列。3.一種控制水稻抽穗期基因在控制水稻抽穗期中的應(yīng)用。專利摘要本發(fā)明公開了一種控制水稻抽穗期基因及應(yīng)用，涉及一種從水稻突變體中鑒定的控制抽穗期的基因OsCM2的分離克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。OsCM2基因編碼的蛋白與擬南芥CM－2基因編碼的蛋白有50％的同源性，OsCM2基因具有控制水稻抽穗期的功能，通過基因工程技術(shù)提高或減弱OsCM2基因的表達(dá)量能夠控制植物抽穗期，從而提高品種的地區(qū)與季節(jié)適應(yīng)性。文檔編號C07K14/415GK1995357SQ200610018104公開日2007年7月11日申請日期2006年1月5日發(fā)明者張啟發(fā),陳志輝,吳昌銀申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan