專利名稱:一種培養(yǎng)血管內皮細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及組織工程學中獲得種子細胞的方法。
背景技術：
血管疾病是臨床常見的疾病之一。隨著人口老齡化進程的加速，膳食習慣的改變，動脈粥樣硬化的發(fā)病率進一步增高并威脅越來越多人的健康，有統(tǒng)計在60歲以上人群中，動脈粥樣硬化的發(fā)病率將為80％，而由此引起的肢體動脈缺血性疾病的發(fā)病率亦高達7-20％；同時，糖尿病與肥胖病的發(fā)病率也在逐年增高，而與動脈缺血性疾病相關的高危因素居高不下。僅在美國，每年接受血管移植的患者就超過一百萬之多，但長期以來，缺乏理想的血管移植物嚴重制約了上述疾病的治療效果。
臨床已經應用的血管移植材料有自體血管、異體血管、和人工高分子材料管道(如滌綸Dacron、膨化聚四氟乙烯ePTEF)，盡管能改善和延長患者的生命，但均未達到理想的程度。目前認為Dacron、ePTEF在臨床大口徑血管移植中效果可靠，有肯定的遠期通暢率，但移植后失敗率高。自體血管雖然有較好的遠期通暢率，卻存在來源不足的問題。隨著近年來組織工程學的發(fā)展，構建組織工程人工血管日益受到重視。
組織工程化血管是由細胞材料復合物構建的血管替代品，在生物材料降解后所形成的血管由活細胞所構成，具有與正常生理性血管相似的特性，可以隨機體的生長而生長。目前，組織工程化血管的構建主要是應用自體組織的同源細胞作為種子細胞來源，存在著來源有限、易老化、不能大規(guī)模擴增以及取材對機體造成創(chuàng)傷等問題，種子細胞來源困難已成為阻礙組織工程進一步發(fā)展的瓶頸問題。
因此，本領域迫切需要一種將胚胎干細胞(ES)培養(yǎng)為血管內皮細胞的方法，為組織工程化血管提供新的種子細胞；也迫切需要一種理想的血管移植物。

發(fā)明內容本發(fā)明的目的是建立一種將hES培養(yǎng)成為血管內皮細胞的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種血管內皮細胞及其用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種血管內皮細胞的培養(yǎng)方法，包括步驟a.在基本上不含有動物血清和含維甲酸的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)人胚胎干細胞，形成擬胚體；b.用含β1-轉化生長因子的培養(yǎng)液將擬胚體培養(yǎng)成具有血管樣結構的血管內皮細胞。
在另一優(yōu)選例中，步驟a中所述培養(yǎng)基基本上不含動物血清是指哺乳動物血清的體積濃度為0-2％，較佳地0-1％，更佳地0-0.5％，最佳地0％。
在另一優(yōu)選例中，步驟a中所用的維甲酸濃度為0.1-3×10-9mol/L。
在另一優(yōu)選例中，步驟a和b中的培養(yǎng)是在37±2℃，和5±1％CO2條件下培養(yǎng)1-7天。
在另一優(yōu)選例中，步驟b中所用的β1-轉化生長因子濃度為1-5ng/ml。
在另一優(yōu)選例中，在步驟a和b之間還包括步驟將擬胚體進行貼壁培養(yǎng)。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用本發(fā)明上述方法制得的血管內皮細胞。
在本發(fā)明的第三方面，提供了用上述方法得到的血管內皮細胞的用途，它們用作構建組織工程化血管的種子細胞。
或者，所述的血管內皮細胞被用于制備血管移植物。本發(fā)明所述的移植物用于治療血管性疾病。
在另一優(yōu)選例中，步驟b中的培養(yǎng)條件為37±2℃，5±2％CO2，培養(yǎng)1-7天上述的培養(yǎng)方法中，步驟c中所用的β1-轉化生長因子濃度為1-5ng/ml。
在另一優(yōu)選例中，步驟c中先將擬胚體貼壁培養(yǎng)。
由此，本發(fā)明提供了一種將hES培養(yǎng)成為血管內皮細胞的方法，并且提供了一種血管移植物，并可將血管內皮細胞用于治療血管性疾病。
圖1顯示了hES在胎鼠成纖維細胞(MEF)細胞的飼養(yǎng)層上的生長，放大60倍。
圖2顯示了所形成的擬胚體(EB，embryonic body)，左圖為第2天放大100倍，右圖為第5天放大100倍。
圖3顯示了EB周圍的上皮樣和圓形細胞，放大100倍。
圖4顯示了EB貼壁第3天，血管樣結構的出現(xiàn)，放大100倍。
圖5顯示了EB貼壁第4、5天，血管樣結構漸成交叉網狀，a1、a2為第4天，b1、b2為第5天；a1、b1放大40倍、a2、b2放大100倍。
