專利名稱：:用于核酸高通量測序的裝置的制作方法用于核酸高通量測序的裝置相關(guān)申請的交叉引用本申請根據(jù)美國法案35篇119條e項要求于2007年10月30日提交的題為“用于核酸高通量測序的裝置(ApparatusForHighThroughputSequencingOfNucleicAcids)”的第60/983，886號美國臨時申請的權(quán)益，其內(nèi)容通過其全文引用并入本文。關(guān)于聯(lián)邦資助研究或開發(fā)所完成發(fā)明的權(quán)利的聲明不適用對光盤提交的《序列表》、表格或計算機程序表附件的引用不適用發(fā)明背景本發(fā)明一般地涉及核酸的自動化光學檢測領(lǐng)域。本發(fā)明一般涉及用于核酸自動化高通量測序的可擴展的反應和檢測系統(tǒng)。人類基因組計劃的到來需要開發(fā)改進的方法，用于諸如DNA(脫氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)的核酸的測序。人類基因組全部的3，000，000，000堿基序列的測定已為鑒定眾多疾病的遺傳基礎提供了依據(jù)。然而，仍需要做大量工作以鑒定關(guān)聯(lián)每種疾病的遺傳變異，并且為每個個體(二倍體人類基因組大小)測序6，000,000,000堿基的現(xiàn)有成本不僅仍然極其困難，而且高不可攀。隨著DNA測序系統(tǒng)的發(fā)展，許多公司已經(jīng)著手高通量DNA測序的挑戰(zhàn)。雖然這樣的系統(tǒng)已經(jīng)降低了成本，并增加了DNA測序的效率，但這些系統(tǒng)通常是具有多個互相依賴的組件的整裝單元。這樣的單一單元測序系統(tǒng)有許多局限，包括有限的可擴展性，在特定組件上引入創(chuàng)新的時間延滯，和整個系統(tǒng)的功能對系統(tǒng)每個組件的直接依賴性。已知用于測序反應和分析的流動池。這樣的流動池的實例包括含有為測序反應性能所用的任意基質(zhì)的那些流動池，諸如在本文中較為詳盡敘述的那些，以及記載于美國專利號5，958，760,6,403，376,6,960，437,7,025，935,7,118，910,7,220，549,7,244，559、7，264，929、TO01/35088和公開的美國專利申請?zhí)?007/0128610中的那些。本發(fā)明解決了已知現(xiàn)有技術(shù)的局限。定義為了在當前技術(shù)上具備足夠的背景，有助地是，理解下列技術(shù)術(shù)語?！皵U增子”指多核苷酸擴增反應的產(chǎn)物，即，自一條或多條起始序列復制得到的多核苷酸群。擴增子可以通過多種擴增反應來生成，包括但不限于聚合酶鏈式反應(PCR)，線性聚合酶反應，基于核酸序列的擴增，滾環(huán)擴增等等(參閱如美國專利號4，683，195、4，965，188,4，683，202,4，800159,5，210，015,6，174，670,5，399，491,6，287，824禾口5，854，033；以及美國公開號2006/0024711)。“陣列”或“微陣列”是指具有表面、優(yōu)先但非排他地平面或基本上平面的表面的固相支持物，其攜帶含有核酸的位點集合，使得該集合的每個位點在空間上是確定的、不與該陣列的其他位點重疊；即，所述位點在空間上是分離的。陣列或微陣列還可以包括具有表面的非平面可詢結(jié)構(gòu)(interrogatablestructure)如珠或孔。所述陣列的寡核苷酸或多核苷酸可以共價結(jié)合于固相支持物，或者它可以非共價結(jié)合。常規(guī)微陣列技術(shù)綜述于如Schena編(2000),Microarrays=APracticalApproach(微整列實踐方法)(IRLPress，Oxford)。在用于本文時，“隨機陣列”或“隨機微陣列”是一類微陣列，其中，寡核苷酸或多核苷酸的身份至少起初不能根據(jù)其位置辨別，但可以通過對該陣列的特定生物化學檢測技術(shù)測定。參閱如美國專利號6，396，995,6,544，732,6,401，267和7，070，927；世界知識產(chǎn)權(quán)組織出版物WO2006/073504和2005/082098；美國公開號2007/0207482和2007/0087362?！半s交”指兩條單鏈多核苷酸非共價結(jié)合以形成穩(wěn)定的雙鏈多核苷酸的過程。術(shù)語“雜交”還可以指三鏈雜交。(通常)所得的雙鏈多核苷酸是“雜合物(hybrid)”或“雙鏈體(duplex)”?！半s交條件”通常會包括低于大約1M、更通常的是低于大約500mM和低于大約200mM的鹽濃度。“雜交緩沖液”是指緩沖鹽溶液，諸如5XSSPE等等。雜交溫度可以低至5°C，但通常高于22°C，更通常的是高于大約30°C，并且優(yōu)選高于大約37°C。雜交通常在嚴謹條件下進行，即探針會與其靶物子序列雜交的條件。嚴謹條件是序列依賴性的，在不同情況下是不同的。較長的片段可能需要較高的雜交溫度以實現(xiàn)特異性雜交。因為其他因素(包括互補鏈的堿基組成和長度、有機溶劑的存在和堿基錯配的程度)可影響到雜交的嚴謹性，參數(shù)的組合比任何單獨一項的絕對度量更為重要。嚴謹條件一般選擇為比特定序列在限定的離子強度和PH的Tm低大約5°C。示例性的嚴謹條件包括pH7.0至8.3下至少0.OlM至不高于IMNa離子濃度(或其他鹽)的鹽濃度，和至少25°C的溫度。例如，5XSSPE(750mMNaCl，50mM磷酸鈉，5mMEDTA,pH7.4)的條件和25_30°C的溫度適合于等位基因特異性探針雜交。關(guān)于嚴謹條件，參閱如Sambrook，F(xiàn)ritsche和Maniatis，MolecularCloning:AlaboratoryManual(分子克隆實驗室手冊)第2版，ColdSpringHarborPress(1989)和Anderson，NucleicAcidHybridization(核酸雜交)第1版，BIOSScientificPublishersLimited(1999)?！芭c...特異性雜交(hybridizingspecificallyto)”或“與...特異性雜交(specificallyhybridizingto)”或類似表述指，當該序列以復合混合物(例如全細胞的)DNA或RNA存在時，在嚴謹條件下，分子實質(zhì)上與或僅與一種或多種特定核苷酸序列的結(jié)合、雙鏈化(duplexing)或雜交?！斑B接”意指在模板驅(qū)動的反應中，在兩條或更多條核酸(例如寡核苷酸和/或多核苷酸)的末端之間形成共價鍵或聯(lián)接(linkage)。所述鍵或聯(lián)接的本質(zhì)可以廣泛多樣，而且連接可以是酶促或化學進行的。在用于本文時，連接一般通過酶促進行，以在一條寡核苷酸的末端核苷酸的5’碳與另一條寡核苷酸的3’碳之間形成磷酸二酯聯(lián)接。多種模板驅(qū)動的連接反應記載于下列參考文獻=Whitely等，美國專利4，883，750；Letsinger等，美國專利5，476，930；Fung等，美國專利5，593，826；Kool，美國專利5，426，180；Landegren等，美國專利5，871，921;Xu與Kool，NucleicAcidsResearch,27875-881(1999)；Higgins等，MethodsinEnzymology,6850-71(1979)；Engler等，TheEnzymes，15:3_29(1982)；與Namsaraev，關(guān)國專利公開2004/0110213。酶促連接通常發(fā)生在連接酶緩沖液中，其是含有所采用的特定連接酶所需要的任何二價陽離子、輔因子等等的緩沖鹽溶液?！板e配”意指Watson-Crick堿基對G-C和A-T之外的任意兩個堿基A、T(或RNA時的U)、G和C之間的堿基對。八個可能的錯配是A-A、T-T、G-G、C_C、T_G、C-A、T-C和A-G?！熬酆厦告準椒磻被颉癙CR”，意指通過DNA互補鏈的同步引物延伸的用于體外擴增特定DNA序列的反應。換言之，PCR指用于制備側(cè)翼為引物結(jié)合位點的靶核酸的多個拷貝或復制物的反應，這樣的反應包括一次或多次重復以下步驟(i)使靶核酸變性，(ii)使引物與引物結(jié)合位點退火，和(iii)在核苷三磷酸存在時通過核酸聚合酶使引物延伸。通常，所述反應在熱循環(huán)設備中經(jīng)由為每個反應條件優(yōu)化的不同溫度而循環(huán)。特定溫度、持續(xù)時間和各反應之間變化的速率取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的許多因素，例如參考文獻McPherson等編，PCR:APracticalApproach(PCR實踐方法)和PCR2:APracticalApproach(PCR2實踐方法)(IRLPress,Oxford分別于1991和1995)所示例的。例如，在使用TaqDNA聚合酶的常規(guī)PCR中，可使雙鏈靶核酸在>90°C的溫度下變性，使引物在50-75°C范圍的溫度下退火，并使引物在72-78°C范圍的溫度下延伸。如上述，術(shù)語“PCR”涵蓋該反應的衍生形式，包括但不限于RT-PCR、實時PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR、諸如此類。反應體積的范圍從幾百納升(例如200nL)到幾百微升(例如200μL)?！昂怂帷焙汀肮押塑账帷庇糜诒疚闹负塑账釂误w的聚合物。用于本文時，該術(shù)語也可以指雙鏈的形式。構(gòu)成核酸和寡核苷酸的單體能經(jīng)由規(guī)則樣式的單體_單體相互作用、諸如Watson-Crick型堿基配對、堿基堆積、Hoogsteen或反向Hoogsteen型堿基配對等等，與天然多核苷酸特異性結(jié)合，以形成雙鏈體或三鏈體形式。這樣的單體及其核苷間聯(lián)接可以是天然存在的，或者可以是它們的類似物，例如天然存在的或非天然存在的類似物。非天然存在的類似物可包括肽核酸(P印tidenucleicacids)、鎖核酸(lockednucleicacids)、硫代磷酸酯核苷間聯(lián)接(phosphorothioateinternucleosidiclinkages)、含有容許諸如熒光團或半抗原的標記物附著的連接基團的堿基、諸如此類。每當寡核苷酸或核酸的使用需要酶促加工時，諸如使用聚合酶的延伸、使用連接酶的連接等等，本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，那些情況下的寡核苷酸或核酸不會在任何或某些位置含有核苷間聯(lián)接、糖部分或堿基的某些類似物(當這樣的類似物與酶促反應不相容時)。核酸大小范圍通常是自幾個單體單元(例如5-40個，此時它們通常稱為“寡核苷酸”)至數(shù)百千個或更多單體單元。每當核酸或寡核苷酸以(大寫的或小寫的)字母序列代表時，例如“ATGCCTG”，應理解，核苷酸從左向右是5'-3'次序，而且“A”表示脫氧腺苷酸，“C”表示脫氧胞嘧啶，“G”表示脫氧鳥苷酸，而“T”表示脫氧胸腺嘧啶，“I”表示脫氧次黃苷，“U”表示尿嘧啶，除非另有說明或根據(jù)上下文顯而易見。除非另有說明，術(shù)語學和原子編號規(guī)定將遵循Strachan與Read，HumanMolecularGenetics2(人類分子遺傳學2)(ffiley-Liss,NewYork,1999)中所公開的。核酸通常包含通過磷酸二酯聯(lián)接相連的天然核苷(例如對于DNA是脫氧腺苷酸、脫氧胞嘧啶、脫氧鳥苷酸、脫氧胸腺嘧啶，或者對于RNA是它們的核糖對應物)；然而，它們還可以包含非天然核苷類似物，例如經(jīng)過修飾的堿基、糖或核苷間聯(lián)接。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，若酶的活性具有特定的寡核苷酸或核酸底物要求，例如單鏈DNA、RNA/DNA雙鏈體等等，則寡核苷酸或核酸底物的適宜組成的選擇完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識之內(nèi)，尤其是來自專著的指導，所述專著諸如Sambrook等，分子克隆第2版(ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,1989)和類似的參考文獻?！耙铩敝冈谂c多核苷酸模板形成雙鏈體時，能夠充當核酸合成的起始點，并自其3’末端沿模板延伸，從而形成延伸的雙鏈體的寡核苷酸，其或是天然的或是合成的。延伸過程中添加的核苷酸的序列是由模板多核苷酸的序列決定的。引物通常由DNA聚合酶延伸。引物的長度范圍通常是9-40個核苷酸，或者在一些實施方式中是14-36個核苷酸。[0024]“探針”用于本文時指用于查詢未知序列核酸中的互補序列的寡核苷酸，其或是天然的或是合成的。特定探針與靶多核苷酸的雜交表明靶多核苷酸序列內(nèi)與所述探針互補的特定序列。“讀出(readout)”指可表示為數(shù)字、數(shù)值或其他用于評價的標記的測量和/或檢測的一項或多項參數(shù)。在一些語境中，讀出可以指這樣采集或記錄的數(shù)據(jù)的實際數(shù)字表示。例如，來自微陣列的熒光強度信號的讀出指在微陣列的每個雜交位點所產(chǎn)生的信號的位置和熒光強度；如此，這樣的讀出可以以多種方式登記或存儲，所述方式例如微陣列的圖像、數(shù)表等等?！肮腆w支持物”和“支持物”可互換使用，指具有一個或多個剛性或半剛性表面的一種或一組物質(zhì)。微陣列通常包含至少一個平面固相支持物，諸如顯微鏡載玻片。用于本文時，術(shù)語“Tm”即“熔解溫度”。該熔解溫度指雙鏈核酸分子群中有一半解離成單鏈時的溫度。本領(lǐng)域公知用于計算核酸Tm的數(shù)個方程。如標準參考文獻所示，Tm值的簡單估算可通過如下方程來計算Tm=81.5+0.41(%G+C)，當核酸存在于IMNaCl7jC性溶液中時(參閱如Anderson禾口Young,QuantitativeFilterHybridization(定量過濾雜交)，于NucleicAcidHybridization(1985))。其他參考文獻(例如Allawi，H.Τ.&SantaLucia,J.，Jr.,Biochemistry36:10581-94(1997))包括在計算Tm時考慮結(jié)構(gòu)和環(huán)境以及序列特征的替代計算方法。作為說明，除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解相同的含義。當提供值的范圍時，應理解介于所述范圍的上限與下限之間的每一居中值(除非上下文另有明確規(guī)定，否則精確到下限單位的十分之一)和所述范圍內(nèi)的任意其他指出的值或居中值都涵蓋于本發(fā)明中。這些較小范圍的上限和下限可獨立地包括在所述較小范圍中，這也涵蓋于本發(fā)明中，其從屬于所述范圍中的任意特定排除的界限。當所述范圍包括兩個界限中的一個或兩個時，排除那些所包括的界限中的一個或兩個的范圍也包括在本發(fā)明中。在以下描述中，眾多具體細節(jié)被加以陳述以提供對本發(fā)明更為徹底的理解。然而，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，本發(fā)明可在沒有這些具體細節(jié)中的一個或多個下實施。在其它實例中，為避免掩蓋本發(fā)明，沒有描述本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的特征和程序。通常，除另有所指，涉及本發(fā)明的分子生物學和測序分析在其基本方面是受雇于相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)的常規(guī)方法。這些技術(shù)全部在文獻中得到充分說明，參閱如Maniatis,Fritsch&Sambrook,MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實驗室手冊)(1982)和Sambrook，Russell和Sambrook，MolecularCloningALaboratoryManual(分子克隆實驗室手冊)(2001)。用于本文的核酸化學、生物化學、遺傳學和分子生物學術(shù)語與符號遵循以下標準專著和本領(lǐng)域文本，例如Kornberg和Baker,DNAReplication(DNAMM)，H2片反(W.H.Freeman,NewYork,1992)；Lehninger,Biochemistry(生物化學)，第2版(WorthPublishers,NewYork,1975)；Strachan和Read；HumanMolecularGenetics(人類分子遺傳學)，第2版(ffiley-Liss,NewYork,1999)；Eckstein編，OligonucleotidesandAnalogs:APracticalApproach(寡核苷酸及類似物實踐方法)(OxfordUniversityPress,NewYork,1991)；Gait編，6OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach(寡核苷酸合成實踐方法)(IRLPress,Oxford,1984)等等。發(fā)明_既述根據(jù)本發(fā)明，用于為基因組分析進行核酸測序的系統(tǒng)包括例如用于樣品制備和用于觀測的分離的功能單元，該系統(tǒng)可以以允許不同的測序反應組件與分離的用于光學圖像采集和/或分析的設備組件互換使用的方式配置，以最小化在以不同速度運行的樣品制備和數(shù)據(jù)提取上的阻礙。本發(fā)明提供了用于未知序列核酸的序列測定的高通量系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)包括多個基于目的的、分離的組件，所述組件在這樣的系統(tǒng)內(nèi)是物理上松聯(lián)接(coupled)的，并且是可逆集成的，以用于序列查詢和分析。該系統(tǒng)的松聯(lián)接和可逆集成性質(zhì)在多種系統(tǒng)組件的使用中提供了更高的效率和通用性，從而允許了基于時間要求和每個組件能力的系統(tǒng)的優(yōu)化。這允許改進的可擴展性，給系統(tǒng)增加改進的容易性，和比起本領(lǐng)域當前可得的全集成系統(tǒng)，具有增強的用戶靈活性的多個系統(tǒng)配置的創(chuàng)建。使系統(tǒng)元件處于松聯(lián)接和可逆集成提供了許多益處，包括便于需要在系統(tǒng)單一組件上進行的任何修復而不干擾整個系統(tǒng)的其它組件。而且，獨立系統(tǒng)組件的聯(lián)接策略便于引入對單一組件的任何改進，從而促進新的創(chuàng)新的使用和對整個系統(tǒng)提供最新態(tài)的技術(shù)創(chuàng)新。在本發(fā)明的具體實施方式中，更高的通量可通過在施行核酸測序所需的各個活動中使用多個組件而實現(xiàn)。例如，使用多個光學檢測儀器和/或多個測序反應組件能大大增加測定序列的數(shù)量和減少做此事所需的時間。在實施方式之一中，提供了用于測序的單一反應設備和單一光學檢測與分析儀器，該反應設備與光學儀器是物理上松聯(lián)接和可逆集成的。在另一實施方式中，提供了多個生化組件和單一光學檢測儀器以用于不同的測序反應組件，例如通過合成指向測序的組件和通過探針連接指向測序的組件。這樣的系統(tǒng)的測序反應組件能保持為分離的單元，每個單元與光學成像系統(tǒng)在物理上可逆地相互連結(jié)。這允許單一系統(tǒng)利用不同的測序技術(shù)，并從在單一器件配置中的多個不同測序方法的優(yōu)勢中受益。光學儀器能在具有分析組件的單一系統(tǒng)中設置，或者它們作為整個系統(tǒng)的兩個單獨的組件加以配置。在一具體的實施方式中，所述系統(tǒng)可包括三個分隔化組件(i)用于存放和轉(zhuǎn)移檢測與處理試劑(detectionandprocessingreagents)的流體學系統(tǒng)，例如探針、洗液等等；(ii)用于在系列反應室中或在一個或多個流動池中實施生化測序反應的反應平臺；和(iii)用于捕捉測序反應的光學圖像和這些圖像的分析的分離的照射和檢測系統(tǒng)。用于生化測序反應的反應平臺優(yōu)選具有包括單個流動池的多個反應單元和用于在生化測序反應完成后，將每個流動池從反應設備轉(zhuǎn)移至照射和檢測系統(tǒng)的機構(gòu)。在多個實施方式的優(yōu)選方面，流動池包括附著于固體表面(例如玻片或諸如膠片或膜的柔性材料)的未知序列的核酸陣列。在另一實施方式中，每個流動池包括附著于珠的未知序列的核酸陣列，所述珠任選地附著于固體或半固體表面。在本發(fā)明實施方式的某方面，系統(tǒng)的測序反應組件提供了供處理樣品使用的多個流動池。在優(yōu)選方面，每個流動池包括基本上密閉的室，所述室具有流體入口和流體出口，以分別引入和去除測序反應中所用的流體。在具體實施方式中，兩個或更多個測序反應平臺可與單一光學成像系統(tǒng)相互連結(jié)，所述成像系統(tǒng)能記錄和分析來自每個反應單元的單獨的測序信息。在具體方面，在多個反應平臺上的每個反應單元和流動池被設計為在多個流動池上實施同樣的高通量核酸測序生化。在另一方面，不同的反應平臺和流動池被設計為使不同的生化方法適用于高通量核酸測序，每個反應平臺優(yōu)化為實施具體的流動池測序反應。使已優(yōu)化的測序反應平臺和流動池生化反應單元(各設計為供給測序方法的具體生物化學)與單一照射和分析系統(tǒng)相互可逆連接的能力，提供了空間和運行時間的最適利用，且比擁有用于每一潛在的生化測序應用的單獨的完整系統(tǒng)更有成本效益。在某些實施方式的特定方面，每個流動池內(nèi)表面部分由支持物攜帶樣品的表面確定，所述布置的優(yōu)勢在于最小化涉及流動池組裝的組件的數(shù)量。在具體實施方式中，特定測序反應單元的流動池各自通過在兩個固體平面表面之間夾入玻璃和墊圈來包括未知序列的靶核酸的陣列。一平面具有足夠大小的開口，以允許成像，和用于蓋玻片的索引槽(indexingpocket)。另一平面具有用于墊圈的索引槽、流體接口、和任選擇的溫度控制系統(tǒng)。在本發(fā)明的一具體方面，為與測序反應單元的具體使用而設計的的流動池包括1"平方、170毫米厚的蓋玻片。在優(yōu)選的實施方式中，該流動池具有一個為高通量、基因組規(guī)模測序已衍生為結(jié)合未知序列大分生物結(jié)構(gòu)的表面。在本發(fā)明某些具體方面，流動池可包括連接到具有影響流體自流動池的進入或流出的能力的器件(例如注射泵)的流體接口。在本發(fā)明的另一具體方面，流動池包括連接到混合室的接口，所述混合室任選地裝備有液位傳感器。需用于測序反應的溶液被分配至該室中，在需要時混合，然后被吸入流動池中。在優(yōu)選方面，室在性質(zhì)上為圓錐形，并作為漏斗起作用。在本發(fā)明的實施方式的某些方面，每個流動池包括溫度控制子系統(tǒng)，其具有將溫度維持在約5-95°C、或更特別地10-85°C的范圍內(nèi)的能力，并能以每秒約0.5-2°C的速率改變溫度。在本發(fā)明某些實施方式的又一方面，系統(tǒng)還提供了用于處理支撐在支持物上的樣品、特別是生物樣品的自動化設備，所述設備包含用于抓持一個或多個支持物的支持物抓持裝置，在所述的或每個支持物上的樣品存在于各自基本上密閉的室內(nèi)；用于將處理流體輸送至所述的或每個室的流體輸送裝置；用于從所述的或每個室去除流體的廢液收集裝置；和用于監(jiān)測測序反應的計算機控制裝置。所述設備優(yōu)選地與一個或多個以上定義的流動池聯(lián)合使用。當閱讀如下更充分地描述的方法細節(jié)時，本發(fā)明將更好為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。附圖簡述圖1是示出本發(fā)明測序反應平臺基本格式的圖。圖2是示出包括測序反應平臺和光學成像器件的系統(tǒng)的第一實施方式的圖。圖3是示出包括測序反應平臺和光學成像器件的系統(tǒng)的第二實施方式的圖。圖4是示出包括含有伸縮臂的測序反應平臺和光學成像器件的系統(tǒng)的第三實施方式的圖。[0056]圖5是示出包括平行配置的測序反應平臺的系統(tǒng)的圖。圖6是示出根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)細節(jié)的圖。發(fā)明詳述圖1顯示示例性的具有反應工作區(qū)的測序反應平臺的側(cè)視示意圖，其縱向尺寸為X，寬度尺寸為Y，高度尺寸為Z。圖2顯示本發(fā)明測序系統(tǒng)實施方式的一個優(yōu)選方面的第一個測序反應平臺的頂視示意圖。這種性質(zhì)的平臺也在美國專利號7，264，432中有所公開。該反應平臺3包括置于分離的固體支持物2'上且位于至少一個基本上水平的、縱向尺寸為X、寬度尺寸為Y的桌4上的流動池2。該反應平臺3包括至少一個平行于X方向延伸的軌道5和至少一個具有運載器件9的位移單元6，所述運載器件9可與該位移單元沿軌道5—起移動，以在X方向上轉(zhuǎn)移目的物。運載器件9在這里以運載板11(其可與位移單元6—起沿軌道5移動)和用于抓取并移動每個分離的支持物2至聯(lián)接的光學表征工具7的機動夾持機構(gòu)8而實施。使用夾持機構(gòu)8時，支持物2'和流動池2拖拽在運載板11上，并利用運載器件9沿X方向轉(zhuǎn)移至觀測工具7，即成像器件。被接收的具有流動池2的分離的支持物2'依照運載板11的位置X，可分配至其在工作區(qū)域4上的初始位置。運載板11的位置X和用于抓取目的物的夾持機構(gòu)8的移動路徑(目的物初始位置Y)的這種檢測是通過合適的用于檢測線性移動的傳感器(未顯示)來進行的，其為來自相關(guān)
技術(shù)領(lǐng)域：
：的領(lǐng)域技術(shù)人員所知。源自這些傳感器的信息的處理、用于運載板11沿X方向和夾持機構(gòu)8沿Y方向移動的驅(qū)動控制、和目的物初始位置X/Y的信息的分配優(yōu)選用數(shù)字計算機(未顯示)實施的合適的程序化控制器進行，所述數(shù)字計算機也是本系統(tǒng)的聯(lián)接部分。由于在未知核酸的測序中，包含于流動池中的所有樣品將在某種程度上可變，整個平臺3的所有流動池支持物2的識別是期望且有益的。這也可能對于通過軟件應用追蹤一系列流動池的個體序列是重要的。反應平臺上的流動池的確定的位置和定向允許了每組測序樣品的識別和由此而來的出于后期的交叉核實和組裝目的的樣品追蹤。在這些實施方式的具體方面，流動池2和支持物2'是以單一集成構(gòu)造而形成的。在圖3中說明的具體實施方式中，系統(tǒng)3進一步提供了諸如條形碼閱讀器的表征工具12。該表征工具能讀取一個或多個支持物2'的識別元件，并確定在相應流動池中的樣品的身份。這種識別優(yōu)選當支持物2'拖拽在運載器件9的運載板11上時進行。圖4說明了沿Z方向轉(zhuǎn)移至與反應平臺3不在同一平面的成像系統(tǒng)的包含流動池2的支持物2'。于一位置包括元件8且于另一位置包括元件8'的夾持機構(gòu)在這里以伸縮臂實施；作為其替代物，也可以以關(guān)節(jié)臂實施。運載器件9可以角度轉(zhuǎn)動，所述角度優(yōu)選為+180°和/或-180°，以垂直于水平工作場4的Z軸為參考。夾持機構(gòu)(未顯示)的進一步的可選擇實施方式包括具有履帶的沿Y方向運行的軌道，例如其可以被升高和/或降低以抓取和/或陳放運載器。使用該運載器件9時，包含流動池2的支持物2'可以沿X方向轉(zhuǎn)移，然后用夾持機構(gòu)8陳放于觀測工具7視野內(nèi)的位置，所述位置不同于目的物在工作區(qū)4的初始位置，所述工作區(qū)4明顯為在觀測之前進行化學的區(qū)域。同時，當夾持機構(gòu)8被移出時，優(yōu)選地，樣品和/或目的物的身份再次被檢測，并且流動池2和支持物2‘的新的X/Y位置儲存于系統(tǒng)的聯(lián)接計算機組件。[0065]從前面的記述中可以看到支持物2'不僅可以使用夾持機構(gòu)8'抓取、平面轉(zhuǎn)移、和再次陳放，支持物2'還可以從一個平面沿Z方向轉(zhuǎn)移至位于其上或下的平面并陳放于此以使用本發(fā)明的系統(tǒng)的照射、檢測和分析組件進一步分析。當這些轉(zhuǎn)移任務被執(zhí)行時，對于每一目的物有益但不是絕對必要的是，使用表征工具12對其識別或表征(圖3)。多于兩個的工作平臺可以聯(lián)合為高級別系統(tǒng)，如圖5所示。工作區(qū)4、4'可相互平行、首尾串聯(lián)或重疊放置，并且可以以水平平面上的任意角度旋轉(zhuǎn)(未顯示)。本發(fā)明一方面及時和高效地支持反應組件的自動化測序。該過程可涉及為未知序列的核酸生化查詢而優(yōu)化的多個測序反應系統(tǒng)組件。不同的生化測序反應能適用于本發(fā)明系統(tǒng)，包括但不限于，諸如美國專利號6，864，052,6,309，824和6，401，267和美國專利公開2005/0191656中公開的基于雜交的方法；諸如美國專利號6，210，891,6,828，100、6，833，246,6,911，345；文章Ronaghi等(1998)，Science,281:363_365；和Li等Proc.Natl.Acad.Sci.，100=414-419(2003)中公開的通過合成方法測序；和如例如國際專利申請W0199901934UW02005082098,ff02006073504和文章Shendure等(2005)，Science,3091728-1739中所公開的基于連接的方法。在特定實施方式中，所述系統(tǒng)的測序反應組件包括一個或多個流動池2(例如反應室)(圖6)，在所述流動池中發(fā)生實際的生化測序反應。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，系統(tǒng)的測序反應組件的流動池2包括例如由光學顯微鏡載玻片20、22所構(gòu)成的支持結(jié)構(gòu)2'中的室，所述載玻片20、22由插入流動池室2的間隔部件23、24、26、28所間隔，每個室具有入口30、出口32和具有示例性區(qū)域34、36的表面，所述示例性區(qū)域34、36已經(jīng)被制成或經(jīng)處理以允許核酸在以液體輸送被注射通過該入口30時附著于此。流動池任選地包括附著于流動池的表面區(qū)域34、36的核酸或引物，所述核酸或引物或是作為隨機陣列，或是處于預定的微位點陣列中，以至于每條核酸的身份都能通過反應過程而被監(jiān)測。核酸或引物可以被附著于所述表面，以致當通過支持結(jié)構(gòu)2'的壁而觀察時，所述核酸或引物的至少一部分個體地是光學可溶的。在一優(yōu)選實施方式中，流動池2包括具有未知序列核酸固定其上的固體支持物或至少地支撐(backing)的、基本上密閉的室。流動池2優(yōu)選地與支持物鎖緊件(桌或盒)相連，以在本系統(tǒng)測序反應組件中放置固體支持物或支撐。流動池2在測序反應系統(tǒng)組件上可以例如并排式或一前一后式地布置。在固體支持物2'包括/是顯微鏡載玻片22的情況下，支持物鎖緊件通常會有這樣的尺寸大小，即它可適用于常規(guī)大小載玻片(例如通常為約25.4mm乘76.2mm的載玻片)。在支持物為膜的情況下，鎖緊件的尺寸將類似于這樣的尺寸大小，即它可適用于常規(guī)大小(通常地80mm乘120mm)膜，盡管膜比載玻片在大小上可變得多。流動池的結(jié)構(gòu)方面通常是通過粘附劑(與間隔元件23、24、26、28相聯(lián))或通過夾取裝置40、42保持在一起。在本發(fā)明實施方式的某些方面，夾取裝置40、42能將多個流動池的部分夾在一起。通常地，從一個到約十二或十六個流動池可被單個夾取裝置同時夾取。流動池能以基本上水平或基本上垂直的方式以夾取裝置布置，盡管這兩個位置之間的任何中間位置都是可能的。作為替代、或除了夾取之外，流動池可具有連接流動池組件的偏置結(jié)構(gòu)。偏置結(jié)構(gòu)可包括一個或多個彈簧偏置件46、48、50、52。在特定實施方式中，支持物通過裝有彈簧的安裝釘附著于夾取件上，以致流動池的形成使裝有彈簧的安裝釘?shù)膹椈墒軌?，彈簧因此連接流動池組件。在本發(fā)明實施方式的其它具體方面，通過夾取裝置和/或偏置裝置施于流動池結(jié)構(gòu)的作用力有助于確保支持物與支持物鎖緊件之間的防液密閉。在某些方面，通常優(yōu)選的是，流動池另外包括密閉裝置以協(xié)助基本上密閉的室的形成。密閉裝置可以是支持物鎖緊件的不可或缺的部分，或者可以作為流動池單獨組件而提供。所述密閉裝置通常包括墊圈，其可由硅橡膠或其他合適的材料制成。在一實施方式中，密閉裝置包括0環(huán)墊圈，其形狀通常是位于支持物鎖緊件一部中的槽中的框型邊形狀。在一可選擇實施方式中，密閉裝置包括扁平的框型邊墊圈(約100至150μπι厚)。在其他具體方面，墊圈或其他間隔部件材料能用粘合劑粘附。墊圈類型或者可在單次使用后棄去(如果例如污染有放射性探針)，或者需要時可再次利用。扁平墊圈實施方式特別適于作一次性墊圈，以在單次使用后棄去。明顯的是，墊圈的厚度(容易通過交換墊圈而改變)部分地可以確定基本上密閉的室的體積。在本發(fā)明的另一方面，在測序反應中使用小量時，流動池組件通過粘合劑的使用而直接連接。粘合劑優(yōu)選引入提供了多種流動池組件間(例如包括陣列的載玻片和蓋玻片)最適粘附的表面。流體入口30允許將所需流體引入基本上密閉的室，以處理支持物上的樣品。通常地，這類流體是緩沖液、溶劑(例如乙醇/甲醇，二甲苯)、試劑(例如含引物或探針的溶液)等等。流體出口允許處理流體從樣品中去除(例如為洗滌，或以允許后續(xù)試劑的加入)。優(yōu)選的是，當支持物正被處理時，它們的方向是這樣的，以至流體入口位于基本上密閉的室的底部，而且流體出口位于基本上密閉的室的頂部。通常地，在核酸樣品支撐在載玻片22上的情況下，基本上密閉的室具有50μ1至300μ1、優(yōu)選100-150μ1的體積。這樣的小體積允許試劑節(jié)約使用和(在涉及溫度調(diào)節(jié)的情況下)快速的熱響應時間。在樣品支撐在膜上的情況下，室通常將更大(大至2-3mls)。在特定方面，流動池2可配置為適于對附著于支持物的樣品進行擴增(例如滾換擴增或聚合酶鏈式反應擴增)。在這樣的實施方式中，流動池一定具有開口以允許進一步的試劑加入。該開口一定經(jīng)設計以便其為短暫的，而且任何新液體的流動非常嚴密地受到控制以防止任何自流動池的滲漏，并防止流動池在加入任何新試劑時的污染。在某些實施方式的特定方面，例如涉及為用于需要嚴格控制的溫度調(diào)節(jié)的PCR或其他反應的那些，流動池裝備了溫度控制裝置以允許樣品和PCR混合物的快速加熱和冷卻(例如熱循環(huán))。通常地，流動池具備電氣加熱元件或帕爾帖(Peltier)器件。流動池也可經(jīng)配置(例如通過冷卻裝置的提供)以提供改進的空氣冷卻。溫度控制在;TC-105°C范圍內(nèi)對于大多數(shù)用途是足夠的。可涉及用于適當?shù)牧黧w傳輸裝置的許多布置。在優(yōu)選的實施方式中，提供許多處理流體(例如緩沖液、染色劑等)的儲液器，每個儲液器連接至抽吸機構(gòu)。優(yōu)選的抽吸機構(gòu)包括但不限于注射泵60，諸如由Hook和Tucker(Croydon，Surrey，英國)制造的那些，或具有搏出量ImL至IOmL的Kloen?？蔀槊總€處理流體儲液器提供一個這樣的泵60，或者可提供單個泵以利用多接口閥門布局從多個儲液器的各個中抽吸流體至可與入口30排列的多個注射針頭62、64、66、68。[0081]每個注射泵60相反能諸如通過通用連接器連接至中心管匯(centralmanifold)70(諸如通用連接器)。優(yōu)選地，中心管匯70通向選擇性多出口閥門72，以便于需要時，在多個樣品正被同時處理的情況下，每個樣品可用不同的處理流體或處理流體的組合處理。合適的選擇性多出口閥門是轉(zhuǎn)動閥門，諸如由Omnifit(劍橋，英國)供應的10出口轉(zhuǎn)動閥門。因而，來自多出口閥門72的每個出口可連接至單獨的流動池。需要時可并入一個或多個過濾器。通常地，過濾器位于每個儲液器和其相聯(lián)的注射泵之間?？赏ㄟ^計算機控制裝置單獨驅(qū)動每個注射泵60，或者可同時驅(qū)動兩個或更多個泵以提供兩種或更多種處理流體混合物。控制每個泵60的運轉(zhuǎn)率將因此控制所產(chǎn)生處理流體混合物的組成。在可選擇實施方式中，流體輸送裝置包括兩個或更多個活塞/HPLC型泵，每個泵由多個處理流體儲液器通過多入口閥門供應。合適的泵可以從例如Anachem(Luton，Bed,英國)得到。多入口閥門將是轉(zhuǎn)動閥門。每個泵將通向為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知類型的轉(zhuǎn)動混合器中，從而在需要時允許產(chǎn)生處理流體的可變組成混合物。在某些方面，處理流體或處理流體混合物然后穿過內(nèi)置過濾器，接著在注入流動池前通過選擇性多閥門出口(諸如轉(zhuǎn)動閥門)。作為以上定義的處理流體的通常“并行”供應的替代，處理流體可以被“串行”地供應，以便于，例如，液體自一基本上密閉的室通過至另一室。該實施方式具有優(yōu)點，即最小化所需試劑的量。在包括一個或多個閥門的本發(fā)明方面，通常地，閥門將是具有兩個入口和一個通向基本上密閉的流動池的出口的三向閥門。閥門入口之一間接地由處理流體儲液器供給。第二入口由通常是注射器、吸液管或微吸液管(一般100-5000μ1體積)的本地儲液器(localreservoir)供給。該本地儲液器可以被計算機控制裝置控制，或者可以人工控制。本地儲液器通常用在試劑罕見或昂貴的情況下。這樣的本地儲液器的提供最小化所需試劑的量，簡化了清洗，并提供了額外的靈活性，這樣每個流動池在需要時可以被單獨處理。在本發(fā)明的某些實施方式的具體方面，用于流動池反應的“流動”是通過重力、例如流動池成一定角度的放置、或者通過應用在流動池出口32上的吸附材料的使用而實現(xiàn)的。在實施方式的其他方面，使用或是機械的、或是電的裝置產(chǎn)生流動，例如將抽真空設備引入流動池的出口邊緣。在這樣的實施方式中的流動池可以是基本上密閉的，或者可具有可用的入口和出口兩者，以通過流動池轉(zhuǎn)移流體。在本發(fā)明實施方式的另一具體方面，流體在底部進入流動池，向上移動并通過頂部的流體出口流出流動池。然而，在優(yōu)選方面，流體從頂部進入流動池并通過重力被運載通過反應，從而通過底部的流體出口而流出流動池。流體出口能排空至普通的收集管道，所述管道排干至收集容器中。期望地是，該容器是可從設備上去除的，以允許定期的排空和/或清洗。根據(jù)本發(fā)明，為適應多種不相容的反應速度和待處理材料的體積，測序反應組件基本上是模塊化的，以致，如果大量流動池和/或所支撐樣品需要處理，附加的元件能容易地加至已有的裝備上。在這樣的實施方式中，系統(tǒng)的觀測組件以及測序反應組件能優(yōu)選地接受模塊化的流動池陣列，無論樣品是支撐在載玻片還是膜上。測序反應組件至本系統(tǒng)的可逆集成可包括至計算機控制裝置的連結(jié)，這能協(xié)同進行本系統(tǒng)功能元件的不同活動。計算機控制裝置能任選地控制兩個或更多個以下參數(shù)選擇驅(qū)動哪個或哪幾個泵；處理流體通過已開動的泵(多個泵)的絕對體積和流速；選擇向哪個流動池供給處理流體；設備內(nèi)所支持樣本的溫度；流動池自本系統(tǒng)測序反應設備向成像組件的移動；和不同事件的時機。本發(fā)明還涉及本發(fā)明流動池和/或設備的制造和本發(fā)明流動池和/或設備在處理支持物上樣品中的用途，以致本發(fā)明提供使用以上定義的流動池和/或自動化測序反應設備處理支持物上的樣品的方法；制備流動池的方法；和根據(jù)本發(fā)明制備松聯(lián)接的、可逆集成的、包括測序反應組件的系統(tǒng)的方法。本發(fā)明提供了用于本發(fā)明系統(tǒng)的測序反應組件結(jié)果鑒定的檢測組件。用于信號的檢測系統(tǒng)可取決于所用的標記部分，所述標記部分能被現(xiàn)有化學定義。可使用適于所運用的、能用在本發(fā)明系統(tǒng)檢測組件中的標記類型的任何檢測方法。因此，示例性檢測方法包括放射性檢測，光吸收檢測(例如紫外可見光吸收檢測)，光發(fā)射檢測(例如熒光或化學照射)。光學設置包括近場掃描顯微術(shù)，遠場共聚焦顯微術(shù)，寬視野表面照射，光散射，暗視野顯微鏡，光轉(zhuǎn)化，單光子和/或多光子激發(fā)，光譜波長識別，熒光團鑒定，隱失波照射和全內(nèi)反射熒光(TIRF)顯微術(shù)。標記的核酸分子能通過同步或次序(取決于所用的掃描方法)掃描全部或部分各基質(zhì)而在基質(zhì)上檢測到。為了熒光標記，基質(zhì)上所選區(qū)域可用熒光顯微設備逐個或逐行順序掃描，諸如Fodor(美國專利號5，445，934)和Mathies等(美國專利號5，091，652)所記載。能在應用這類分析和檢測表面上納米級結(jié)構(gòu)的技術(shù)的文獻中找到指南，如通過下列參考文獻所顯不:Reimer等編，ScanningElectronMicroscopy:PhysicsofImageFormationandMicroanalysis(掃描電鏡成像物理學和微分析)，第2版(Springer,1998)；Nie等，Anal.Chem.,78:1528_1534(2006)；Hecht等，JournalChemicalPhysics,112:7761-7774(2000)；Zhu等編，Near—FieldOpticsprinciplesandApplications(近場光學原則及應用)(WorldScientificPublishing,Singapore,1999)；Drmanac,國際專利公開W02004/076683；Lehr等，Anal.Chem.,752414-2420(2003)；Neuschafer等，Biosensors&Bioelectronics,18489-497(2003)；Neuschafer等，美國專利6，289，144，寸寸。用于本發(fā)明的一種具體成像技術(shù)是全內(nèi)反射熒光(TIRF)顯微術(shù)，其能用于使單熒光團(Cy-3或Cy-5標記的dNTPs)可視化。TIRF顯微術(shù)使用全內(nèi)反射激發(fā)光，并且檢測一般用隱失波照射和TIRF顯微術(shù)進行。隱失光場能在表面建立，以使例如熒光標記的核酸分子成像。當激光束在液體與固體基質(zhì)(如玻璃)之間的界面全反射時，激發(fā)光束僅穿透一小段距離的液體。換言之，光場在反射界面處并不會突然結(jié)束，但其強度隨距離指數(shù)性減少。該表面電磁場稱為“隱失波”，在液體中近界面處能選擇性地激發(fā)熒光分子。界面處的弱的隱失光場提供了低背景，并利于高信噪比下的單分子的可見波長檢測。這種技術(shù)的實例由Neuschafer等，美國專利6，289，144；Lehr等(上述引用的)；和Drmanac，國際專利公開W02004/076683所公開。EPI-熒光照射也能運用在本發(fā)明的檢測組件中。EPI-熒光顯微術(shù)是涉及用稱為熒光染料的、特殊類型的組織染色劑染色的技術(shù)，所述熒光染料在熒光標記的互補DNA序列雜交中被摻入。13[0096]TIRF和EPI照射都允許使用幾乎任何光源。光源可以是光柵的、擴展束、相干的、不相干的和源于單或多譜源的。在實施方式的一具體方面，成像可用Zeiss共聚焦顯微鏡200(ZeissAxiovert200)的使用TIRF或EPI照射的100X物鏡和1.3百萬像素Hamamatsuorca-er-ag或類似的系統(tǒng)組件來完成。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)也能用作檢測方案。在測序情況下，F(xiàn)RET—般記載于Braslavasky等，Proc.Nat'1Acad.Sci.，100:3960_3964(2003)，通過引用并入本文。本質(zhì)上，在一實施方式中，供體熒光團連接于引物、聚合酶或模板。為整合至引物所添加的核苷酸包括在兩者接近時被供體活化的受體熒光團。用于基于熒光的信號的、適當?shù)恼丈浜蜋z測系統(tǒng)為裝備有TIRF載玻片的、聯(lián)接至80毫瓦532nm固態(tài)激光器的Zeiss共聚焦顯微鏡200。載玻片通過以正確的TIRF照射角度安置的物鏡照射基質(zhì)。TIRF也能在沒有使用物鏡下、經(jīng)由光學聯(lián)接至基質(zhì)的棱鏡照射該基質(zhì)而完成。平面波導也能用以在基質(zhì)上實施TIRF。用于本成像系統(tǒng)的一實施方式含有具有1.25mm視場的20X透鏡，隨之檢測通過用10百萬像素相機而完成。這樣的系統(tǒng)使附著于1微米間距下的模式陣列的約1.5百萬核酸分子成像。在這布局下，每核酸分子有約6.4像素。每核酸分子的像素數(shù)量能通過增加或減少物鏡視野而被調(diào)節(jié)。例如，Imm視野將生成值為10的每核酸分子像素，并且2mm視野將生成值為2.5的每核酸分子像素。相對于物鏡的放大率和NA，可調(diào)節(jié)該視野，以生成能被光學和圖像分析軟件分辨的最低像素計數(shù)核酸分子?？赏ㄟ^減少物鏡放大能力、使用網(wǎng)格模式陣列和在每副圖像中增加所采集數(shù)據(jù)的像素數(shù)量改進成像速度。為獲取光學信號，光纖或電荷耦合器(chargedcoupledevice(CCD))的組合能用在測序反應的檢測中。因而，在特定實施方式中，由測序反應形成的陣列上的雜交模式用具有諸如Yershov等，Proc.Natl.Aca.Sci.93=4913(1996)中所記載的適當?shù)墓鈱W器件(Ploem,inFluorescentandLuminescentProbesforBiologicalActivity(焚光禾口發(fā)光生物活性探針)Mason，Τ.G.Ed.，AcademicPress,Landon,pp.1-11(1993))的CCD相機(例如型號TE/CCD512SF，PrincetonInstruments,Trenton,NJ.)掃描，這允許極大量的標記靶核酸的同步掃描。在具體實施方式中，測序系統(tǒng)的效率可通過多成像系統(tǒng)組件的使用而提高。例如，在系統(tǒng)成像組件中，優(yōu)選在10-16百萬像素范圍內(nèi)，可以使用到多達4個或更多個相機。多帶通濾光片(Multiplebandpassfilters)和二向色鏡也可用以采集跨多達4個或更多發(fā)射光譜的像素數(shù)據(jù)。為補償放大率減小的物鏡的較低的光采集能力，可以增加激發(fā)光源的能量。可通過使用一個或多個具有各自相機的流動池增加通量，以至當正雜交/反應樣品時成像系統(tǒng)不是閑置的。因為陣列的探針術(shù)可以是非連續(xù)的，所以可用多于一個的成像系統(tǒng)以采集來自一組陣列的數(shù)據(jù)，進一步減少陣列時間。一種照射模式是在成像器之間共享常見的一組單色光源(約四種激光器以獲取6-8種顏色)。每個成像器在任意給定時間采集不同波長下的數(shù)據(jù)，而光源會通過光學轉(zhuǎn)換系統(tǒng)轉(zhuǎn)換至成像器。在這樣的實施方式中，照射源優(yōu)選產(chǎn)生至少六種、但更優(yōu)選八種不同的波長。這樣的光源包括氣體激光器、通過纖維偶聯(lián)器組合的多二極管泵浦固態(tài)激光器(multiplediodepumpedsolidstatelasers)，濾過的氙弧燈，可調(diào)諧激光器，或更新穎的很快由TidalPhotonics提供的譜線光引擎(SpectralumLightEngine)。譜線光引擎使用棱鏡來從譜線上分離光。光譜被投射在TexasInstruments數(shù)字光處理器上，其能選擇性地反射任意部分光譜入纖維或光學連接器中。該系統(tǒng)能監(jiān)測并校準跨單個波長的能量輸出以使其一致，以便自動地補償在燈泡老化時或燈泡變化間的強度差異。成像過程期間，基質(zhì)必須保持對焦。保持對焦的一些關(guān)鍵因素是基質(zhì)的平面性、基質(zhì)與焦平面的正交性、和基質(zhì)上的可使其形變的機械作用力。基質(zhì)平面性能夠很好地控制，因為容易獲得超過1/4波平性的玻璃板?；|(zhì)上不平均的機械作用力能通過恰當?shù)碾s交室設計而最小化。與焦平面的正交性能夠通過良好調(diào)節(jié)的、高精確的鏡臺而實現(xiàn)。在每個成像獲得后，它將會用快速的算法來分析以確定圖像是否對焦。如果圖像焦點沒對準，自動對焦系統(tǒng)將儲存焦點沒對準的圖像的位置信息，以便那陣列部分能在下一個成像周期中重成像。通過基質(zhì)上不同地點的位置作圖，能減少用于基質(zhì)圖像獲取所需的時間。所測信號能人工或者優(yōu)選地通過適當?shù)挠嬎銠C方法分析以將結(jié)果制成表?；|(zhì)和反應條件可包括適當?shù)挠糜隍炞C雜交完整性和延伸條件和需要時用于提供關(guān)于定量的標準曲線的對照。例如，對照核酸能被加入樣品。在大規(guī)模的測序運行中，基于16百萬像素CXD的300毫秒曝光時間，每個成像器優(yōu)選獲取約200，000幅圖像/天。因此，用于本發(fā)明系統(tǒng)的照射和檢測組件儀器設計可包括四個成像器，每個服務于四組四元流動池(總計16個流動池)。每個成像器可包括具有10百萬像素的CCD探測器，并用于粗略300毫秒曝光時間。當其他熒光團正被成像時，被光源無意的光漂白能通過保持低照射能量和最短曝光時間來減少。通過使用強化的⑶D(ICXD)，用比標準CXD低數(shù)量級的照射強度和曝光時間采集幾乎同樣質(zhì)量的數(shù)據(jù)。ICCD—般在1-1.4百萬像素范圍內(nèi)可獲得。因為它們需要短得多的曝光時間，一百萬像素的ICCD能在標準CCD獲取一副圖像的時間內(nèi)獲取十副或更多的圖像。與快速濾光輪和高速流動池鏡臺聯(lián)合使用時，一百萬像素的ICCD能采集與10百萬像素標準CCD同樣量的數(shù)據(jù)。在具體的實施方式中，電子倍增(XD(EMCXD)用以核酸成像。EMCXD是定量數(shù)碼相機技術(shù)，能檢測單個光子事件同時保持高量子效率，其可經(jīng)由裝入傳感器的獨特的電子倍增結(jié)構(gòu)而實現(xiàn)。不同于常規(guī)CCD，EMCCD不受輸出放大器的讀出噪聲限制，即使在高讀出速度下操作時。這是通過添加固態(tài)電子倍增(EM)寄存器至正常串聯(lián)寄存器的末端而實現(xiàn)的；該寄存器使弱信號在任意讀出噪聲通過輸出放大器添入前被倍增，因此使讀出噪聲變得微不足道。EM寄存器有數(shù)百個使用高于正常時鐘電壓的級。當電荷通過各級轉(zhuǎn)移時，可利用碰撞電離現(xiàn)象以產(chǎn)生二次電子，并因此而EM增加。當這通過數(shù)百個級而完成時，所導致的增加可以被(軟件)控制從一倍到上百或甚至上千倍。EMC⑶系統(tǒng)可與TIFRM技術(shù)聯(lián)合，通過多譜線激光器系統(tǒng)的整合，優(yōu)選地具有聲光可調(diào)諧濾波器(Acousto-OpticalTunableFilter,A0TF)調(diào)節(jié)的固態(tài)激光器方案，用以多熒光團標記成像。該技術(shù)可容易為FRET分析所調(diào)整，優(yōu)選通過發(fā)射側(cè)的合適的光束分離器件的整合。在高分辨率和高速成像和測序化學相關(guān)的讀出中考慮到的因素為移動部件所導致的結(jié)果波動，震動如果不加以控制或隔離，能干擾圖像捕捉并導致圖像分辨率差。為最小化因移動部件(特別是具有機動夾持機構(gòu)8，8'的運載工具9)震動的影響，包括光學組件的表征工具7與反應平臺3特意為物理上松聯(lián)接。特別地，它們通過隔震器等在物理上互相分開，即使它們在運行上是并行的。這需要有控制和傳感機構(gòu)作為運載工具9的部分，以及位置登記機構(gòu)作為表征工具7的部分。多種這樣的機構(gòu)是在相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)的教導內(nèi)。例如機器人技術(shù)，其中電子眼、可被感知的比對標記等等用于確保轉(zhuǎn)移精確，不會引起過量的震動進入表征工具靈敏的視野，以允許連續(xù)或近乎連續(xù)的運行。目標是在連接兩種或更多種技術(shù)(包括有關(guān)力學、電子、光學和生化方面的批次處理)時，精確高效地采集并處理大量數(shù)據(jù)，迄今為止，所述技術(shù)還沒有被統(tǒng)一到高效的連續(xù)運行的分析方法中。雖然本發(fā)明由許多不同形式的實施方式滿足(如關(guān)于本發(fā)明優(yōu)選實施方式所詳述)，但是應理解，本公開內(nèi)容被認為是本發(fā)明原則的示例，并非意在將本發(fā)明限于本文所示和所述的具體實施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進行眾多變形而不偏離本發(fā)明精神。本發(fā)明范圍將僅通過任意相應專利申請和其等價物的權(quán)利要求書所衡量。摘要和名稱不應解釋為對本發(fā)明范圍的限制，因為其目的是使有關(guān)機構(gòu)以及公眾能快速確定本發(fā)明的一般性質(zhì)。在任意相應的專利申請的權(quán)利要求書中，除非使用術(shù)語“裝置”，否則該文所引用的特征或元件均不應被解釋為依據(jù)35U.S.C§112，II6的裝置加功能限定。權(quán)利要求用于高通量核酸測序的系統(tǒng)，其包括用于在反應單元中對核酸樣品進行生化測序反應的反應子系統(tǒng)；用于獨立于測序反應捕捉待用于光學圖像分析的測序反應光學圖像的分離的檢測子系統(tǒng)；和用于在反應平臺與檢測系統(tǒng)之間轉(zhuǎn)移核酸樣品的聯(lián)接子系統(tǒng)，借此所述反應平臺和所述檢測系統(tǒng)在可逆集成的系統(tǒng)中是物理上松聯(lián)接的。2.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中該反應子系統(tǒng)包括至少一個經(jīng)配置以允許多個分離的反應平臺互換使用的分離的反應平臺。3.如權(quán)利要求2所述的系統(tǒng)，其中該反應平臺包括多個反應單元，每個反應單元包括至少一個可從所述反應平臺去除的單個流動池。4.如權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其中所述聯(lián)接子系統(tǒng)包括具有夾持機構(gòu)的運載器件，所述運載器件是可操作的，以從所述至少一個分離的反應平臺中的一所選平臺選擇和運輸所述反應單元至所述檢測子系統(tǒng)，所述選擇和運輸獨立于任何其它的分離的反應平臺。5.如權(quán)利要求4所述的系統(tǒng)，其中所述夾持機構(gòu)包括可移動的臂，所述臂可繞垂直于所述反應平臺的工作區(qū)的軸旋轉(zhuǎn)。6.如權(quán)利要求4所述的系統(tǒng)，還包括用于儲存檢測和處理試劑以及用于將所述檢測和處理試劑轉(zhuǎn)移至所述流動池的流體學子系統(tǒng)。7.如權(quán)利要求4所述的系統(tǒng)，其中多個所述的反應平臺相對于所述檢測子系統(tǒng)彼此鄰近地并排放置。8.如權(quán)利要求4所述的系統(tǒng)，其中多個所述的反應平臺相對于所述檢測子系統(tǒng)彼此鄰近地首尾放置。9.如權(quán)利要求4所述的系統(tǒng)，其中所述的至少一個反應平臺是可操作的，以將所述核酸樣品制備為熒光測序反應產(chǎn)物用于光學觀測，和其中所述的檢測子系統(tǒng)是可操作的，以捕捉多個熒光反應產(chǎn)物的彩色圖像用于計算機輔助識別。10.處理和檢測核酸自動化測序反應的方法，包括將多個流動池放置在反應平臺上，每個流動池包括多個可辨別的反應位點和附著于所述多個反應位點的多個核酸樣品；將處理試劑注入所述流動池；使所述處理試劑與所述核酸樣品反應處理時段，以引發(fā)測序反應產(chǎn)生熒光測序產(chǎn)物；此后使用物理上與檢測子系統(tǒng)松聯(lián)接的自動化聯(lián)接子系統(tǒng)，將所述流動池從所述反應平臺轉(zhuǎn)移至所述檢測子系統(tǒng)；在所述檢測子系統(tǒng)照射所述流動池，以使所述熒光測序產(chǎn)物在所述可辨別的反應位點發(fā)出可辨別光譜熒光；和捕捉來自所述流動池中可辨別反應位點的熒光的彩色圖像用以鑒定核酸序列，其中所述捕捉步驟的持續(xù)基本上短于所述反應步驟。專利摘要用于自動化高通量核酸測序的可擴展反應與檢測系統(tǒng)，所述自動化高通量核酸測序涉及化學過程和獨立于化學過程的觀測過程的組合。分離的功能單元可以以如下方式配置，所述方式允許所述系統(tǒng)互換使用聯(lián)合用于光學圖像采集和/或分析的分離的設備組件的不同的測序反應組件。文檔編號C12M1/00GKCN101910399SQ200880123537公開日2010年12月8日申請日期2008年10月30日發(fā)明者阿諾德·歐力分特申請人:考利達基因組股份有限公司導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan