專(zhuān)利名稱(chēng):以rhDSL重組蛋白擴(kuò)增造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
的細(xì)胞擴(kuò)增方法，特別的是一種以rhDSL重組 蛋白擴(kuò)增造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
iS^jft,l&ik^MM^M (Haematopoietic stem cell transplantation, HSCT) 已成為治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤、實(shí)體瘤、自身免疫系統(tǒng)疾病及某些基因缺陷疾病的重要手 段之一。造血干細(xì)胞主要來(lái)源于骨髓、臍帶血及動(dòng)員后的外周血。盡管與其他來(lái)源的干細(xì) 胞相比，臍血干細(xì)胞具有來(lái)源豐富、抗原性弱、移植后并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)，但又存在數(shù)量不足 的缺陷，造成了成人移植的限制。為得到治療所需的細(xì)胞數(shù)量，研究人員試圖通過(guò)不同手 段對(duì)HS/PCs進(jìn)行規(guī)?；瘮U(kuò)增。但是目前常用的方法擴(kuò)增HS/PCs (Haematopoietic Stem/ ProgenitorCells)的效率十分有限，而且HS/PCs在體外擴(kuò)增的過(guò)程中自我更新能力下降 并顯示出分化的特征，導(dǎo)致其歸巢和長(zhǎng)期造血重建能力的降低，所以從根本上解決HSCT面 臨的供體嚴(yán)重短缺已成為亟待解決的問(wèn)題。
Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路廣泛存在于脊椎和非脊椎動(dòng)物中，是影響細(xì)胞決定的重要通 路之一，在進(jìn)化上具有高度的保守性。Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路由Notch受體、配體及其下游的 信號(hào)傳導(dǎo)共同組成。相鄰細(xì)胞間通過(guò)Notch受體傳遞信號(hào)可以調(diào)節(jié)包括干細(xì)胞在內(nèi)的多種 細(xì)胞的分化、增殖和凋亡，影響器官形成和形態(tài)發(fā)生。
干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新(self-renewing)和多向分化潛能的細(xì)胞，能夠產(chǎn)生 高度分化的功能細(xì)胞。Notch信號(hào)對(duì)多潛能干細(xì)胞的定向分化和自身復(fù)制具有決定性的調(diào) 控作用。以干細(xì)胞為中心的再生醫(yī)學(xué)是用功能正常的細(xì)胞或組織替代功能減退或受損的 細(xì)胞組織，將定向分化后的細(xì)胞用于治療阿爾茨海默癥、帕金森病、糖尿病、白血病等疾病， Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路通過(guò)調(diào)節(jié)干細(xì)胞的分化增殖將在這一領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。在少數(shù)情 況下，例如神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的過(guò)程中，Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路具有促進(jìn)分化作 用。對(duì)于其它多種干細(xì)胞而言，當(dāng)Notch受體與其配體結(jié)合時(shí)，干細(xì)胞進(jìn)行非分化性增殖； 而當(dāng)Notch信號(hào)活性被抑制時(shí)，干細(xì)胞進(jìn)入分化程序，發(fā)育為功能細(xì)胞，Notch信號(hào)傳導(dǎo)通 路目前被認(rèn)為是解決干細(xì)胞擴(kuò)增的最有前途的研究方向之一。目前，Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路在 干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用主要集中在通過(guò)活化Notch信號(hào)通路進(jìn)行干細(xì)胞的體外擴(kuò)增培 養(yǎng)。在干細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，活化Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑可以調(diào)控其增殖分化從而服務(wù)于以干 細(xì)胞生物治療和組織工程，其策略主要是在含有可溶性配體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干/祖細(xì)胞、 或者將配體結(jié)合于固相表面以模擬體內(nèi)配體的跨膜結(jié)構(gòu)來(lái)培養(yǎng)干/祖細(xì)胞。由于每一種 類(lèi)型的細(xì)胞需要與其相適應(yīng)的含有適量細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的獨(dú)特培養(yǎng)條件，所以通過(guò)激 活Notch通路來(lái)維持干細(xì)胞的培養(yǎng)和進(jìn)行組織工程的研究還存在一些困難，盡管如此，在 造血干細(xì)胞的培養(yǎng)中，通過(guò)激活Notch通路來(lái)維持干細(xì)胞的自我更新已經(jīng)取得了一定的進(jìn) 展。魯茁壯等(中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2003，11 (3) :222 226)克隆表達(dá)了人Notch配體 Delta-likel(hDlll)的胞外區(qū)(hDlI-Iext)，并經(jīng)集落培養(yǎng)檢測(cè)證實(shí)其對(duì)原始的造血祖細(xì)胞
4具有擴(kuò)增作用。Han等(Blood，2000，95 (5) :1616 1625)構(gòu)建了來(lái)自于人hDlll的可溶 性重組蛋白hDlll·、由DSL結(jié)構(gòu)域及N-端序列構(gòu)成)，經(jīng)小鼠細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在聯(lián)合 其它細(xì)胞因子的情況下，可以抑制造血干細(xì)胞的分化并促進(jìn)其增殖。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人的 Notch 配體有 Jaggedl、Jagged2、DeltaU Delta3、Delta4。 Notch配體的胞外區(qū)含有數(shù)量不等的EGF樣重復(fù)序列以及N端保守的DSL (Delta/Serrate/ Lag2)結(jié)構(gòu)域，該DSL結(jié)構(gòu)域在結(jié)合與活化Notch受體的過(guò)程中起關(guān)鍵作用。來(lái)自于野 生Notch配體的重組蛋白或者多肽被認(rèn)為是有效的Notch激活劑。體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，從 JaggedUDeltal中衍生而來(lái)的重組蛋白及多肽具有Notch激活特性(Shimizu K, et al. J Biol Chem,1999,274(46) :32961 32969)。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)為CN101096654A，發(fā)明名稱(chēng)為 “以GST-hDSL重組蛋白增殖人造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞的方法”，該專(zhuān)利提及的方法步驟為 "(1)從髓、外周血或臍帶血中取樣，用密度梯度離心分離出單核細(xì)胞，然后用CD34分離試 劑盒對(duì)CD34細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，采用免疫磁珠技術(shù)對(duì)CD34細(xì)胞進(jìn)行純化，得到CD34+細(xì)胞；(2) 采用含10% -20%胎?；蛉搜宓募?xì)胞培養(yǎng)基對(duì)上述CD34+細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，加入細(xì)胞因子， 加入蛋白，培養(yǎng)1周，換入細(xì)胞培養(yǎng)基，并重新加入蛋白再繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增1周，得到增殖了的 造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞。，，該發(fā)明中使用的GST-hDSL相對(duì)本發(fā)明中的rhDSL重組蛋白，分子量 大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不利于相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作中的使。且該發(fā)明中對(duì)造血干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增時(shí)間為一 周，擴(kuò)增時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能影響了造血干/祖細(xì)胞的分化潛能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種以rhDSL重組蛋白擴(kuò)增造血干 細(xì)胞及祖細(xì)胞的方法，首次將rhDSL運(yùn)用于人臍血干細(xì)胞及祖細(xì)胞的擴(kuò)增，并提供優(yōu)化了 的擴(kuò)增條件，為Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路在造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增中的應(yīng)用和發(fā)展提供了實(shí)驗(yàn)基 石出。
本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括如下步驟
第一步，rhDSL重組蛋白的制備首先構(gòu)建rhDSL的重組表達(dá)質(zhì)粒pQE30_hDSL，然 后以大腸桿菌DH5ci為宿主表達(dá)rhDSL，并采用Q S印harose陰離子交換層析與金屬離子 Ni2+親和層析相結(jié)合的純化方法進(jìn)行rhDSL重組蛋白的純化，得到rhDSL重組蛋白。
所述rhDSL重組蛋白，為含有6 XHis (組氨酸)標(biāo)簽的Notch配體Delta-Iike-I 的衍生多肽。
所述的衍生多肽，由含有進(jìn)化中的保守結(jié)構(gòu)區(qū)DSL和與之相鄰的N-端的50個(gè)氨 基酸構(gòu)成，共99個(gè)氨基酸，其氨基酸序列為L(zhǎng)HTDSPDDLATENPERLISRLATQRHLTVGEEWSQDLHS SGRTDLKYSYRFVCDEHYYGEGCSVFCRPRDDAFGHFTCGERGEKVCNPGWKGPYCTEPI。
所述構(gòu)建rhDSL的重組表達(dá)質(zhì)粒pQE30_hDSL，是指以重組質(zhì)粒pGEX_2T/ hDSL (林小娟等，現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，8 (4) 612)為模板，PCR的方法擴(kuò)增hDSL基因片 段，包括進(jìn)化中的保守結(jié)構(gòu)區(qū)DSL和與之相鄰的N-端的50個(gè)氨基酸，共99個(gè)氨基酸，共 298bp。割膠回收后的PCR目的產(chǎn)物和原核表達(dá)質(zhì)粒pQE30(含6XHis標(biāo)簽)經(jīng)限制性內(nèi) 切酶HindIILBamH I雙酶切。連接割膠回收后的酶切產(chǎn)物，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到預(yù)先制備 的DH5ci感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序證實(shí)無(wú)突變且讀框正確。(以上為常規(guī)技術(shù)和條件，可以重復(fù)實(shí)施)
所述以大腸桿菌DH5 α為宿主表達(dá)rhDSL重組蛋白，是指挑取轉(zhuǎn)化有 pQE30-hDSL質(zhì)粒的DH5a的單菌落，25 30mL LB培養(yǎng)基(含100 μ g/mL Amp)，37°C振蕩培 養(yǎng)過(guò)夜；次日將過(guò)夜菌液按2%的接種量轉(zhuǎn)接到IL 2L的LB培養(yǎng)基(含100 μ g/mL Amp) 內(nèi)，轉(zhuǎn)接后37°C培養(yǎng)2. 5 3. Oh左右，待0D600 = 0. 6 0. 8的時(shí)候停止培養(yǎng)，加入IPTG 至終濃度為ImM，誘導(dǎo)表達(dá)4h，收集菌體。
所述rhDSL重組蛋白的純化，是指收集的菌體經(jīng)超聲裂解和溶菌酶裂解細(xì)菌后， 高速離心，收集沉淀包涵體(表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在)。包涵體經(jīng)8M尿素變性后，用稀 釋法緩慢復(fù)性。取復(fù)性后的上清液經(jīng)Q Sepharose陰離子交換層析，得到初步純化的rhDSL 重組蛋白。將陰離子交換層析后所得蛋白溶液進(jìn)一步通過(guò)金屬離子(Ni2+)親和層析并透 析，得到高純度(純度>99%)低內(nèi)毒素含量(鱟試劑測(cè)定內(nèi)毒素含量為0. 117EU/yg)的 rhDSL重組蛋白。
第二步，在HS/PCs體外培養(yǎng)體系中加入rhDSL重組蛋白及早期造血因子，采用這 兩者結(jié)合擴(kuò)增造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞。
所述rhDSL重組蛋白通過(guò)Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的擴(kuò)增。
所述rhDSL重組蛋白擴(kuò)增濃度為0. 5 μ g/ml 4. 5 μ g/mL·
所述rhDSL重組蛋白最佳擴(kuò)增濃度為1. 5 μ g/mL·
所述早期造血因子為干細(xì)胞因子，濃度為20ng/ml。
所述rhDSL重組蛋白及早期造血因子的結(jié)合擴(kuò)增造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的時(shí)間為 0 7天。
所述rhDSL重組蛋白及早期造血因子的結(jié)合擴(kuò)增造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的最佳時(shí) 間為2. 5天。
本發(fā)明所述rhDSL重組蛋白衍生于Notch配體Delta-like-1，包括進(jìn)化中的保守 結(jié)構(gòu)區(qū)DSL和與之相鄰的N-端的50個(gè)氨基酸。通過(guò)與早期造血因子相結(jié)合，所述rhDSL 重組蛋白，經(jīng)體外檢測(cè)細(xì)胞計(jì)數(shù)、⑶34及⑶38表面抗原的檢測(cè)、集落形成實(shí)驗(yàn)包括總CFU、 HPP-CFU、GM-CFU 計(jì)數(shù)以及進(jìn)一步的連續(xù)稀釋擴(kuò)增(sequential dilution expansion)檢 測(cè)證明，具有造血干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增特性。
在HS/PCs體外培養(yǎng)體系(DMEM/F-12，15% FBS)中加入rhDSL和/或KL，在分別 培養(yǎng)了 2. 5天、4. 5天、6. 5天后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡計(jì)數(shù)、集落培養(yǎng)、⑶34+檢測(cè)，比較不同組 之間的結(jié)果差異。結(jié)果表明，與單加KL相比，rhDSL與KL聯(lián)合作用明顯使HS/PCs數(shù)量得到 了擴(kuò)增，該擴(kuò)增作用具有時(shí)間及劑量依賴性，1. 5 μ g/ml的rhDSL的擴(kuò)增效果較好，培養(yǎng)2. 5 天的擴(kuò)增效果為最佳(見(jiàn)表1)。選擇最佳的培養(yǎng)時(shí)間，對(duì)擴(kuò)增后的細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)稀釋擴(kuò)增 (sequential dilutionexpansion)，進(jìn)一步檢測(cè)造血干/祖細(xì)胞經(jīng)藥物作用后分化潛能的 維持狀況。結(jié)果表明，rhDSL實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在除去藥物后細(xì)胞的分化潛能較高。
本發(fā)明中rhDSL的運(yùn)用可有效擴(kuò)增HS/PCs數(shù)量并維持其分化增殖的潛能。相對(duì)其 他文獻(xiàn)報(bào)道的Notch配體固定化擴(kuò)增HS/PCs的方法，rhDSL可以可溶形式直接進(jìn)行HS/PCs 的擴(kuò)增培養(yǎng)，具有方法簡(jiǎn)便易行，成本較低的特點(diǎn)。同時(shí)，rhDSL的分子量遠(yuǎn)低于另一可溶 形式的重組蛋白GST-hDSL，大大降低了擴(kuò)增中使用的藥物劑量，節(jié)約成本。對(duì)于通過(guò)Notch 信號(hào)傳導(dǎo)通路解決臨床HSCT所面臨的細(xì)胞數(shù)量不足，rhDSL提供了一種新的選擇。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例中rhDSL重組蛋白的純化示意圖；
其中
(A)Q Sepharose FF陰離子交換純化rhDSL。M 蛋白標(biāo)志物；1 洗脫液；
(B)離子交換層析后rhDSL的親和純化M 蛋白標(biāo)志物；1 洗脫液；
(C)陰離子交換層析與親和層析純化后蛋白的銀染檢測(cè)M 蛋白標(biāo)志物；1 純化 后的rhDSL。
圖2為連續(xù)稀釋擴(kuò)增法測(cè)定擴(kuò)增后細(xì)胞的分化潛能示意圖；
其中臍血來(lái)源的⑶34+細(xì)胞分四組經(jīng)不同濃度rhDSL進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，分組 為(l)KL(20ng/ml)(對(duì)照組)，(2) KL (20ng/ml) +rhDSL (0. 5 μ g/ml), (3)KL(20ng/ ml)+rhDSL(l. 5μ g/ml)，(4) KL (20ng/ml) +rhDSL (4. 5 μ g/ml)。2. 5 天后，以連續(xù)稀釋擴(kuò)增 法測(cè)定擴(kuò)增后細(xì)胞的分化潛能，即將藥物洗去，繼續(xù)以KL，ΤΡ0, FL, IL-3(濃度均為IOng/ mL)進(jìn)行長(zhǎng)期液體培養(yǎng)，其間每隔7天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、集落形成細(xì)胞包括總CFU、HPP-CFU、 GM-CFU計(jì)數(shù)，計(jì)算相應(yīng)細(xì)胞對(duì)于0天未擴(kuò)增前的擴(kuò)增倍數(shù)。A 細(xì)胞數(shù)；B :總CFU ；C HPP-CFU ；D :GM-CFU。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前 提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下 述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，所用的試劑均 可以在市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)。
設(shè)備和試劑[0034]1FACSCalibur (流式細(xì)胞儀)美國(guó) Becton Dickinson(BD)公司[0035]2MiniMACSTM細(xì)胞分選器/MACS分選架德國(guó)美天旎生物技術(shù)有限公司[0036]3蛋白純化分析儀(AKTA PURIFIER-10)，pharmacia公司產(chǎn)品[0037]4超聲波細(xì)胞粉碎儀(Sonipr印150)，三洋公司產(chǎn)品[0038]5核酸蛋白電泳儀(Power pac Basic)，Bio-Rad公司產(chǎn)品[0039]6凝膠圖像處理系統(tǒng)(TanonGIS-2008)，上海天能科技有限公司[0040]7原核表達(dá)載體PQE30，Qiagene[0041]8限制性內(nèi)切酶 BamH I、HindIII，IOXBuffer (酶切)，T4DNA 連接酶，10XT4DNA
Ligase Buffer, Ferments 公司產(chǎn)品
9. 10 X PCR Buffer,Mg2+ (25mM)，dNTP (2mM)，Tag DNA 聚合酶，上海生工生物工程技 術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品
10.試劑盒華舜小量PCR產(chǎn)物純化試劑盒；天為時(shí)代瓊脂糖凝膠DNA回收試劑 盒；V-gene日常型質(zhì)粒DNA小量快速制備試劑盒；
11.Q Sepharose Fast Flow, Amersham 產(chǎn)品
12. HIS-Select Nickel Affinity Gel，Sigma 產(chǎn)品
13.臍血樣品上海市國(guó)際和平婦幼保健院，自愿者捐贈(zèng)的健康足月分娩兒臍血，枸櫞酸鈉抗凝
14. Ficoll分離液分離臍血，密度1. 077士0. 002g/mL，上海華精生物高科技有限 公司
15. DMEM/F-12(Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium/Nutrient F-12Ham' s, 1: IMixture)，SIGMA 公司產(chǎn)品
16.甲基纖維素(Methyl Cellulose, MC)美國(guó) SIGMA 公司產(chǎn)品
17. IMDM(Iscove' s Modified Dulbcco' s Medium)美國(guó) GIBCO 公司產(chǎn)
18.胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)美國(guó) HyClone 公司
19.細(xì)胞因子 FL、TPO、IL-3、FcR-blocking Reagent、CDlIb-PE, CD14-PE 美國(guó) eBioscience 公司
20. EPO 益比奧重組人紅細(xì)胞生成素注射液，10000U/瓶，沈陽(yáng)三生制藥股份有限 公司
21. GM-CSF 特爾立注射用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子，1 X 150 μ g，廈門(mén) 特寶生物工程股份有限公司
22.抗體 IgG-PE/FITC (陰性對(duì)照)、CDIM-FITC、CD38-PE =Caltag
23. PI (Propidium Iodicle，碘化丙錠)=Sino-American Biotec
24. Bufferl :PBS/2% FBS orO. 5% BSA(CD marker 緩沖液 / 溶解細(xì)胞因子)
i. Buffer2 :PBS/2% FBS/2 μ g/mL PI (CD marker 染液)
ii. Buffer3 :PBS/0. 5% BSA/2mM EDTA(磁性分選緩沖液)
25.雙抗(加于培養(yǎng)基)100U/mL的青霉素和100 μ g/mL的鏈霉素 實(shí)施例IrhDSL重組蛋白的制備
以克隆質(zhì)粒pGEX_2T/hDSL為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增目的片段hDSL。割膠回收后 的PCR目的產(chǎn)物和原核表達(dá)質(zhì)粒PQE30經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII、BamH I雙酶切。連接割 膠回收后的酶切產(chǎn)物，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到預(yù)先制備的DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽(yáng)性克 隆，經(jīng)測(cè)序證實(shí)無(wú)突變且讀框正確。(以上為常規(guī)技術(shù)和條件)
挑取轉(zhuǎn)化有pQE30_hDSL質(zhì)粒的DH5a的單菌落，25 30mL LB培養(yǎng)基(含100 μ g/ mL Amp)，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；次日將過(guò)夜菌液按2%的接種量轉(zhuǎn)接到IL 2L的LB培養(yǎng)基 (含100 μ g/mL Amp)內(nèi)，轉(zhuǎn)接后37°C培養(yǎng)2. 5 3. Oh左右，待0D600 = 0. 6 0. 8的時(shí)候 停止培養(yǎng)，加入IPTG至終濃度為ImM，誘導(dǎo)表達(dá)4h，收集菌體。用30mL預(yù)冷1 XPBS洗滌菌 體。收集的菌體用 30mL 預(yù)冷 Sonicatebuffer (PBS，ImM EDTA, 5mM DTT, 0. ImM PMSF，pH7. 3) 重懸，經(jīng)超聲裂解(中等程度超聲，每次超聲30sec、停30sec，共20次)和溶菌酶(100 μ g/ mL)裂解細(xì)菌后，高速離心，收集沉淀包涵體。每g包涵體用18mL Pellet Wash Buffer (PBS, 1% Triton X-100，IOmM EDTA, 50mM NaCl，100 μ M PMSF，pH7. 3)洗滌 3 次。
洗滌后的包涵體用Buffer/Urea (8M urea, 50mM Tri s_HCl，lmM EDTA, 50mM NaCl， 0. ImM PMSF，pH8. 5)變性，離心取上清。將上清緩慢滴加到10倍體積的復(fù)性液Alkaline Buffer A(50mM NaH2PO4,0. ImM PMSF,pH10. 7)內(nèi)，Alkaline Buffer A(50mM NaH2PO4,0. ImM PMSF, pHlO. 7)內(nèi)，再將復(fù)性液同體積的稀釋液(20mM Tris_HCl，0. ImM PMSF, ρΗ8. 0)緩慢 加入復(fù)性蛋白液中。
用Wash Buffe (20mM Tris_HCl，pH9. 1)平衡后的Q S印harose 陰離子柱后，將復(fù)性后的上清過(guò)柱純化，用elution buffer (20mM Tris_HCl，lM NaCl，pH9. 1)梯度洗脫，得到初 步純化的 rhDSL 重組蛋白。用 IXHis-Tag BindingBuffer(0. 05M imidazole，0. 5M NaCl, 20mM Tris, pH8. 5)平衡金屬離子(Ni2+)，將陰離子交換層析后所得蛋白溶液過(guò)柱純化，用 IXHis-Tag ElutionBuffer (0. 2M imidazole，0. 5M NaCl, 20mM Tris, ρΗ8· 5)洗脫目的蛋 白，得到高純度(純度>99 % )的rhDSL重組蛋白。
如圖1所示。(A)為Q Sepharose FF陰離子交換純化后的結(jié)果，可見(jiàn)純化后的蛋白 液中含有雜蛋白。(B)為離子交換層析后再經(jīng)親和純化的結(jié)果，可見(jiàn)rhDSL純度較高，未見(jiàn) 雜蛋白。(C)為陰離子交換層析與親和層析純化后蛋白的銀染檢測(cè)，蛋白上樣量為lOOng， 未見(jiàn)雜帶。因銀染檢測(cè)蛋白的靈敏度為0. 3ng,因此純化后rhDSL重組蛋白的純度>99%。
實(shí)施例2臍血單個(gè)核細(xì)胞(mono-nuclear cells, MNC)的獲取和⑶34+細(xì)胞的分 離純化
臍血樣品，用枸櫞酸鈉抗凝，采取Ficoll分離液分離臍血，獲得臍血單個(gè)核細(xì)胞 (許文榮，胡嘉波，顧可梁，等.臍血造血干/祖細(xì)胞的密度分離實(shí)驗(yàn)研究[J].臨床檢驗(yàn) 雜志· 2001，19(2) :73-76)。按300 μ L/108細(xì)胞的量加入Buffer3，重新懸浮細(xì)胞后待用。 Buffer3 :PBS/0. 5% BSA/2mM EDTA(磁性分選緩沖液)
⑶34+細(xì)胞的分選步驟
(1)免疫磁珠標(biāo)記
加入FcR-blocking Reagent (100 μ L/108 細(xì)胞)，輕柔混勻，再加入抗 CD34+ 磁珠 (100μ L/108細(xì)胞)，輕柔充分混勻，4°C冰箱孵育30min，期間每隔IOmin取出，手動(dòng)輕柔振 蕩使磁珠與細(xì)胞充分接觸；
(2) MS+分離柱的準(zhǔn)備
將MiniMACS磁鐵用酒精消毒，連接到MiniMACS架子上，將MS+分離柱放入 MiniMACS磁鐵中，柱下接一 15mL無(wú)菌離心管。分離細(xì)胞前在柱頂上加入500 μ L buffer3 潤(rùn)洗柱子；
(3) MS+分離柱陽(yáng)性分選
將標(biāo)記好的細(xì)胞懸液加到柱上，收集的流出物為陰性成分，用bufferf洗滌分離 柱3次，每次500 μ L。加ImL buffer3于分離柱中，將其取下，置于一新的15mL無(wú)菌離心管 上，用活塞將⑶34+細(xì)胞洗脫；
(4)第二次過(guò)柱分選
為了提高CD34+細(xì)胞的純度，可進(jìn)行第二次過(guò)柱，重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟(3)；
(5)收集到的細(xì)胞用DMEM/F-12培養(yǎng)基(含15% FBS,雙抗)，懸浮混勻，計(jì)數(shù)并離 心(2000rpm,IOmin)；
(6)去除上清，加入一定量DMEM/F_12(含15% FBS，雙抗)培養(yǎng)基重懸，取出部分 細(xì)胞用于純度測(cè)定，其余按實(shí)驗(yàn)需要加入藥物或細(xì)胞因子進(jìn)行分組培養(yǎng)。
實(shí)施例3流式測(cè)定表面標(biāo)志的表達(dá)(⑶34/⑶38)——樣品處理
(1)按彡2X IO4的量吸取細(xì)胞懸液于1. 5mL離心管，室溫離心(2000rpm, IOmin)；
(2)吸去上清，100 μ L bufferl 重懸，加入 2 μ L FcR-blocking Reagent,輕柔混 勻；
(3)分別加入 2 μ L IgG-FITC Isotype Control、CD34-FITC 或 IgG-PE
9[0084]Isotype Control、CD34-PE ；
(4) 4°C避光孵育 3Omin ；
(5)取出，加入 ImL bufferl 洗滌一遍(2000rpm，IOmin)；
(6)加入300 μ L bufferl重懸細(xì)胞，移入流式管；
(7)4°C保存，當(dāng)天進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)施例4rhDSL對(duì)臍血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增作用的條件優(yōu)化
此次實(shí)驗(yàn)分為四組，對(duì)實(shí)施例2得到的⑶34+細(xì)胞進(jìn)行短期擴(kuò)增培養(yǎng)。四組分 別是(l)KL(20ng/ml)(對(duì)照組)，(2) KL (20ng/ml) +rhDSL (0. 5 μ g/ml), (3)KL(20ng/ ml)+rhDSL(l. 5μ g/ml), (4) KL (20ng/ml) +rhDSL (4. 5 μ g/ml).采用 24 孔培養(yǎng)板，每孔添 加培養(yǎng)基15% FBS的DMEM/F-12，另外附加各種細(xì)胞因子或藥物溶液，終體積為lmL，細(xì)胞 密度為8. 5X 104/mL。置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱，全濕條件下培養(yǎng)。第一輪分別培養(yǎng)2. 5天、 4. 5天、6. 5天后，收集各孔細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡計(jì)數(shù)、集落培養(yǎng)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)⑶34、⑶38 抗原表達(dá)等各項(xiàng)指標(biāo)，計(jì)算相應(yīng)細(xì)胞對(duì)于0天未擴(kuò)增前的擴(kuò)增倍數(shù)。集落培養(yǎng)第0天將 磁柱分離后的CD34+細(xì)胞2X IO3鋪于MC培養(yǎng)基中，加入細(xì)胞因子KL(50ng/l. 5mL MC)， IL-3(10ng/l. 5mL MC)，GM-CSF(10ng/l. 5mL MC)，EP0(3U/1.5mL MC)。37°C，5% CO2，全濕 條件下培養(yǎng)，14天后進(jìn)行集落的計(jì)數(shù)。實(shí)結(jié)果如表1所示。
2. 5天時(shí)，與對(duì)照組相比，rhDSL (1. 5 μ g/ml)組總細(xì)胞數(shù)及⑶34+細(xì)胞數(shù)分別顯著 性擴(kuò)增1. 57及1. 68倍，總CFU、HPP-CFU及GM-CFU也分別顯著性擴(kuò)增1. 31、1. 79及1. 39 倍。4. 5 天后，rhDSL (1. 5 μ g/ml)組總細(xì)胞、CD34+ 細(xì)胞數(shù)、總 CFU、HPP-CFU 及 GM-CFU 較 對(duì)照組也有顯著性增加。6. 5天時(shí)，rhDSL組總細(xì)胞、⑶34+細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組減少。各組 ⑶34+CD38_細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比無(wú)顯著性變化，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，⑶34+CD38_細(xì)胞 數(shù)呈降低趨勢(shì)，說(shuō)明延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間增加了造血干/祖細(xì)胞的分化。因此，確定2. 5天是最佳 培養(yǎng)條件。
表1造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增效率
權(quán)利要求
1. 一種以rhDSL重組蛋白擴(kuò)增造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞的方法，其特征在于，包括如下步驟第一步，rhDSL重組蛋白的制備首先構(gòu)建rhDSL的重組表達(dá)質(zhì)粒pQE30_hDSL，挑取轉(zhuǎn) 化有pQE30-hDSL質(zhì)粒的DH5 α的單菌落，25 30mL含100 μ g/mLAmp的LB培養(yǎng)基，37°C 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；次日將過(guò)夜菌液按2%的接種量轉(zhuǎn)接到IL 2L的含100 μ g/mL Amp的LB 培養(yǎng)基內(nèi)，轉(zhuǎn)接后37 °C培養(yǎng)2. 5 3. Oh左右，待0D600 = 0. 6 0. 8的時(shí)候停止培養(yǎng)，加 入IPTG至終濃度為ImM，誘導(dǎo)表達(dá)4h，收集菌體，用30mL預(yù)冷1 XPBS洗滌菌體，收集的菌 體用30mL預(yù)冷Sonicate buffer重懸，經(jīng)超聲裂解和100 μ g/mL的溶菌酶裂解細(xì)菌后，高 速離心，收集沉淀包涵體，每克包涵體用18mL Pellet Wash Buffer洗滌3次；洗滌后的包涵體用Buffer/Urea變性，離心取上清，將上清緩慢滴加到10倍體積的復(fù) 性液Alkaline Buffer A內(nèi)，再將復(fù)性液同體積的稀釋液緩慢加入復(fù)性蛋白液中；用Wash Buffer平衡Q S印harose陰離子柱后，將復(fù)性后的上清過(guò)柱純化，用elution buffer梯度洗脫，得到初步純化的rhDSL重組蛋白，之后采用金屬離子Ni2+親和層析純化， 用IXHis-Tag Binding Buffer平衡金屬離子Ni2+，將陰離子交換層析后所得蛋白溶液過(guò) 柱純化，用IXHis-Tag Elution Buffer洗脫目的蛋白，得到純度> 99%的rhDSL重組蛋 白；所述構(gòu)建rhDSL的重組表達(dá)質(zhì)粒pQE30-hDSL是指以重組質(zhì)粒pGEX_2T/hDSL為模板， PCR的方法擴(kuò)增hDSL基因片段，包括進(jìn)化中的保守結(jié)構(gòu)區(qū)DSL和與之相鄰的N-端的50個(gè) 氨基酸，共99個(gè)氨基酸，共298bp，割膠回收后的PCR目的產(chǎn)物和含6 XHis標(biāo)簽的原核表達(dá) 質(zhì)粒pQE30經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hindlll、BamH I雙酶切，連接割膠回收后的酶切產(chǎn)物，并將連 接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到預(yù)先制備的DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序證實(shí)無(wú)突變且讀框 正確；所述的rhDSL重組蛋白為含有6XHis標(biāo)簽的Notch配體Delta-Iike-I的衍生多肽， 所述的衍生多肽由含有進(jìn)化中的保守結(jié)構(gòu)區(qū)DSL和與之相鄰的N-端的50個(gè)氨基酸構(gòu)成， 共 99 個(gè)氨基酸，其氨基酸序列為L(zhǎng)HTDSPDDLATENPERLISRLATQRHLTVGEEWSQDLHSSGRTDLKYS YRFVCDEHYYGEGCSVFCRPRDDAFGHFTCGERGEKVCNPGWKGPYCTEPI ；所述的 Sonicate buffer 為含 ImM EDTA, 5mM DTT，0. ImM PMSF, ρΗ7· 3 的 PBS ； 所述的超聲裂解為中等程度超聲，每次超聲30sec、停30sec，共20次； 所述的 Pellet Wash Buffer 為含 1 % Triton X-100, IOmM EDTA, 50mMNaCl, 100 μ M PMSF, ρΗ 7. 3 的 PBS ；所述的 Buffer/Urea 為 8Μ urea, 50mMTris-HCl, ImM EDTA, 50mMNaCl, 0. ImM PMSF, pH8. 5 ；所述的復(fù)性液 Alkaline Buffer A 為 50mM NaH2PO4,0. ImM PMSF, pHlO. 7 ；所述的稀釋液為 20mM Tris-HCl，0. ImM PMSF, pH 8. 0 ；所述的 Wash Buffer 為 20mMTris_HCl，pH 9. 1 ；所述的 elution buffer 為 20mM Tris-HCl, IM NaCl，pH 9. 1 ；所述的 IXHis-Tag Binding Buffer 為 0· 05M imidazole，0· 5M NaCl, 20mMTris, ρΗ8· 5 ；所述的 IXHis-Tag Elution Buffer 為 0· 2M imidazole，0· 5M NaCl, 20mMTris, pH`8. 5 ；第二步，在HS/PCs體外培養(yǎng)體系中加入上述制備的rhDSL重組蛋白及早期造血因子， 采用這兩者結(jié)合擴(kuò)增造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的以rhDSL重組蛋白擴(kuò)增造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞的方法，其特征 是，所述的rhDSL重組蛋白擴(kuò)增濃度為0. 5 μ g/ml 4. 5 μ g/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的以rhDSL重組蛋白擴(kuò)增造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞的方法，其 特征是，所述的rhDSL重組蛋白擴(kuò)增濃度為1. 5 μ g/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的以rhDSL重組蛋白擴(kuò)增造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞的方法，其特征 是，所述的早期造血因子的濃度為10ng/ml-30ng/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1或4所述的以rhDSL重組蛋白擴(kuò)增造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞的方法，其 特征是，所述的早期造血因子為干細(xì)胞因子，濃度為20ng/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的以rhDSL重組蛋白擴(kuò)增造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞的方法，其特征 是，所述的結(jié)合擴(kuò)增造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的時(shí)間為0 7天。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1或6所述的以rhDSL重組蛋白擴(kuò)增造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞的方法，其 特征是，所述的rhDSL重組蛋白及早期造血因子的結(jié)合擴(kuò)增造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的時(shí)間為 2. 5 天。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明涉及一種生物工程領(lǐng)域的以rhDSL重組蛋白擴(kuò)增造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞的方法，在HS/PCs體外培養(yǎng)體系中加入rhDSL重組蛋白及早期造血因子，采用這兩者結(jié)合擴(kuò)增造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞。所述rhDSL重組蛋白為含有6×His標(biāo)簽的Notch配體Delta-like-1的衍生多肽，衍生多肽由含有進(jìn)化中的保守結(jié)構(gòu)區(qū)DSL和與之相鄰的N-端50個(gè)氨基酸構(gòu)成，共99個(gè)氨基酸，其氨基酸序列為L(zhǎng)HTDSPDDLATENPERLISRLATQRHLTVGEEWSQDLHSSGRTDLKYSYRFVCDEHYYGEGCSVFCRPRDDAFGHFTCGERGEKVCNPGWKGPYCTEPI。本發(fā)明中rhDSL重組蛋白在造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增中具有分子量小，使用方便，節(jié)約成本的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K14/47GKCN101363012 B發(fā)布類(lèi)型授權(quán) 專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朇N 200810200654
公開(kāi)日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2008年9月27日
發(fā)明者趙梅, 韓偉 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專(zhuān)利引用 (3),