圖6顯示了管道由圓形細胞組成。
圖7顯示了內皮樣細胞圍成的管腔。
圖8顯示了內皮樣細胞緊密連接。
圖9顯示了細胞間緊密連接。
圖10顯示了正常人毛細血管。
圖11顯示了抗vWF抗體免疫熒光呈陽性，放大100倍，a為vWF抗體免疫熒光陽性、b為陽性對照，c為陰性對照。
圖12顯示了抗Flk-1抗體免疫熒光呈陽性，放大100倍，a為Flk-1抗體免疫熒光陽性、b為陽性對照，c為陰性對照。
圖13顯示了抗CD31抗體免疫熒光呈陽性，放大100倍，a為CD31抗體免疫熒光陽性、b為陽性對照，c為陰性對照。
圖14顯示了Dil-Ac-LDL攝取實驗陽性，放大100倍，右圖為陰性對照。
具體實施方式本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)，在基本上不含動物血清和含RA培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚胎干細胞，然后在含TGF-β1的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，可形成具有血管樣結構的血管內皮細胞。在本發(fā)明中，盡管基本上不含動物血清(如FBS)，然后通過低濃度RA和TGF-β1協(xié)同作用，足以誘導人ES細胞分化為具有血管樣結構的血管內皮細胞。該方法為研究胚胎時期體內的血管發(fā)生及其機制建立了一個良好的模型，且為組織工程化血管提供新的種子細胞。
本發(fā)明所述的血管內皮細胞的培養(yǎng)方法包括步驟a.在基本上不含有動物血清和含維甲酸的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)人胚胎干細胞，形成擬胚體；b.用含β1-轉化生長因子的培養(yǎng)液將擬胚體培養(yǎng)成具有血管樣結構的血管內皮細胞。
在本發(fā)明中，使用的培養(yǎng)基是基本上不含動物血清(如哺乳動物胎兒血清)的培養(yǎng)基。
當然，在培養(yǎng)hES的培養(yǎng)基中可以加入一些已知生長因子。此外，所述生長因子可來源于成纖維細胞飼養(yǎng)層。雖然所述生長因子較佳是成纖維細胞生長因子，但是它也可以是其它物質，如設計用來激活成纖維細胞生長因子受體的某些合成的小肽(如由重組DNA變體或突變體產生的肽)。
本發(fā)明可提供采用上述步驟a衍生獲得的血管內皮細胞系?！把苌痹诖耸褂闷鋸V義含義，覆蓋了直接或間接衍生的細胞系。
本發(fā)明所述的hES的建立可采用本領域所知的方法制備或直接購買獲得(例如購自ATCC等保藏中心)。
本發(fā)明中RA和TGF-β1可誘導人ES細胞分化為內皮細胞及血管樣結構。TGF-β1為胚胎干細胞向內皮細胞定向誘導分化的有效刺激因子。本發(fā)明先由未分化的胚胎干細胞分化成為血管細胞(angioblast)，再形成內皮細胞，彼此組成管道狀結構。在誘導環(huán)境持續(xù)存在的情況下。血管形成(vasculogenesis)和血管新生或芽殖(angiogenesis)先后或同時存在，這一現(xiàn)象與胚胎發(fā)育中血管形成過程相似。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)血管內皮細胞的方法中，在培養(yǎng)EB時使用RA，所述的RA為低濃度，是0.1-3.0×10-9mol/L，優(yōu)選0.5-1.5×10-9mol/L，更優(yōu)選1.0×10-9mol/L。
轉化生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)是由112個氨基酸組成的多肽為亞單位，并通過二硫鍵相連的雙聚體分子。近年研究發(fā)現(xiàn)，有不少蛋白分子或基因的結構和功能與TGF密切相關，組成擁有20余個成員的TGF-β家族。TGF-β家族有很多同工異構體，其中以TGF-β1研究最多，屬于具有多種生理功能的多肽生長因子，參與調節(jié)細胞的生長、分化和免疫反應。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法中，優(yōu)選使用TGF-β1，其濃度為1-5ng/ml，更優(yōu)選3ng/ml。
本發(fā)明所述的EB培養(yǎng)的一個優(yōu)選例是取生長良好的hES細胞，機械法分割成小塊，接種到預先鋪過1％瓊脂的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)液敲除(knock-out)DMEM，去除bFGF，加RA至終濃度為1×10-9mol/L，37℃、5％CO2培養(yǎng)3-5天，收集生長較好的EB，均等地移植到預先用0.1％明膠鋪過的培養(yǎng)皿中，加含3ng/mlTGF-β1的無血清DMEM，每隔兩天換液培養(yǎng)。
在本發(fā)明的另一個方面是用上述的培養(yǎng)方法所獲得的血管內皮細胞，所述的血管內皮細胞可以作為組織工程化血管的種子細胞；可以制備血管移植物；也可用于治療血管性疾病，治療中可直接注入所述的血管內皮細胞，或含有上述血管內皮細胞的組合物。
所述的血管移植物包括(a)藥學上可接受的生物可降解材料；和(b)用上述的培養(yǎng)方法所獲得的血管內皮細胞。所述的藥學上可接受的生物可降解材料包括(但并不限于)(i)可降解性合成高分子材料，例如聚α-羥基酸(如聚乳酸PLA、聚羥基乙酸PGA、聚羥基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚對二氧六環(huán)酮(polydioxanone)等；(ii)天然可降解材料，例如膠原(collagen)、明膠(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、殼聚糖(chitosan)、甲殼素(chitin)、海藻酸鹽、藻酸鈣凝膠等；各種脫細胞基質；(iii)可注射性材料，如Pluronic(一種市售的聚環(huán)氧乙丙烯商品)、藻酸鈣凝膠等；(iv)上述材料的混合物或復合材料，尤其是高分子材料與天然材料的復合材料，以及固體材料與可注射性材料的復合材料。
本發(fā)明所用術語von Willebrand因子(vWF)是存在于血漿中的大分子糖蛋白，在內皮細胞內質網中合成的vWF單體分子量為260KD，在高爾基復合體中加工后降解為230KD。由這些單體聚合形成多聚體主義到W-P小體儲存，最后分泌到細胞外。它與凝血因子VIII結合后，以復合物的形式存在于循環(huán)血液中。vWF不僅是因子VIII的載體，而且在血小板黏附于內皮下組織的過程中也起重要的作用。vWF主要由內皮細胞合成，因此vWF被作為鑒定內皮細胞的特異性標記。
本發(fā)明所用術語CD31是一種相對分子質量為110kD的糖基化跨膜糖蛋白，出現(xiàn)在人類造血祖細胞和血管內皮細胞上，CD31內皮細胞抗原在毛細血管、小血管內皮細胞呈穩(wěn)定強陽性，被認為是目前血管內皮細胞的最可靠標記。
本發(fā)明所用術語Flk-1是血管內皮生長因子(VEGF)的酪氨酸激酶受體，VEGF酪氨酸激酶受體分為兩類，VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-1(Flk-1)，大多分布在內皮細胞的表面。VEGF與受體結合后，受體的酪氨酸激酶磷酸化，通過細胞漿內信號傳導鏈，引起細胞核分裂，血管內皮細胞增殖、移行，血管新生。
Yamaguchi等用RT-PCR的方法篩選出在小鼠胚胎干細胞的受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTKs)，這些酶可能在小鼠早期發(fā)育中涉及到細胞系的方向和分化。Flk-1是flt相關的基因，用原位雜交發(fā)現(xiàn)在胚胎原條期(primitive streak stage)時Flk-1在近外側中胚層表達，其組織將向心臟衍生；在頭褶(head fold)期時，F(xiàn)lk-1表達明確定于原始心內膜以及內臟卵黃囊(visceral yolk sac)和尿囊(allantois)；然后是在胚胎和胚胎外的習慣內皮表達；在早期器官形成時期，flk-1在血管豐富的組織首先表達，如腦、肝臟、肺和胎盤(placente)。由于Flk-1在早期中胚層細胞表達，所以它是內皮前體細胞的標志。
本發(fā)明所用術語1’二(十八烷基)-3，3’，3’，3’-四甲基吲哚羰基花青高氯酸鹽(1，1’-dioctadecyl-3，3，3’，3’-tetramethylindocarbocyanineperchlorate，DiI)是一種親脂性碳花青染料，容易嵌進生物質膜內并在膜內做定向擴散運動從而標記整個細胞。熒光染料DiI標記的低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein，LDL)，即Dil-LDL被廣泛應用于內皮細胞的鑒定。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于
1.本發(fā)明提供用于hES的培養(yǎng)條件，其中，所述條件變化少，并使得形成血管內皮細胞的效率更高；2.發(fā)明的培養(yǎng)體系作用于人ES細胞，可在體外模擬人胚胎時期血管形成的演變過程；3.本發(fā)明用hES培養(yǎng)血管內皮細胞；4.該培養(yǎng)方法重復性高。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計。
實施例1用人胚胎干細胞培養(yǎng)血管內皮細胞a.將人胚胎干細胞(ES細胞)(購自上海組織工程研究與開發(fā)中心，上海，中國)，接種到預先鋪過1％瓊脂的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)液為knockout-DMEM(購自Gibco公司)，其中加入20％SR(購自Gibco公司)，1％非必需氨基酸(購自Gibco公司)，1mML-glutamine(購自Sigma公司)，0.1mMβ-mercaptoethanol(購自Sigma公司)，并加RA(購自Sigma公司)至終濃度為1×10-9mol/L。在37℃、5％CO2培養(yǎng)3-5天，收集生長較好的擬胚體(EB)；b.將步驟a中收集的EB均等地移植到預先用0.1％明膠鋪過的培養(yǎng)皿中，加含3ng/mlTGF-β1(購自R&D公司)的無血清DMEM(即用TGF-β1替換RA，其他成分同步驟a)，每隔兩天換液，繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察照相，并做相關檢測。
實施例2檢測一、倒置相差顯微鏡觀察體外誘導hES細胞定向分化時，每天在熒光倒置相差顯微鏡(購自Zeiss公司)下觀察、記錄EB的形成，及血管內皮細胞的分化過程。
二、電鏡檢測1.掃描電鏡檢測取誘導后分化出的上皮樣和圓形細胞及血管樣結構，以2％戊二醛固定，PBS漂洗，1％鋨酸固定，PBS漂洗，梯度酒精脫水，醋酸正戊酯置換，CO2臨界點干燥，離子噴射儀噴金，掃描電鏡觀察。
2.透射電鏡檢測取誘導后分化出的上皮樣和圓形細胞及血管樣結構，2％戊二醛固定24小時，收集標本，1％鋨酸后固定1小時，梯度酒精脫水，1∶1丙酮包埋液滲透，EPON包埋，常規(guī)超薄切片，透射電鏡(JEM-1200EX)觀察細胞與血管的超微結構。
三、免疫熒光檢測將EB放置在0.1％明膠包被的蓋玻片上貼壁，按上述條件進行誘導分化。然后將EB爬片分實驗組(滴加一抗)、空白對照組(未加一抗)；并以小鼠成纖維細胞作陰性對照組。具體步驟如下1.EB爬片置PBS(購自Hyclone公司)中洗滌，2min×5次；2.4％多聚甲醛固定30min；3.PBS漂洗2min×5次；4.0.25％Triton-100，5％DMSO-PBS作用10min；5.PBS漂洗5min×3次；6.1.5％H2O2-PBS，37℃，15min，以阻斷內源性過氧化物酶；7.PBS漂洗3min×3次；8.滴加綿羊血清(10％血清-PBS)，置濕盒內，37℃，45min；9.棄去血清，實驗組與陰性對照組細胞爬片滴加一抗(兔抗人VIII因子抗體(購自Santcruz公司)(1∶100)和鼠抗人CD31單抗(購自Santcruz公司)(1∶50)，空白組滴加PBS；三組爬片置濕盒內37℃反應45分鐘；10.PBS漂洗5min×3次；11.滴加二抗(羊抗兔IgG-FITC，羊抗鼠IgG-羅丹明)(購自華美公司)，37℃，30min；12.PBS洗3min×3次；13.熒光顯微鏡下觀察并拍照。
四、Dil-Ac-LDL標記檢測以無血清DMEM稀釋Dil-Ac-LDL為10ug/ml，加至已分化出血管樣結構的EB培養(yǎng)皿中，37℃孵育4小時，將其去除，無血清DMEM洗3遍，熒光顯微鏡觀察，照相。
結果一、hES細胞體外誘導EB形成hES細胞在MEF細胞的飼養(yǎng)層上呈巢穴狀生長，見圖1。
結果顯示，接種于1％軟瓊脂鋪底的培養(yǎng)皿內呈懸浮生長，經含1×10-9mol/L RA的培養(yǎng)液培養(yǎng)后，小細胞團細胞增殖，體積漸大；在第5天時形成球形的胚體，好的胚體透亮、邊緣光潔，見圖2。
二、hES細胞體外誘導分化為內皮細胞hES細胞形成EB后移至白明膠包被的培養(yǎng)皿中貼壁生長。在TGF-β1誘導下，第2天EB周圍有上皮樣細胞和圓形細胞出現(xiàn)，見圖3；第3天開始出現(xiàn)由圓形細胞構成短小的管狀結構，管道狀結構自EB向周圍呈輻射狀生長，見圖4；漸呈交叉網狀，見圖5。
三、電鏡檢測1.掃描電鏡結果顯示，管狀結構的管壁最初由許多圓形細胞和扁平狀細胞組成，隨著管狀結構的延伸，細胞逐漸減少，管壁變得光滑，見圖6。
2.透射電鏡透射電鏡結果顯示，誘導出的血管樣結構由幾個內皮樣細胞圍成，見圖7；細胞呈扁平樣，表面較光滑，見圖8；相臨細胞間有緊密連接，見圖9。與正常毛細血管結構非常相似，(圖10)，證明本發(fā)明可成功誘導出血管。
四、免疫熒光檢測hES細胞誘導分化的管狀結構經vWF、CD31、Flk-1抗體免疫熒光檢測均呈陽性，見圖11-13，證明由人ES誘導分化而來的細胞具內皮細胞性質。
五、Dil-Ac-LDLDil-Ac-LDL攝取實驗結果呈紅色熒光，見圖14，為陽性。證明hES細胞定向誘導分化的細胞具有內皮細胞的功能。
本實施例中，vWF免疫熒光染色和Dil-LDL直接熒光檢測結果均為陽性，表明構成管樣結構的細胞具有內皮細胞性質，表明低濃度RA和TGF-β1可誘導人ES細胞分化為內皮細胞及血管樣結構。
實施例3血管內皮細胞-生物材料復合物的制備將原代、第一代、第二代、第三代、第四代、第五代、第六代的細胞懸液分別離心(1500r/min)，傾去上清，將細胞沉淀與可注射性生物材料Pluronic F-127(一種市售的聚環(huán)氧乙烯商品)在4℃下充分混合，濃度為5×107個細胞/ml，制成細胞-聚環(huán)氧乙烯復合物。用2ml注射器吸取復合物備用。
實施例4含血管內皮細胞的組合物的制備將實施例1所得的血管內皮細胞與血管平滑肌細胞混合，制得組合物，將該組合物配制成濃度為5×107個細胞/ml的細胞懸液，取1ml注入體內缺血部位(如心肌梗塞部位)，用于治療血管性疾病。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求
書所限定的范圍。
權利要求
1.一種血管內皮細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括步驟a.在基本上不含有動物血清和含維甲酸的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)人胚胎干細胞，形成擬胚體；b.用含β1-轉化生長因子的培養(yǎng)液將擬胚體培養(yǎng)成具有血管樣結構的血管內皮細胞。
2.如權利要求
1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟a中所述培養(yǎng)基基本上不含動物血清是指哺乳動物血清的體積濃度為0-2％。
3.如權利要求
1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟a中所用的維甲酸濃度為0.1-3×10-9mol/L。
4.如權利要求
1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟a和b中的培養(yǎng)是在37±2℃，和5±1％CO2條件下培養(yǎng)1-7天。
5.如權利要求
1或4所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟b中所用的β1-轉化生長因子濃度為1-5ng/ml。
6.如權利要求
1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，在步驟a和b之間還包括步驟將擬胚體進行貼壁培養(yǎng)。
7.一種如權利要求
1所述的培養(yǎng)方法所得的血管內皮細胞。
8.根據權利要求
1所述的培養(yǎng)方法得到的血管內皮細胞的用途，其特征在于，用作構建組織工程化血管的種子細胞。
9.根據權利要求
1所述的培養(yǎng)方法得到的血管內皮細胞的用途，其特征在于，用于制備血管移植物。
10.根據權利要求
9所述的用途，其特征在于，所述的移植物用于治療血管性疾病。
專利摘要
一種培養(yǎng)血管內皮細胞的方法涉及組織工程學中獲得種子細胞的方法，本發(fā)明在基本上不含有動物血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚胎干細胞，然后利用RA和TGF－β培養(yǎng)出血管內皮細胞，為組織工程化種子細胞的獲得開辟了新的來源。
文檔編號C12N5/08GK1990858SQ200510112069
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月27日
發(fā)明者曹誼林, 叢笑倩, 王彥, 吳春芳, 唐鄭雅, 張文杰, 劉偉, 崔磊 申請人:上海國睿生命科技有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan