專利名稱：:一種微生物發(fā)酵合成α-酮戊二酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵合成α-酮戊二酸的方法。
背景技術(shù)：
：α-酮戊二酸(α-ketoglutaricacid，簡(jiǎn)稱α-KG)，化學(xué)名稱2-氧代-1，5戊二酸，結(jié)構(gòu)式為是白色或類白色的粉末狀物質(zhì)，易溶于水，作為一種有機(jī)中間體廣泛應(yīng)用于有機(jī)合成生產(chǎn)中；是一種重要的生化試劑、另外可作為配套試劑用于測(cè)定肝功能，作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑廣泛應(yīng)用于提高機(jī)體免疫能力；降低術(shù)后患者和長(zhǎng)期病人的機(jī)體損耗；在腦部作為氨酪酸和谷氨酸合成的前體；與身體內(nèi)的能量產(chǎn)物有關(guān)。作為運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)飲料的成分，可促進(jìn)有氧供能；提高運(yùn)動(dòng)員胰島素水平，促進(jìn)氨基酸、血糖等供能物質(zhì)的吸收，提高肌糖原和蛋白質(zhì)合成，提高內(nèi)源性睪酮水平，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)。目前，α-酮戊二酸的制備方法是化學(xué)合成法。而微生物發(fā)酵合成α-酮戊二酸尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種微生物發(fā)酵合成α-酮戊二酸的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案利用多重維生素營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株光滑球擬酵母(Torulopsisglabrata)CCTCCM202019發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸過(guò)程中，培養(yǎng)基中添加碳酸鈣和增大生物素的濃度能促進(jìn)發(fā)酵液中α-KG的生成。1菌種光滑球擬酵母(T.glabrata)CCTCCM202019，煙酸、生物素、硫胺素、鹽酸吡哆醇四種維生素營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，且丙酮酸脫羧酶活性組成型降低，為本研究室選育菌株，該菌種已申請(qǐng)中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)枮?2113142.2，公開(kāi)號(hào)CN1392246A。2培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法培養(yǎng)基組成(g/L)葡萄糖100，乙酸鈉6，氯化銨7，KH2PO45，MgSO4·7H2O0.8，KCl5，鹽酸硫胺素20μg/L，生物素40～60μg/L，煙酸4mg/L，鹽酸吡哆醇100μg/L，CaCO320-40，微量元素液5mL，初始pH5.0，自來(lái)水配制；微量元素液CaCl2·2H2O2g，F(xiàn)eSO4·7H2O2g，ZnCl20.5g，MnCl2·4H2O0.2g，CuSO4·5H2O0.05g，2mol/LHCl溶解后定容至1L。培養(yǎng)方法為搖瓶發(fā)酵，500mL錐形瓶中發(fā)酵培養(yǎng)基為50mL，溫度為30℃，轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵時(shí)間為48h；發(fā)酵罐發(fā)酵，7L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基體積為4L，溫度為30℃、通氣量3L/(L·min)，攪拌轉(zhuǎn)速為400r/min，發(fā)酵時(shí)間為60h。3分析方法葡萄糖的測(cè)定3，5-二硝基水楊酸法。丙酮酸和α-酮戊二酸的測(cè)定采用高壓液相色譜(HPLC)測(cè)定。色譜條件為StableBondC18反相柱，柱溫28℃，檢測(cè)器UV210nm，流動(dòng)相0.1％H3PO4，流速1.0mL/min，進(jìn)樣體積10uL。丙酮酸羧化酶和丙酮酸脫氫酶活性的測(cè)定將在30℃下培養(yǎng)了24h的細(xì)胞用無(wú)菌水離心洗滌3次，然后懸浮在pH為7.5的0.1mol/L的磷酸鉀緩沖液中，用玻璃珠于4℃下振蕩5min，使細(xì)胞在懸浮液中混合均勻，于4℃超聲波破碎2min，工作強(qiáng)度為30％，工作1s間隔0.5s；隨后在4℃、10,000r/min下離心3min，除去細(xì)胞碎片，取上清液測(cè)定。丙酮酸羧化酶(PC)活性的測(cè)定反應(yīng)混合物中含有pH7.8的磷酸鹽(PBS)緩沖液0.56mL、蒸餾水1.7mL、0.5mol/LNaHCO3溶液0.4mL、0.1mol/LMgCl2溶液0.2mL、1.0mmol/L的乙酰輔酶A溶液0.4mL、0.1mol/L5，5-二硫代二苯基安息香酸的乙醇溶液0.1mL、1000μ/mL的檸檬酸合成酶0.02mL、0.1mol/L的三磷酸腺苷(ATP)溶液0.2mL，細(xì)胞抽提物0.2mL，將上述混合液于30℃下保溫10min。添加0.2mL0.1mol/L的丙酮酸啟動(dòng)反應(yīng)，反應(yīng)60s后添加0.3mL的1mol/L的KOH終止反應(yīng)，然后用分光光度計(jì)在415nm下檢測(cè)草酰乙酸的生成量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出丙酮酸羧化酶的活性。1個(gè)酶活單位表示為1min內(nèi)該酶催化產(chǎn)物生成的微摩爾數(shù)。丙酮酸脫氫酶系(PDH)活性的測(cè)定反應(yīng)混合物中含有pH7.8磷酸鉀緩沖液1.0mL、2.5mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)0.2mL、0.2mmol/L焦磷酸硫胺素0.2mL、0.1mmol/L乙酰輔酶A0.4mL、0.3mmol/L二硫蘇糖醇0.1mL、1mmol/L氯化鎂0.2mL、1mg/mL牛血清蛋白0.1mL，6mmol/L2-碘苯基-3-硝基苯氯化四唑(INT)0.4mL，0.1mg/L硫辛酰胺脫氫酶0.1mL、細(xì)胞抽提物0.5mL。將上述混合液于30℃保溫10min后添加0.2mL5mmol/L丙酮酸啟動(dòng)反應(yīng)，反應(yīng)60s后加入0.5mL的1mol/L的H2SO4溶液終止反應(yīng)，然后于30℃下用分光光度計(jì)在500nm下檢測(cè)INT的減少量。1個(gè)酶活單位表示為在1min內(nèi)該酶催化底物減少的微摩爾數(shù)。細(xì)胞干重(DCW)用分光光度計(jì)測(cè)定OD值后按照1OD＝0.23g干菌體進(jìn)行計(jì)算；蛋白質(zhì)含量的測(cè)定用改進(jìn)的Folin-酚法。4相關(guān)技術(shù)條件對(duì)α-酮戊二酸生成的影響①搖瓶與發(fā)酵罐生產(chǎn)丙酮酸的對(duì)比實(shí)驗(yàn)在發(fā)酵罐中對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，接種混勻后，將30mL已接種的培養(yǎng)基無(wú)菌轉(zhuǎn)移至已滅菌的500mL三角瓶中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，以考察培養(yǎng)基組成完全相同的情況下發(fā)酵罐和搖瓶培養(yǎng)的差異。如表1所示，當(dāng)搖瓶和發(fā)酵罐中不調(diào)節(jié)pH時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)微弱，丙酮酸積累也很少。在搖瓶中用CaCO3作為緩沖劑時(shí)，細(xì)胞正常生長(zhǎng)，丙酮酸大量積累，但同時(shí)也產(chǎn)生了較高濃度(6.8g/L)的α-KG。在發(fā)酵罐培養(yǎng)中，如果用NaOH調(diào)節(jié)pH，發(fā)酵液中α-KG濃度很低。但如果改用CaCO3調(diào)節(jié)pH，發(fā)酵液中α-KG的濃度則比用NaOH調(diào)節(jié)pH時(shí)增加了8倍。在發(fā)酵罐和搖瓶培養(yǎng)中，用CaCO3調(diào)節(jié)pH時(shí)的CPYR/CKG值相近，表明CaCO3的添加對(duì)發(fā)酵液中α-KG的積累有重要影響。表1搖瓶和發(fā)酵罐上發(fā)酵的對(duì)照說(shuō)明CPYR/CKG為丙酮酸的碳摩爾數(shù)與α-KG的碳摩爾數(shù)的比值。②CaCO3添加時(shí)間和濃度對(duì)α-KG產(chǎn)生的影響為了說(shuō)明CaCO3的添加是否是導(dǎo)致α-KG產(chǎn)生的主要因素，本發(fā)明研究了CaCO3添加時(shí)間和濃度對(duì)α-KG產(chǎn)生的影響。在維生素濃度不變的前提下，延遲CaCO3添加時(shí)間可明顯抑制α-KG的產(chǎn)生并提高CPYR/CKG值(圖1)，而增加培養(yǎng)基中的CaCO3濃度會(huì)導(dǎo)致α-KG的積累增加(表2)。這些結(jié)果表明CaCO3有可能以某種方式(如激活了PDH或PC)，使丙酮酸進(jìn)入TCA循環(huán)的通量增加。表2不同裝液量下CaCO3質(zhì)量濃度對(duì)丙酮酸發(fā)酵的影響③Ca2+、CO32-對(duì)α-KG的影響發(fā)酵液中CaCO3的存在促進(jìn)了α-KG的積累，但具體是Ca2+還是CO32-或者是兩者共同促進(jìn)了α-KG的積累呢？為了解釋這一問(wèn)題，作者設(shè)計(jì)了5種方法來(lái)自動(dòng)控制7L發(fā)酵罐(裝液量4L)發(fā)酵過(guò)程的pH(1)流加5mol/L的NaOH；(2)流加2.5mol/L的Na2CO3；(3)流加CaCO3懸濁液(150gCaCO3/100mL水)；(4)在發(fā)酵開(kāi)始后流加濃度為40％的CaCl2濃縮液(流加速度25mL/h，共流加8h，使發(fā)酵液中CaCl2終濃度達(dá)到20g/L)，同時(shí)流加5mol/L的NaOH；(5)在發(fā)酵開(kāi)始后流加濃度為40％的CaCl2濃縮液(流加方法同(4))，同時(shí)用2.5mol/L的Na2CO3調(diào)節(jié)pH。5種情況下的發(fā)酵過(guò)程曲線如圖2所示。從圖2(A)可知，當(dāng)用NaOH對(duì)發(fā)酵過(guò)程的pH進(jìn)行調(diào)節(jié)時(shí)，CPYR/CKG值可保持在50～60之間；用NaCO3調(diào)節(jié)pH時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中的CPYR/CKG值下降到20～30。當(dāng)用CaCO3調(diào)節(jié)pH時(shí)，或者當(dāng)發(fā)酵液中有大量CaCl2存在、再用NaOH或NaCO3調(diào)節(jié)pH時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中的CPYR/CKG值均低于10。結(jié)合圖2(B)可以認(rèn)為，Ca2+和CO32-都促進(jìn)了α-KG的積累，其中Ca2+對(duì)α-KG積累起主要促進(jìn)作用。此外，在圖2(C)中發(fā)現(xiàn)，與用NaOH調(diào)節(jié)pH的發(fā)酵過(guò)程相比，當(dāng)培養(yǎng)基中有大量Ca2+存在時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)較快，最終細(xì)胞濃度也較高。這可能是因?yàn)镃a2+作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，能夠加速細(xì)胞的生長(zhǎng)；此外，有Ca2+存在時(shí)α-KG濃度較高，為合成更多細(xì)胞物質(zhì)提供了可能，導(dǎo)致最終細(xì)胞量有所提高。研究還發(fā)現(xiàn)用不同物質(zhì)調(diào)節(jié)pH時(shí)對(duì)丙酮酸的積累速度和產(chǎn)量也有影響。如圖2(D)所示，當(dāng)有Ca2+存在時(shí)，由于細(xì)胞生長(zhǎng)較快，丙酮酸積累速度也較快，但丙酮酸的產(chǎn)量有所下降。同時(shí)由于α-KG的產(chǎn)生，丙酮酸對(duì)葡萄糖得率有所下降(數(shù)據(jù)未給出)。④硫胺素和生物素濃度對(duì)α-KG生成的影響在菌株T.glabrataCCTCCM202019中，PDH和PC是控制丙酮酸降解進(jìn)入TCA循環(huán)的兩個(gè)重要酶(系)(圖3)，其活性的高低決定了進(jìn)入TCA循環(huán)碳流的多少。由于該菌株自身不能合成硫胺素(B1)和生物素(Bio)，因此該菌株胞內(nèi)的PDH和PC活性可分別被培養(yǎng)基中的B1和Bio濃度所控制。為了考察具體是哪個(gè)酶(系)影響α-KG的產(chǎn)生，本發(fā)明在CaCO3添加濃度為40g/L的前提下，研究了不同B1和Bio濃度對(duì)α-KG積累的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，改變培養(yǎng)基中B1的濃度，對(duì)α-KG的積累、特別是對(duì)CPYR/CKG值沒(méi)有影響(圖4A)。而增加培養(yǎng)基中Bio的濃度，則導(dǎo)致α-KG的濃度不斷上升且CPYR/CKG值不斷下降(圖4B)，培養(yǎng)基中生物素的濃度以40～60μg/L為宜。由于Bio是PC的輔因子，據(jù)此可以認(rèn)為α-KG的產(chǎn)生是由PC活性變化而引起的。⑤采用不同調(diào)節(jié)pH物質(zhì)對(duì)PC和PDH活性的影響維持培養(yǎng)基中維生素質(zhì)量濃度不變，在發(fā)酵進(jìn)行到細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)(20h)，測(cè)定采用不同物質(zhì)調(diào)節(jié)發(fā)酵液中pH時(shí)細(xì)胞內(nèi)PC和PDH活性的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖5)，當(dāng)有Ca2+存在時(shí)，胞內(nèi)PC的活性最高可提高40％，而PDH的活性沒(méi)有明顯變化。表明Ca2+可提高PC的活性，從而使丙酮酸通過(guò)丙酮酸羧化途徑進(jìn)入TCA循環(huán)的通量增加。由于α-KG脫氫酶亦以B1為輔因子，在B1限制的條件下，α-KG脫氫酶活性也很低，由此導(dǎo)致發(fā)酵液中α-KG大量積累。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)酵母的PC活性有可能被Ca2+激活，從而使T.glabrata從發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸轉(zhuǎn)向合成高濃度的α-KG。綜上所述，培養(yǎng)基中添加CaCO3的質(zhì)量濃度為20～40g/L，生物素濃度為40～60μg/L，α-酮戊二酸的生成量為15～40g/L。本發(fā)明有益效果在多重維生素營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株光滑球擬酵母CCTCCM202019發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的搖瓶和發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CaCO3的添加對(duì)發(fā)酵液中α-酮戊二酸(α-KG)的積累有重要影響。在維生素濃度不變且供氧充分的前提下，延遲CaCO3添加時(shí)間可明顯抑制α-KG的產(chǎn)生，并提高丙酮酸與α-KG的碳摩爾比(CPYR/CKG)；而增加培養(yǎng)基中的CaCO3濃度會(huì)導(dǎo)致α-KG積累的增加。用不同物質(zhì)調(diào)節(jié)發(fā)酵液中pH的實(shí)驗(yàn)證實(shí)在丙酮酸發(fā)酵過(guò)程中，Ca2+對(duì)α-KG的積累起主要作用，CO32-起輔助作用，兩者對(duì)α-KG的積累具有協(xié)同效應(yīng)。維持培養(yǎng)基中CaCO3濃度不變，改變培養(yǎng)基中硫胺素的濃度，對(duì)α-KG的積累、特別是對(duì)CPYR/CKG值沒(méi)有影響；而增加培養(yǎng)基中生物素的濃度，則導(dǎo)致α-KG的濃度不斷上升且CPYR/CKG值不斷下降。當(dāng)有Ca2+存在時(shí)，胞內(nèi)丙酮酸羧化酶的活性可提高40％，而丙酮酸脫氫酶系的活性沒(méi)有明顯變化，培養(yǎng)基中Ca2+和生物素濃度的增大可顯著提高丙酮酸羧化酶的活性，從而使T.glabrata從發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸轉(zhuǎn)向合成高濃度的α-KG。圖1CaCO3(40g/L)添加時(shí)間對(duì)α-KG生成的影響圖2不同物質(zhì)調(diào)節(jié)pH時(shí)對(duì)α-KG產(chǎn)生的影響圖3Torulopsisglabrata中丙酮酸的代謝圖4硫胺素、生物素濃度對(duì)α-KG積累的影響圖5不同調(diào)節(jié)pH的物質(zhì)對(duì)PC和PDH活性的影響生物材料樣品保藏光滑球擬酵母，保藏日期2002年4月29日，保藏單位名稱及簡(jiǎn)稱中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào)NOM202019。具體實(shí)施方式實(shí)施例1在7L發(fā)酵罐中對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，按照10％(體積比)接種微生物種子，接種混勻后，將50mL已接種的培養(yǎng)基無(wú)菌轉(zhuǎn)移至已滅菌的500mL三角瓶中，同時(shí)添加40g/L碳酸鈣進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，30℃、200rpm培養(yǎng)48h，測(cè)得α-酮戊二酸濃度為15.8g/L，CPYR/CKG為3.1。實(shí)施例2接種、培養(yǎng)條件同實(shí)施例1，另加入20～40μg/L的生物素，發(fā)現(xiàn)α-酮戊二酸濃度隨著生物素濃度的增大而增大，CPYR/CKG逐漸減小。在培養(yǎng)基中生物素總濃度達(dá)到60μg/L時(shí)，測(cè)得α-酮戊二酸濃度為23.5g/L，CPYR/CKG為1.47。實(shí)施例3在7L發(fā)酵罐中裝4L發(fā)酵培養(yǎng)基后進(jìn)行滅菌，按照10％(體積比)接入光滑球擬酵母，培養(yǎng)基中添加有40g/L碳酸鈣，同時(shí)含有60μg/L生物素。30℃、通氣量3L/(L·min)，轉(zhuǎn)速400rpm培養(yǎng)60h后測(cè)得α-酮戊二酸濃度為38.4g/L，CPYR/CKG為0.72。權(quán)利要求1.一種微生物發(fā)酵合成α-酮戊二酸的方法，其特征是利用多重維生素營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株光滑球擬酵母(Torulopsisglabrata)CCTCCM202019發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸過(guò)程中，培養(yǎng)基中添加碳酸鈣和增大生物素的濃度能促進(jìn)發(fā)酵液中α-KG的生成。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述發(fā)酵過(guò)程的培養(yǎng)基組成(g/L)葡萄糖100，乙酸鈉6，氯化銨7，KH2PO45，MgSO4·7H2O0.8，KCl5，鹽酸硫胺素20μg/L，生物素40～60μg/L，煙酸4mg/L，鹽酸吡哆醇100μg/L，CaCO320-40，微量元素液5mL，初始pH5.0，自來(lái)水配制；微量元素液CaCl2·2H2O2g，F(xiàn)eSO4·7H2O2g，ZnCl20.5g，MnCl2·4H2O0.2g，CuSO4·5H2O0.05g，2mol/LHCl溶解后定容至1L。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述發(fā)酵過(guò)程的培養(yǎng)方法為搖瓶發(fā)酵，500mL錐形瓶中發(fā)酵培養(yǎng)基為50mL，溫度為30℃，轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵時(shí)間為48h；發(fā)酵罐發(fā)酵，7L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基體積為4L，溫度為30℃、通氣量3L/(L·min)，攪拌轉(zhuǎn)速為400r/min，發(fā)酵時(shí)間為60h。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述發(fā)酵過(guò)程培養(yǎng)基中添加CaCO3的質(zhì)量濃度為20～40g/L，生物素濃度為40～60μg/L，α-酮戊二酸的生成量為15～40g/L。專利摘要一種微生物發(fā)酵合成α－酮戊二酸的方法，通過(guò)在培養(yǎng)基中添加碳酸鈣和增大生物素濃度促進(jìn)丙酮酸發(fā)酵過(guò)程中生成大量α－酮戊二酸。光滑球擬酵母CCTCCM202019發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸過(guò)程中，延遲碳酸鈣添加時(shí)間會(huì)抑制α－KG的生成，并提高丙酮酸與α－KG的碳摩爾比(C文檔編號(hào)C12P7/40GKCN1544642SQ200310106298公開(kāi)日2004年11月10日申請(qǐng)日期2003年11月13日發(fā)明者陳堅(jiān),李寅,劉立明,倫世儀,陳堅(jiān)申請(qǐng)人:江南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan