專利名稱:控制對(duì)鹽脅迫的耐受性的新的水稻基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的基因。更具體地，本發(fā)明涉及編碼蛋白質(zhì)的新基因，所述蛋白質(zhì)具有控制植物對(duì)鹽脅迫的耐受性的功能。
背景技術(shù)：
植物經(jīng)常遭受脅迫，甚至在正常生長環(huán)境下也是如此。所述脅迫包括以下多種鹽，干旱，高溫，低溫，強(qiáng)光，空氣污染等。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面，鹽脅迫受到人們的關(guān)注。當(dāng)土壤和石塊分解時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生鹽，并且會(huì)持續(xù)不斷地產(chǎn)生鹽。下雨時(shí)鹽流入河流或大海中。在降雨稀少的沙漠地帶，僅有少量的鹽流出，使得土壤水分中的鹽濃度相當(dāng)高。植物在通過根滲透吸收水分的同時(shí)也在吸收鹽(營養(yǎng)物質(zhì))。當(dāng)鹽濃度高時(shí)，植物無法吸收水分。另外，由于離子特異性的生理作用，植物的生長受到抑制。已知植物對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)與其對(duì)環(huán)境脅迫，如干旱，高滲透壓，低溫等的反應(yīng)部分一致。這些脅迫對(duì)農(nóng)業(yè)造成相當(dāng)嚴(yán)重的損害。
最近，由于大量使用化學(xué)肥料或長期連續(xù)耕作，經(jīng)常能觀察到土壤中積累了高濃度的鹽。特別是在溫室土壤中，經(jīng)常會(huì)發(fā)生有害的鹽積累。在靠近海岸的地區(qū)，海水或海風(fēng)導(dǎo)致?lián)p害。在干旱或半干旱地區(qū)，由于過度蒸發(fā)，鹽積累在土壤表層。這些問題限制了農(nóng)業(yè)用地的使用。解決這些問題的通常做法是更換受影響的土壤，或通過灌溉除去鹽。然而，這些方法需要耗費(fèi)大量財(cái)力或人力。通過灌溉除去鹽導(dǎo)致大量鹽水流入周圍地區(qū)，會(huì)引起環(huán)境污染。目前已考慮限制灌溉。
因此，尋找能耐受鹽脅迫的植物是非常重要的。
根據(jù)國內(nèi)外進(jìn)行的對(duì)鹽耐受植物的研究，已知當(dāng)將鹽耐受植物從非-脅迫條件下轉(zhuǎn)移至鹽脅迫條件時(shí)，可誘使新基因表達(dá)，這些基因的產(chǎn)物對(duì)鹽脅迫耐受性起作用。已知在煙草屬植物中，有一些植物類型具有鹽脅迫耐受性。據(jù)報(bào)道已分離出相關(guān)基因(Nelson等，(1992)Plant Molecular Biology，vol.19，577-588；Yun等，(1996)Plant Physiology，vol.111，1219-1225)。煙草屬植物的另一例與鹽脅迫反應(yīng)有關(guān)的基因是得自具有鹽脅迫耐受性的Nicotianapaniculata的基因，所述基因描述于日本特許公開號(hào)11-187877，日本特許公開號(hào)11-187878，日本特許公開號(hào)11-187879和日本特許公開號(hào)11-187880。日本特許公開號(hào)11-187877描述了由鹽脅迫誘導(dǎo)的新基因。據(jù)認(rèn)為由該基因編碼的基因產(chǎn)物具有賦予植物水應(yīng)力耐受性的功能。日本特許公開號(hào)11-187878描述了由鹽脅迫誘導(dǎo)的新的鉀通道基因。據(jù)認(rèn)為由該基因編碼的鉀通道基因具有賦予植物水應(yīng)力耐受性的功能。日本特許公開號(hào)11-187879描述了由鹽脅迫誘導(dǎo)的新的INPS基因。由該基因編碼的INPS基因具有賦予植物水應(yīng)力耐受性的功能。日本特許公開號(hào)11-187880描述了由鹽脅迫誘導(dǎo)的新的葉綠體型果糖二磷酸醛縮酶。據(jù)認(rèn)為由該基因編碼的醛縮酶具有賦予植物水應(yīng)力耐受性的功能。
兩種與對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)有關(guān)的水稻基因是葉綠體谷氨酰胺合成酶(GS2)基因(Hoshida等，Plant Mol.Biol.43103-11(2000))；和Δ1-吡咯啉-5-羧酸(P5C)合成酶(OsP5CS)基因(Igarashi等，Plant Mol.Biol.33857-65(1997))。在上述文獻(xiàn)中，描述了GS2基因可增強(qiáng)光呼吸能力，從而賦予植物對(duì)鹽脅迫的耐受性。高濃度的鹽，脫水作用，脫落酸處理和低溫可誘導(dǎo)與脯氨酸生物合成有關(guān)的OsP5CS基因。在鹽耐受品種Dee-gee-woo-gen中，OsP5CS基因的表達(dá)在鹽脅迫條件下穩(wěn)定增加，而在對(duì)鹽敏感的品種IR28中，所述表達(dá)略有增加。
利用水稻逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tosl7的特性已產(chǎn)生多個(gè)基因被破壞的水稻株系，所述轉(zhuǎn)座子通過培養(yǎng)被激活以經(jīng)受轉(zhuǎn)座。轉(zhuǎn)座子是遍布于動(dòng)物，酵母，細(xì)菌和植物基因組的致突變基因。根據(jù)轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)理，可將其分成兩類。II類轉(zhuǎn)座子以不復(fù)制的DNA形式經(jīng)受轉(zhuǎn)座。II類轉(zhuǎn)座子的例子包括玉米的Ac/Ds，Spm/dSpm和Mu元件(Fedoroff，1989，Cell 56，181-191；Fedoroff等，1983，Cell 35，235-242；Schiefelbein等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，4783-4787)，以及金魚草屬(Antirrhinum majus)的Tam元件(Bonas等，1984，EMBO J，3，1015-1019)。II類轉(zhuǎn)座子被廣泛用于利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)記進(jìn)行基因分離。所述技術(shù)利用了轉(zhuǎn)座子的特性，即轉(zhuǎn)座子在基因組內(nèi)轉(zhuǎn)座，并插入某個(gè)基因，結(jié)果，在生理學(xué)和形態(tài)學(xué)上修飾了該基因，從而改變由該基因控制的表型。如果可以檢測(cè)到這種表型變化，即可分離出受影響的基因(Bancroft等，1993，The Plant Cell，5，631-638；Colasanti等，1998，Cell，93，593-603；Gray等，1997，Cell，89，25-31；Keddie等，1998，The Plant Cell，10，877-887；和Whitham等，1994，Cell，78，1101-1115)。
I類轉(zhuǎn)座子也被稱為逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子以RNA作為中間體經(jīng)受復(fù)制型轉(zhuǎn)座。最初，在果蠅和酵母中鑒定出I類轉(zhuǎn)座子。最新的研究揭示出逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在植物基因組中普遍存在并且占有優(yōu)勢(shì)(Bennetzen，1996，Trends Microbiolo.，4，347-353；Voytas，1996，Science，274，737-738)。大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子似乎都是可整合但不可轉(zhuǎn)座的單位。最近，據(jù)報(bào)道一些這種類型的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在脅迫條件下可被激活，所述條件如損傷，病原體攻擊和細(xì)胞培養(yǎng)(Grandbastien，1998，Trends in Plant Science，3，181-187；Wessler，1996，Curr.Biol.，6，959-961；Wessler等，1995，Curr Opin.Genet.Devel.，5，814-821)。例如，在煙草逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子TntlA和Ttol(Pouteau等，1994，Plant J.，5，535-542；Takeda等，1988，Plant Mol.Biol.，36，365-376)以及水稻逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tosl7(Hirochika等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，7783-7788)中發(fā)現(xiàn)了脅迫條件下的激活。
水稻逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tosl7是已被深入研究的植物I類元件。使用根據(jù)Tyl-copia組逆轉(zhuǎn)錄-元件的逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域的保守氨基酸序列制備的簡并引物，經(jīng)RT-PCR克隆Tosl7(Hirochika等，1992，Mol.Gen.Genet.，233，209-216)。Tosl7長度為4.3kb，它具有兩個(gè)相同的138bp的LTR(長末端重復(fù))和與起始甲硫氨酸t(yī)RNA的3’末端互補(bǔ)的PBS(引物結(jié)合位點(diǎn))(Hirochika等，1996，文獻(xiàn)同上)。通過組織培養(yǎng)可以強(qiáng)烈激活Tosl7的轉(zhuǎn)錄，Tosl7的拷貝數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間而增加。在用作基因組研究模型的日本晴(Japonica品種)中，其最初的拷貝數(shù)是2。在由組織培養(yǎng)物再生的植物中，其拷貝數(shù)增加為5至30(Hirochika等，1996，文獻(xiàn)同上)。與在酵母和果蠅中發(fā)現(xiàn)的I類轉(zhuǎn)座子不同的是，Tosl7經(jīng)受染色體中的隨機(jī)轉(zhuǎn)座，并以穩(wěn)定的方式誘導(dǎo)突變。因此，Tosl7為分析水稻基因功能的逆轉(zhuǎn)錄遺傳學(xué)提供了有用的工具(Hirochika，1997，Plant Mol.Biol.35，231-240；K.Shimamoto Ed.，1999，Molecular Biologyof Rice，Springer-Verlag，43-58)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是揭示編碼能決定對(duì)鹽脅迫和/或滲透壓脅迫的敏感性的蛋白質(zhì)的基因；操縱對(duì)多種環(huán)境脅迫，包括鹽脅迫和滲透壓脅迫的敏感性；選擇具有不同敏感性的植物；和提供可用于產(chǎn)生對(duì)這些環(huán)境脅迫的耐受性增強(qiáng)的植物的基因。
本發(fā)明人在多株基因被破壞的水稻中發(fā)現(xiàn)對(duì)鹽脅迫具有高水平的敏感性的突變體，所述水稻株是利用水稻逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tosl7的特性產(chǎn)生的，所述轉(zhuǎn)座子通過培養(yǎng)被激活以經(jīng)受轉(zhuǎn)座。所述突變體在鹽脅迫下表現(xiàn)出諸如生長抑制和器官形態(tài)學(xué)異常的性狀。已嚴(yán)謹(jǐn)?shù)匮芯苛诵誀罡淖兒望}脅迫之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)性狀改變是能夠決定對(duì)鹽脅迫的敏感性的基因的突變所致，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明涉及編碼能控制鹽脅迫耐受性的植物基因的多核苷酸，其中多核苷酸包括具有編碼序列表中SEQ ID NO2的第1位甲硫氨酸至第243位天冬酰胺的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，或具有編碼具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸缺失，取代和/或附加的氨基酸序列的核苷酸序列，并能控制鹽脅迫耐受性的多核苷酸。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，植物基因還能控制滲透壓脅迫耐受性。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸得自水稻。
本發(fā)明還涉及編碼能控制鹽脅迫耐受性的植物基因的多核苷酸，其中多核苷酸包括具有編碼序列表中SEQ ID NO1的第233位A至第961位C的核苷酸序列，或可在嚴(yán)緊條件下與該核苷酸序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，植物基因還能控制滲透壓脅迫耐受性。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸得自水稻。
附圖簡述
圖1為照片(A)和(B)，(A)顯示了得自再分化的日本晴株系的對(duì)鹽脅迫高度敏感的突變體和作為對(duì)照的野生型幼苗的莖干和根的形態(tài)學(xué)，(B)顯示了根的形態(tài)學(xué)。
圖2為照片，其中顯示了分別得自再分化的日本晴株系(A)和再分化的Hitomebore株系(B)的對(duì)鹽脅迫高度敏感的突變體以及作為對(duì)照的野生型幼苗的莖干和根的形態(tài)學(xué)。
圖3顯示了決定鹽脅迫敏感性的水稻基因的cDNA序列。
圖4顯示了由決定鹽脅迫敏感性的水稻基因編碼的蛋白質(zhì)的推定氨基酸序列。
圖5為照片，其中顯示了在不含氯化鈉的培養(yǎng)基(A)和含氯化鈉的培養(yǎng)基(B)中發(fā)芽和生長的野生型和突變型的莖干和根的形態(tài)學(xué)，以及在正常土壤中生長的突變型的生長形態(tài)學(xué)。
圖6為照片，其中顯示了在含甘露糖醇的培養(yǎng)基中生長的野生型和突變型的莖干和根的生長形態(tài)學(xué)。
實(shí)施本發(fā)明的最佳模式本發(fā)明提供了通過使用Tosl7分離得到的，其功能已被揭示的新的植物基因。
本文所用術(shù)語“基因”指的是攜有遺傳信息的結(jié)構(gòu)單位和決定性狀的元件?？蓪⒒蚨x為由大分子DNA或RNA中的某個(gè)區(qū)域的堿基序列限定的遺傳功能性單位。因此，可將基因理解為最終被翻譯成蛋白質(zhì)的DNA或RNA，或多核苷酸。
本文所用術(shù)語“脅迫”指的是導(dǎo)致植物生長發(fā)生變化的外部因子?！碍h(huán)境脅迫”指的是外部環(huán)境變化所提供的脅迫，包括鹽，高滲透壓，干旱，高溫，低溫，強(qiáng)光，空氣污染等。
根據(jù)本發(fā)明，提供了編碼控制鹽脅迫耐受性的植物基因的多核苷酸。本文所用術(shù)語“鹽脅迫”指的是培養(yǎng)介質(zhì)(如土壤，允許培養(yǎng)植物的培養(yǎng)基(固體或液體)等)中的鹽濃度增加到使植物生長受到不利影響的程度。鹽包括導(dǎo)致植物中的水分吸收受抑制的任何鹽，包括例如鎂鹽，氯鹽，鋁鹽等。本文所用術(shù)語“鹽脅迫耐受性”指的是對(duì)上述鹽脅迫的耐受性?！胞}脅迫敏感性”指的是對(duì)上述鹽脅迫的敏感性，例如受對(duì)生長不利之因素的影響。當(dāng)在具有中等/低濃度(例如50至300mM，優(yōu)選為100至150mM)鹽的培養(yǎng)介質(zhì)(如土壤，允許培養(yǎng)植物的培養(yǎng)基(固體或液體)等)中培養(yǎng)具有“鹽脅迫敏感性”的株系時(shí)，該株系會(huì)表現(xiàn)出生長抑制和植物器官和組織的形態(tài)學(xué)異常?！翱刂汽}脅迫耐受性”指的是抑制或促進(jìn)與鹽脅迫有關(guān)，或編碼決定鹽脅迫耐受性的蛋白質(zhì)或控制其操作的基因的表達(dá)。
本發(fā)明的植物基因還可控制滲透壓脅迫耐受性?！皾B透壓脅迫”指的是滲透壓的產(chǎn)生對(duì)植物生長產(chǎn)生不利影響。滲透壓與植物細(xì)胞的生長(水分吸收)有關(guān)，所述生長中細(xì)胞吸收水分以增加細(xì)胞的體積。一般說來，當(dāng)滲透壓增加時(shí)，植物吸水力降低。本文所用術(shù)語“滲透壓脅迫耐受性”指的是對(duì)滲透壓脅迫的耐受性?！皾B透壓脅迫敏感性”指的是對(duì)上述滲透壓脅迫的某種反應(yīng)。當(dāng)在導(dǎo)致高滲透壓(例如50至600mM，優(yōu)選至少為150mM甘露糖醇當(dāng)量)的培養(yǎng)介質(zhì)(例如土壤，允許培養(yǎng)植物的培養(yǎng)基(固體或液體)等)中培養(yǎng)具有“滲透壓脅迫敏感性”的株系時(shí)，植物體(特別是根)表現(xiàn)出顯著的生長抑制作用?！翱刂茲B透壓脅迫耐受性”指的是抑制或促進(jìn)與滲透壓脅迫有關(guān)，或編碼決定滲透壓脅迫耐受性的蛋白質(zhì)或控制其操作的基因的表達(dá)。
如上所述的本發(fā)明的多核苷酸是多核苷酸，其包括具有編碼序列表中SEQ ID NO2的第1位甲硫氨酸(Met)至第243位天冬酰胺(Asn)的氨基酸序列的核苷酸序列，或具有編碼在上述氨基酸序列中缺失，取代和/或附加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸所得的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸是具有序列表中SEQ ID NO1的第233-961位核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸還可含有上述區(qū)域(編碼SEQ ID NO2的第1位甲硫氨酸(Met)至第243位天冬酰胺(Asn)的氨基酸序列的核苷酸序列區(qū)域，或SEQ IDNO1的第233-961位核苷酸序列區(qū)域)之外(其5’或3’方向)的核苷酸序列(例如非-翻譯區(qū)域)。更優(yōu)選本發(fā)明的多核苷酸由SEQ IDNO1的第1-1154位全長序列組成。本發(fā)明的多核苷酸包括SEQ ID NO1的所有簡并異構(gòu)體。術(shù)語“簡并異構(gòu)體”指的是編碼相同多肽并具有不同簡并密碼子的DNA。例如，對(duì)于具有SEQ ID NO1的堿基序列的DNA(其中對(duì)應(yīng)于某個(gè)氨基酸(例如Asn)的密碼子是AAC)而言，其中的AAC變?yōu)楹啿⒚艽a子AAT的DNA被稱為簡并異構(gòu)體。
基于在基因被破壞的水稻株系中發(fā)現(xiàn)對(duì)鹽脅迫高度敏感的突變體，使用Tosl7為標(biāo)記從水稻基因組DNA中獲得本發(fā)明的多核苷酸，所述水稻株系是使用水稻逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tosl7的特性產(chǎn)生的，所述轉(zhuǎn)座子通過培養(yǎng)被激活并經(jīng)受轉(zhuǎn)座。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸得自水稻。
本發(fā)明可包括公開的核苷酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)的片段和變體。術(shù)語“片段”欲指核苷酸序列的一部分或氨基酸序列的一部分，或由其編碼的蛋白質(zhì)。核苷酸序列的片段可編碼至少具有天然蛋白質(zhì)的一種功能性生物活性的蛋白質(zhì)片段。
由本發(fā)明的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)的變體欲指通過在蛋白質(zhì)的N和/或C末端缺失(截短)或附加至少一個(gè)氨基酸；在蛋白質(zhì)的至少一個(gè)位點(diǎn)缺失或附加至少一個(gè)氨基酸；或在蛋白質(zhì)的至少一個(gè)位點(diǎn)取代至少一個(gè)氨基酸，而由天然蛋白質(zhì)修飾得到的蛋白質(zhì)。例如，通過基因多態(tài)性或人工修飾可產(chǎn)生所述變體。
可使用多種方法(包括氨基酸取代，缺失，截短和插入)修飾由本發(fā)明的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。這些方法通常是本領(lǐng)域已知的。例如，通過誘變可制備由本發(fā)明的能控制脅迫耐受性的植物基因所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列的變體。誘變和修飾核苷酸序列的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-492；Kunkel等(1987)Methods inEnzymol.154367-382；美國專利號(hào)4,873,192；Walker和Gaastra編(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillian Publishing Company，New York)以及其中引用的參考文獻(xiàn)。
有關(guān)不會(huì)影響目的蛋白質(zhì)的生物活性的適當(dāng)氨基酸取代的指南可參見Dayhoff等.(1987)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.Washington，D.C.)(列入本文作為參考)的模型。優(yōu)選保守取代(例如一個(gè)氨基酸被另一個(gè)具有類似特性的氨基酸所取代)。所述取代的例子包括疏水性氨基酸(Ala，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Trp，Tyr和Val)之間的取代；親水性氨基酸(Arg，Asp，Asn，Cys，Glu，Gln，Gly，His，Lys，Ser和Thr)之間的取代；具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸(Gly，Ala，Val，Leu，Ile和Pro)之間的取代；具有含羥基側(cè)鏈的氨基酸(Ser，Thr和Tyr)之間的取代；具有含硫原子側(cè)鏈的氨基酸(Cys和Met)之間的取代；具有含羧酸和酰胺的側(cè)鏈的氨基酸(Asp，Asn，Glu和Gln)之間的取代；具有含堿基側(cè)鏈的氨基酸(Arg，Lys和His)之間的取代；和具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(His，Phe，Tyr和Trp)之間的取代。
因此，“一個(gè)或幾個(gè)缺失，取代和/或附加”指的是與基因多態(tài)性或人工修飾(包括上述眾所周知的方法)所導(dǎo)致的一樣多的氨基酸取代，缺失和/或附加?！耙粋€(gè)或幾個(gè)缺失，取代和/或附加”指的是可以在蛋白質(zhì)的氨基酸序列中缺失，添加和/或取代任意數(shù)目的氨基酸，只要含有所述修飾的蛋白質(zhì)仍具有本發(fā)明的多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)的功能即可。本領(lǐng)域技術(shù)人員能清楚地理解諸如氨基酸取代，缺失和/或附加的修飾對(duì)活性的影響取決于所修飾的氨基酸的位置、程度、類型等。關(guān)于本發(fā)明的多核苷酸，可在全長氨基酸序列中缺失，取代和/或附加多個(gè)氨基酸以滿足下文所限定的氨基酸序列同一性，例如，只要能表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)的功能即可。
編碼本發(fā)明的能控制鹽脅迫耐受性的植物基因的多核苷酸包括具有編碼與序列表中SEQ ID NO2的第1位Met至第243位Asn的氨基酸序列具有至少60％，優(yōu)選至少65％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少75％，甚至更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，甚至更優(yōu)選至少95％，最優(yōu)選至少99％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，只要它能控制鹽脅迫耐受性即可。
編碼本發(fā)明的能控制鹽脅迫耐受性的植物基因的多核苷酸包括具有與編碼序列表中SEQ ID NO2的第1位Met至第243位Asn的氨基酸序列的核苷酸序列(優(yōu)選SEQ ID NO1中第233位A至第961位C的核苷酸序列)具有至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，甚至更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，甚至更優(yōu)選至少95％，最優(yōu)選至少99％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸，只要它能控制鹽脅迫耐受性即可。
本文所用“參照序列”指的是用作對(duì)比序列的標(biāo)準(zhǔn)序列。參照序列可以是所述序列的亞序列或全部序列；例如，全長cDNA或基因序列的片斷或完整DNA或基因序列。
本文所用“比較窗”涉及到連續(xù)的多核苷酸序列和特定的多核苷酸序列區(qū)段，其中，為了對(duì)兩個(gè)序列進(jìn)行最佳匹配，比較窗中的多核苷酸序列相對(duì)于參照序列(不含有添加或缺失)而言，可含有添加或缺失(即缺口)。通常，比較窗的長度為至少20個(gè)連續(xù)的核苷酸，任選可以是30，40，50，100個(gè)或更長的核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得為了避免因在多核苷酸序列中包含缺口而與參照序列有高相似性，一般可導(dǎo)入缺口罰分，并從匹配數(shù)目中減去缺口罰分。
進(jìn)行序列匹配的比較方法是本領(lǐng)域眾所周知的。優(yōu)選通過使用BLAST(Altshul等，1997，Nucleic Acids Res.，25，3389-3402)進(jìn)行同源性分析來測(cè)定參照序列(本發(fā)明的序列)和受試序列之間的總體最佳對(duì)比。在序列匹配中，參照和受試序列都是DNA序列。通過將U轉(zhuǎn)變?yōu)門可以比較RNA序列。總體序列對(duì)比的結(jié)果以同一性百分比表示。序列匹配可通過程序中使用的缺省參數(shù)(default parameters)進(jìn)行。
在兩個(gè)核酸或多肽序列的上下文中，本文所用“序列同一性”或“同一性”涉及到在特定的比較窗中進(jìn)行最一致的對(duì)比時(shí)這兩個(gè)序列中相同的殘基。當(dāng)涉及蛋白質(zhì)時(shí)使用序列同一性百分比，應(yīng)認(rèn)為不相同的殘基位置經(jīng)常是因?yàn)楸Ｊ氐陌被崛〈兴煌?，其中氨基酸殘基被其它具有類似化學(xué)特性(例如電荷或疏水性)的氨基酸殘基取代，因此不會(huì)改變分子的功能特性。當(dāng)序列因保守取代而有所不同時(shí)，可將序列同一性百分比往上調(diào)以校正取代的保守特性。將因保守取代而有所不同的序列稱為具有“序列相似性”或“相似性”。進(jìn)行這種調(diào)節(jié)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。所述方法一般包括將保守取代評(píng)分為部分錯(cuò)配而不是全錯(cuò)配，從而增加序列同一性百分比。因此，例如，當(dāng)將相同的氨基酸評(píng)分計(jì)為1時(shí)，非-保守取代的評(píng)分為0，保守取代的評(píng)分在0和1之間?？梢允褂美鏟C/GENE程序(Intelligenetics，Mountain View，California，USA)計(jì)算保守取代的評(píng)分。
本文所用“序列同一性百分比”指的是通過在比較窗內(nèi)比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序列而測(cè)定的值，為了對(duì)兩個(gè)序列進(jìn)行最佳對(duì)比，比較窗中的多核苷酸序列部分相對(duì)于參照序列(不含有添加或缺失)而言，可含有添加或缺失(即缺口)。通過測(cè)定兩個(gè)序列中出現(xiàn)的相同核酸堿基或氨基酸殘基位置的數(shù)目以產(chǎn)生匹配位置數(shù)，將匹配位置數(shù)除以比較窗內(nèi)的總位置數(shù)，將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性百分比，從而計(jì)算出百分比。
關(guān)于多核苷酸序列的術(shù)語“基本同一性”指的是與使用一種以標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)描述的對(duì)比程序的參照序列相比，多核苷酸含有具有至少70％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％和最優(yōu)選至少95％序列同一性的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)為通過考慮到密碼子的簡并性，氨基酸的相似性，閱讀框的定位等，可以適當(dāng)調(diào)整上述數(shù)值，以測(cè)定相對(duì)應(yīng)的由兩個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的同一性。為此，氨基酸序列的基本同一性指的是序列同一性一般至少為60％，更優(yōu)選至少為70％，80％，90％，最優(yōu)選至少為95％。
在有關(guān)肽的上下文中，術(shù)語“基本同一性”表示在特定比較窗中與參照序列相比，所述肽含有與參照序列具有至少70％，優(yōu)選80％，更優(yōu)選85％，最優(yōu)選至少90％或95％序列同一性的序列。任選使用Needleman等，J.Mol.Biol. 48443(1970)的同源性對(duì)比算法進(jìn)行最佳匹配。例如，當(dāng)兩種肽僅因保守取代而有所不同時(shí)，則該肽與第二種肽基本上相同?！盎旧舷嗨频摹彪墓蚕砣缟纤龅男蛄?，不同之處在于不相同的殘基位置處可能會(huì)因保守的氨基酸改變而有所不同。
能控制鹽脅迫耐受性的本發(fā)明植物基因核苷酸序列的片段編碼能控制鹽脅迫耐受性之蛋白質(zhì)的生物活性部分，該片段編碼至少15，25，30，50，100，125，150，175，200或225個(gè)連續(xù)的氨基酸或編碼本發(fā)明的全長蛋白質(zhì)的全部氨基酸(如SEQ ID NO2的243個(gè)氨基酸)。一般說來，用作PCR引物雜交探針的、能控制鹽脅迫耐受性的植物基因核苷酸序列的片段不編碼能控制植物中的鹽脅迫耐受性的蛋白質(zhì)的生物活性部分。
本發(fā)明的范圍還可包括編碼得自非水稻之植物的能控制鹽脅迫耐受性的植物基因的多核苷酸。例如，通過使用基于已公開的核苷酸序列的全長或部分序列而設(shè)計(jì)的引物，以選定植物的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，接著使用所得的擴(kuò)增DNA片段為探針篩選相同植物的基因組DNA或cDNA文庫，即可分離出多核苷酸。在此方法中，可以使用如PCR，雜交等的方法，基于這些序列與本文所述序列的序列同一性來對(duì)其進(jìn)行鑒定。本發(fā)明包括基于這些序列與本文所述序列或其片段的序列同一性而分離的序列。
在雜交技術(shù)中，將已知核苷酸序列的全長或部分序列用作探針，所述探針與得自選定生物體的一組克隆基因組DNA片段或cDNA片段(即基因組文庫或cDNA文庫)中存在的、其它相應(yīng)的核苷酸序列選擇性雜交。雜交探針可以是基因組DNA片段，cDNA片段，RNA片段，或其它寡核苷酸，并可用可檢測(cè)的基團(tuán)(如32P)或任何其它可測(cè)標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。因此，通過對(duì)基于本發(fā)明能控制植物的鹽脅迫耐受性的植物基因的核苷酸序列的合成寡核苷酸進(jìn)行標(biāo)記，即可制備雜交探針。雜交以及制備構(gòu)建cDNA文庫和基因組文庫探針的方法是本領(lǐng)域公知的，并公開于Sambrook等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York，列入本文作為參考)。
例如，可將編碼本文所公開的、能控制鹽脅迫耐受性之植物基因的核苷酸序列的全長或至少一個(gè)部分序列用作探針，所述探針可特異地與相應(yīng)的、能控制鹽脅迫耐受性的植物基因序列及其信使RNA雜交。為了在不同的條件下進(jìn)行特異性雜交，所述探針對(duì)能控制鹽脅迫耐受性的植物基因序列而言是獨(dú)一無二的，其包括長度優(yōu)選至少約為10個(gè)核苷酸，最優(yōu)選至少約為20個(gè)核苷酸的序列?？稍赑CR中使用所述探針以擴(kuò)增得自選定生物體的、能控制鹽脅迫耐受性的植物基因序列。PCR擴(kuò)增的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(PCR TechnologyPrinciples and Applications for DNA Amplification，HAErlich ed.，F(xiàn)reeman Press，New York，NY(1992)；PCR ProtocolsA Guide toMethods and Applications，Innis，Gelfland，Snisky，and White ed.，AcademicPress，San Diego，CA(1990)；Mattila等.(1991)Nucleic Acids Res.194967；Eckert，K.A.and Kunkel，I.A.(1991)PCR Methods and Applications 1∶17；PCR，McPherson，Quirkes，and Taylor，IRL Press，Oxford，皆列入本文作為參考)?？蓪⒋思夹g(shù)用作診斷試驗(yàn)以從所需生物體中進(jìn)一步地分離出編碼序列，或測(cè)定生物體中是否存在編碼序列。雜交技術(shù)包括對(duì)平鋪DNA文庫的雜交篩選(噬斑或菌落；例如Sambrook等.(1989)Molecular CloningA LaboratoryManual(2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York))。
可在嚴(yán)緊條件下進(jìn)行序列雜交。在術(shù)語“嚴(yán)緊條件”或“嚴(yán)緊雜交條件”所涉及的條件下，探針與其靶序列雜交的可測(cè)程度大于其它序列(例如至少比背景大2倍)。嚴(yán)緊條件依賴于序列，在不同情況下會(huì)有所不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)緊度，可鑒定出與探針100％互補(bǔ)的靶序列?；蛘撸烧{(diào)節(jié)嚴(yán)緊條件，使序列中出現(xiàn)一些錯(cuò)配，從而檢測(cè)出較低水平的相似性。一般說來，探針的長度低于約1000個(gè)核苷酸，優(yōu)選其長度低于500個(gè)核苷酸。
一般說來，嚴(yán)緊條件下的鹽濃度低于約1.5M Na離子，一般約為0.01至1.0M Na離子濃度(或其它鹽)(pH7.0至8.3)，溫度對(duì)短探針(例如10至50個(gè)核苷酸)而言至少約為30℃，對(duì)長探針(例如大于50個(gè)核苷酸)而言至少約為60℃。添加去穩(wěn)定劑(例如甲酰胺)也可獲得嚴(yán)緊條件。嚴(yán)緊條件包括例如于37℃，用30至35％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS(十二烷基硫酸鈉)為緩沖溶液進(jìn)行雜交，并于50至55℃，在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M檸檬酸鈉)中洗滌。更嚴(yán)緊的條件包括例如于37℃，在40至45％甲酰胺，1.0M NaCl，1％SDS中進(jìn)行雜交，并于55至60℃，在0.5×至1×SSC中洗滌。甚至更嚴(yán)緊的條件還包括例如于37℃，在50％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS中進(jìn)行雜交，并于60至65℃，在0.1×SSC中洗滌。
特異性一般為雜交后洗滌的函數(shù)，至關(guān)重要的因素是最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對(duì)于DNA-DNA雜交體而言，可由Meinkoth和Wahl(1984)，Anal.Biochem.，138267-284Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L的等式大致算出Tm；其中M是單價(jià)陽離子的摩爾濃度，％GC是DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是雜交溶液中甲酰胺的百分比，L是雜交體的堿基對(duì)長度。Tm是50％互補(bǔ)靶序列與精確匹配的探針雜交時(shí)的溫度(在確定的離子強(qiáng)度和pH下)。每當(dāng)出現(xiàn)1％錯(cuò)配，Tm降低約1℃；因此，可以調(diào)節(jié)Tm，雜交和/或洗滌條件以與所需同一性的序列列雜交。例如，如果想尋找具有至少90％同一性的序列，可將Tm降低10℃。一般說來，將嚴(yán)緊條件選擇為比確定離子強(qiáng)度和pH下特定序列及其互補(bǔ)序列的熱解鏈溫度(Tm)約低5℃。然而，高度嚴(yán)緊條件可利用比熱解鏈溫度(Tm)低1，2，3或4℃時(shí)的雜交和/或洗滌；中度嚴(yán)緊條件可利用比熱解鏈溫度(Tm)低6，7，8，9或10℃時(shí)的雜交和/或洗滌；低度嚴(yán)緊條件可利用比熱解鏈溫度(Tm)低11，12，13，14，15或20℃時(shí)的雜交和/或洗滌。使用上述等式，雜交和洗滌組合物和所需的Tm，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)懂得其中暗含雜交和/或洗滌溶液嚴(yán)緊度的變化。如果所需程度的錯(cuò)配導(dǎo)致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，優(yōu)選增加SSC濃度，從而可以使用較高的溫度。有關(guān)核酸雜交的詳細(xì)指南可參見Tijssen(1993)，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology Hybridization with Nucleic Acid Probes，第一部分，第二章2(Elsevier，New York)；and Ausubel，等.，Eds.(1995)，Current Protocols in Molecular Biology，第二章2(Greene Publishing andWiley-Interscience，New York)。還可參見Sambrook等.(1989)MolecularCloningA Laboratory Manual(2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York，列入本文作為參考)。
通過本領(lǐng)域已知的核苷酸序列分析法，或者可商購的自動(dòng)測(cè)序儀，可以測(cè)定所得基因的堿基序列。
一般根據(jù)本文所述的方法獲得本發(fā)明的多核苷酸，也可以基于本發(fā)明所述的序列，通過化學(xué)合成獲得所述多核苷酸。例如，可根據(jù)廠商提供的說明書，使用購自Applied BioSystems，Inc.的多核苷酸合成儀(目前使用的PerkinElmer)來合成本發(fā)明的多核苷酸。
如下文實(shí)施例所述，編碼本發(fā)明的植物基因的多核苷酸顯然決定著對(duì)鹽脅迫和滲透壓脅迫的敏感性。已知植物對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)與對(duì)諸如干旱，高滲透壓，低溫等的環(huán)境脅迫的反應(yīng)部分一致(蛋白質(zhì)·核酸·酶)[Protein/Nucleicacid/Enzyme](1999)Vol.44，2147-2148/2188-2198；Curr.Opinion.Plant.Biol.(2001)vol.4241-246；Curr.Opinion.Plant.Biol.(2000)vol.3217-223；TRENDS in Plant Science(2001)Vol.666-71)。本發(fā)明的多核苷酸很有可能與干旱或低溫引起的脅迫有關(guān)。當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸表現(xiàn)出其功能時(shí)，植物一般是在脅迫條件下生長，或植物的生長不會(huì)受到不利的影響。然而，當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸因故不起作用時(shí)，植物在脅迫條件下的生長會(huì)受到抑制。
可按下文所述證實(shí)通過上述基因工程方法或化學(xué)合成方法產(chǎn)生的多核苷酸的所需特性，即控制鹽脅迫耐受性的能力。具體地說，使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，將所得多核苷酸導(dǎo)入鹽脅迫敏感型植物(例如下文實(shí)施例1中所得的ND1004(-/-)株系)。如果鹽脅迫耐受性得以恢復(fù)，即可證實(shí)所需活性，即控制鹽脅迫耐受性之作用的存在。通過與實(shí)施例5所述的基本上相同的方法，可以證實(shí)控制鹽脅迫耐受性之作用的存在。例如，假定將多核苷酸導(dǎo)入ND1004(-/-)株系。如果如實(shí)施例5所述，ND1004(-/-)株系表現(xiàn)出與野生型植物基本上相同的鹽脅迫耐受性，即可證實(shí)鹽脅迫耐受性的存在?！氨憩F(xiàn)出與野生型植物基本上相同的鹽脅迫耐受性”指的是如實(shí)施例5所述，在鹽脅迫條件下和非鹽脅迫條件下，導(dǎo)入了本發(fā)明的多核苷酸的植物的生長沒有顯著差異。注意本文所用的“鹽脅迫條件”指的是植物可在上述具有中等/低濃度(例如50至300mM，優(yōu)選為100至150mM)鹽的培養(yǎng)介質(zhì)(如土壤，允許培養(yǎng)植物的培養(yǎng)基(固體或液體)等)中生長。
因此，可以使用本發(fā)明的多核苷酸操縱植物對(duì)上述脅迫(包括鹽脅迫和滲透壓脅迫)的敏感性，或選擇對(duì)脅迫具有不同敏感性的植物(例如可通過使用基于具有本發(fā)明之序列的多核苷酸的全部或部分序列的探針或引物篩選多個(gè)植物株系)。
可以使用本發(fā)明的多核苷酸來產(chǎn)生對(duì)上述脅迫具有增強(qiáng)的耐受性的植物。優(yōu)選這些植物可用于農(nóng)業(yè)。開發(fā)脅迫耐受型植物有望減少因環(huán)境脅迫造成的農(nóng)業(yè)損害，并帶來有益效果，如因栽培面積擴(kuò)大導(dǎo)致的作物產(chǎn)量增加，和對(duì)環(huán)境的保護(hù)作用。
可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法，將天然或修飾形式的本發(fā)明的多核苷酸與適當(dāng)?shù)闹参锉磉_(dá)載體相連接，并使用已知的基因重組技術(shù)將載體導(dǎo)入植物細(xì)胞?；驌饺胫参锛?xì)胞的DNA。植物細(xì)胞的DNA包括多種細(xì)胞器(例如線粒體和葉綠體)中含有的DNA，以及染色體。
本文所用“植物表達(dá)載體”指的是在宿主植物細(xì)胞中與多種調(diào)節(jié)元件(如調(diào)節(jié)本發(fā)明基因之表達(dá)的啟動(dòng)子)可操作相連的核酸序列。本文所用術(shù)語“調(diào)控序列”指的是具有功能性啟動(dòng)子和任何相關(guān)轉(zhuǎn)錄元件(如增強(qiáng)子，CCAAT盒，TATA盒和SPI位點(diǎn))的DNA序列。本文所用術(shù)語“可操作相連”表示多核苷酸與調(diào)節(jié)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)元件(如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子)相連接，使得基因能被表達(dá)。植物表達(dá)載體優(yōu)選包括植物基因啟動(dòng)子，終止子，藥物-抗性基因和增強(qiáng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知可以根據(jù)宿主細(xì)胞的不同來改變所用表達(dá)載體的類型和調(diào)節(jié)元件的類型。本發(fā)明使用的植物表達(dá)載體可具有T-DNA區(qū)域。T-DNA區(qū)域可增強(qiáng)基因?qū)氲男剩?dāng)使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物時(shí)，情況更是如此。
本文所用術(shù)語“植物基因啟動(dòng)子”指的是在植物中表達(dá)的啟動(dòng)子?？梢允褂弥参飭?dòng)子片段，所述片段可介導(dǎo)本發(fā)明的多核苷酸在再生植物的所有組織中表達(dá)。用于結(jié)構(gòu)表達(dá)的啟動(dòng)子包括例如胭脂氨酸合酶基因的啟動(dòng)子(Langridge，1985，Plant Cell Rep.4，355)，用于產(chǎn)生花椰菜花葉病毒19S-RNA的啟動(dòng)子(Guilley，1982，Cell 30，763)，用于產(chǎn)生花椰菜花葉病毒35S-RNA的啟動(dòng)子(Odell，1985，Nature 313，810)，水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(Zhang，1991，PlantCell 3，1155)，玉米遍在蛋白啟動(dòng)子(Comejo 1993，Plant Mol.Biol.23，567)，和REXψ啟動(dòng)子(Mitsuhara，1996，Plant Cell Physiol.37.49)。
或者，植物啟動(dòng)子可在特定組織中介導(dǎo)本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)，或者要不然也可以處于更特異的環(huán)境或發(fā)育控制之下。本文將這種啟動(dòng)子稱為“可誘導(dǎo)的”啟動(dòng)子。可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子包括例如可通過環(huán)境條件，如光，低溫，高溫，干旱，紫外光照射，或噴灑特定的化合物外界因素來誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子的例子包括可用光照射誘導(dǎo)的、編碼核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞單位的基因的啟動(dòng)子(Fluhr，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，2358)，可用低溫誘導(dǎo)的水稻lip19基因啟動(dòng)子(Aguan，1993，Mol.Gen.Genet.240，1)，可用高溫誘導(dǎo)的水稻hsp72和hsp80基因啟動(dòng)子(Van Breusegem，1994，Planta 193，57)，可用干旱誘導(dǎo)的擬南芥rab16基因啟動(dòng)子(Nundy，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，1406)，和可用紫外光照射誘導(dǎo)的玉米醇脫氫酶基因啟動(dòng)子(Schulze-Lefert，1989，EMBO J.8，651)。通過噴灑植物激素脫落酸可以誘導(dǎo)rab16基因啟動(dòng)子。
“終止子”是位于基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)下游、并參與DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA時(shí)的轉(zhuǎn)錄終止，及poly A序列的添加的序列。已知終止子有助于mRNA的穩(wěn)定性，并對(duì)基因表達(dá)的量有影響。終止子的例子包括但不限于CaMV35S終止子和胭脂氨酸合酶基因的終止子(Tnos)。
“藥物-抗性基因”是利于選擇轉(zhuǎn)化植物的基因。優(yōu)選使用賦予卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NPTII)基因，賦予潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因等。本發(fā)明并不局限于此。
可以使用“增強(qiáng)子”以增強(qiáng)目的基因的表達(dá)效率。優(yōu)選的增強(qiáng)子是含有CaMV35S啟動(dòng)子內(nèi)的上游序列的增強(qiáng)子區(qū)域。每有一個(gè)植物表達(dá)載體可以使用多個(gè)增強(qiáng)子。
可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的基因重組技術(shù)制備上述植物表達(dá)載體。在構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，除了下文實(shí)施例中所用的載體外，優(yōu)選使用pBI載體或pUC載體。本發(fā)明并不局限于此。
根據(jù)導(dǎo)入方法等，用于導(dǎo)入DNA的植物材料可以適當(dāng)?shù)剡x自葉、莖、根、塊莖、原生質(zhì)體、愈傷組織、花粉、胚、莖干原基?！爸参锛?xì)胞”可以是任何植物細(xì)胞?！爸参锛?xì)胞”的例子包括植物器官中的組織的細(xì)胞，如葉和根；愈傷組織；和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。植物細(xì)胞可以是任何形式的培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)組織，培養(yǎng)器官，或植物。優(yōu)選植物細(xì)胞是培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)組織或培養(yǎng)器官。更優(yōu)選植物細(xì)胞是培養(yǎng)細(xì)胞。
導(dǎo)入DNA的植物培養(yǎng)細(xì)胞一般是原生質(zhì)體。可通過物理化學(xué)方法，如電穿孔法和聚乙二醇法將DNA導(dǎo)入植物培養(yǎng)細(xì)胞。導(dǎo)入DNA的植物組織是葉、莖、根、塊莖、愈傷組織、花粉、胚、莖干原基，優(yōu)選為葉，莖和愈傷組織?？赏ㄟ^生物學(xué)方法使用病毒或農(nóng)桿菌或物理化學(xué)方法如顆粒槍方法，將DNA導(dǎo)入植物組織。使用農(nóng)桿菌的方法披露于例如Nagel等(Microbiol.Lett.，67，325(1990))。在此方法中，首先使用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(例如通過電穿孔)，然后通過眾所周知的方法，如葉盤轉(zhuǎn)化法將經(jīng)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物組織。這些方法是本領(lǐng)域眾所周知的?？梢赃m當(dāng)選擇適用于被轉(zhuǎn)化植物的方法。
用藥物抗性，如卡那霉素抗性選擇已導(dǎo)入植物表達(dá)載體的細(xì)胞?？赏ㄟ^常用的方法將選定細(xì)胞再生成植物。
通過在再分化的培養(yǎng)基，無激素MS培養(yǎng)基等中培養(yǎng)植物細(xì)胞，可將已導(dǎo)入本發(fā)明多核苷酸的植物細(xì)胞再生為植物。通過將生根不久的植物轉(zhuǎn)移至土壤中，接著進(jìn)行培養(yǎng)，可以使其生長成植物。再分化法根據(jù)植物細(xì)胞類型的不同而有所不同。多種植物的再分化法描述于水稻(Fujimura，1995，PlantTissue Culture Lett.2，74)；玉米(Shillito，1989，Bio/Technol.7，581；Gorden-Kamm，1990，Plant Cell 2，603)；馬鈴薯(Visser，1989，Theor.Appl.Genet.78，594)；和煙草(Nagata，1971，Planta 99，12)。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法可以證實(shí)本發(fā)明的導(dǎo)入基因在再生植物中的表達(dá)。使用例如Northern印跡可以進(jìn)行證實(shí)。具體地說，從植物葉中提取總RNA，在變性瓊脂糖上對(duì)所述RNA進(jìn)行電泳，并將其印跡至適當(dāng)?shù)哪ど?。使該印跡與經(jīng)標(biāo)記的RNA探針雜交，所述探針與導(dǎo)入基因的一部分互補(bǔ)，從而檢測(cè)出本發(fā)明基因的mRNA。
可使用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物包括任何可以導(dǎo)入基因的植物。本文所用術(shù)語“植物”涉及整個(gè)植物，植物器官(如葉、莖、根等)，種子，植物繁殖器(如花粉)，和植物細(xì)胞，以及它們的后代。本文所用植物細(xì)胞包括但不限于種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)域、愈傷組織、葉、根、莖、配子體、孢子體、花粉和小孢子。術(shù)語“植物”包括單子葉和雙子葉植物。所述植物包括任何有用的植物，特別是作物植物，蔬菜植物和花卉植物。優(yōu)選的植物包括但不限于水稻、玉米、高粱、大麥、小麥、黑麥、稗子、小米、天門冬屬植物、馬鈴薯、白蘿卜、大豆、豌豆、油菜籽、菠菜、番茄和矮牽牛。適用于本發(fā)明的最優(yōu)選植物是水稻，尤其是Japonica水稻。
可用于本發(fā)明的制備方法的植物類型包括例如茄科、禾本科、十字花科、薔薇科、豆科、葫蘆科、唇形科、百合科、藜科和傘形科。
茄科植物的例子包括煙草屬、茄屬、曼陀羅屬、番茄屬和碧冬茄屬植物。具體例子包括煙草、茄子、馬鈴薯、番茄、辣椒和矮牽牛。
禾本科植物的例子包括稻屬、大麥屬、黑麥屬、甘蔗屬、稗屬和玉蜀黍?qū)僦参?。具體例子包括水稻、大麥、黑麥、稗子、高粱和玉米。
十字花科植物的例子包括蘿卜屬、蕓苔屬、擬南芥屬、辣根屬和薺屬植物。具體例子包括白蘿卜、油菜籽、擬南芥、日本辣根和薺菜。
薔薇科植物的例子包括李屬、蘋果屬、梨屬、草莓屬和薔薇屬植物。具體例子包括梅子、桃、蘋果、梨、荷蘭草莓和玫瑰。
豆科植物的例子包括大豆屬、豇豆屬、菜豆屬、豌豆屬、野豌豆屬、落花生屬、車軸草屬、紫苜蓿和苜蓿屬植物。具體例子包括大豆、赤豆、菜豆、豌豆、蠶豆、花生、苜蓿和南苜蓿。
葫蘆科植物的例子包括絲瓜屬、葫蘆和黃瓜屬植物。具體例子包括葫蘆、南瓜、黃瓜和甜瓜。
唇形科植物的例子包括薰衣草屬、薄荷屬和紫蘇屬植物。具體例子包括薰衣草、薄荷和紫蘇。
百合科植物的例子包括蔥屬、百合屬和郁金香屬植物。具體例子包括蔥、大蒜、百合和郁金香。
藜科植物的例子包括菠菜屬植物。具體例子是菠菜。
傘形科植物的例子包括當(dāng)歸、胡蘿卜、鴨兒芹和芹屬植物。具體例子包括日本土當(dāng)歸，胡蘿卜，鴨兒芹和芹菜。下文所用命名和下文所述實(shí)驗(yàn)室方法經(jīng)常包括本領(lǐng)域眾所周知的和常用的方法。重組方法、多核苷酸合成和細(xì)胞培養(yǎng)使用的是標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。技術(shù)和方法一般可按照本領(lǐng)域和多篇一般性的參考文獻(xiàn)中的常規(guī)方法進(jìn)行(一般可參見Sambrook等.Molecular CloningALaboratory Manual，2nd ed.(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，列入本文作為參考)。
下文將通過實(shí)施例描述本發(fā)明。本發(fā)明并不局限于此。除非另有說明，實(shí)施例中所用的材料、試劑等都可以購買獲得。
實(shí)施例(實(shí)施例1通過培養(yǎng)激活Tosl7并鑒定所得突變體)如Hirochika等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，7783-7788(文獻(xiàn)同上)所述，將“日本晴”，“Hitomebore”等(Japonica水稻品種)的成熟種子用作起始材料以進(jìn)行愈傷組織起始培養(yǎng)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。根據(jù)大槻的方法(1990)(水稻原生質(zhì)體培養(yǎng)系，農(nóng)林水產(chǎn)技術(shù)信息協(xié)會(huì))，確定為破壞基因而激活Tosl7所用的培養(yǎng)條件。
簡單地說，在含有2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)成熟的水稻種子(大槻(1990)，文獻(xiàn)同上)(25℃，1個(gè)月)，以誘導(dǎo)愈傷組織。在含有2，4-D的N6液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得愈傷組織(大槻(1990)，文獻(xiàn)同上)達(dá)5個(gè)月，將所述愈傷組織轉(zhuǎn)移至再分化培養(yǎng)基(大槻(1990)，文獻(xiàn)同上)，獲得再分化的水稻(第一代(R1)植物)。
從每株植物中回收約20粒R1種子。用1.0％次氯酸鈉對(duì)種子進(jìn)行消毒，接著徹底清洗。將種子浸入25℃水中達(dá)24小時(shí)。然后，將種子鋪在含有150mM氯化鈉的MS固體培養(yǎng)基(描述于Murashige and Skoog，1962，Physiol.Plant.，15，473-497)上，所述培養(yǎng)基可提供鹽脅迫條件。獲得第二代(R2)植物，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。萌發(fā)后3至4周，仔細(xì)觀察R2組的每個(gè)植株的表型。結(jié)果，在ND1004株系(品種日本晴)的R2組中發(fā)現(xiàn)一個(gè)突變體，與野生型ND1004相比，在鹽脅迫條件下，該突變體的莖干和根的生長受到顯著抑制(圖1A最左邊的幼苗除外)，根出現(xiàn)明顯分支(圖1B右邊的幼苗)。另一方面，在鹽脅迫條件下，野生型ND1004的生長未受顯著抑制(圖1A最左邊的幼苗；和圖1B左邊的幼苗)。
因此，可以推斷Tosl7轉(zhuǎn)換所致的基因破壞就是鹽脅迫條件下該表型表達(dá)的原因所在。
(實(shí)施例2分離Tosl7的側(cè)翼序列)為了找到控制實(shí)施例1中所觀察到的表型的基因，需分離已被轉(zhuǎn)移至基因組DNA中的Tosl7側(cè)翼序列。
通過CTAB法(Murray and Thompson，1980，Nucleic Acids Res，8，4321-4325)，由實(shí)施例1中所得的R2水稻(ND1004株系)制備DNA。使用如文獻(xiàn)所述(Hirochika等，1996，文獻(xiàn)同上；和Sugimoto等，1994，Plant J.，5，863-871)的總DNA，通過反向PCR擴(kuò)增Tosl7靶位點(diǎn)序列。
簡單地說，先用XbaI消化約0.5μg得自突變植物(ND1004-/-株系)的總DNA，在所述DNA中，Tosl7已通過轉(zhuǎn)座插入靶位點(diǎn)。用酚/氯仿提取經(jīng)消化的DNA，接著用乙醇沉淀以進(jìn)行純化。然后，于12℃，在300μl總體積中，使用T4 DNA連接酶連接過夜。純化連接的DNA，將其中的1/3用作PCR模板。使用下列引物經(jīng)PCR進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)Tosl7-3911F，GAGAGCATCATCGGTTACATCTTCTC和Tosl7-XbaI-R，CATGAAATAGATCCATGTATA TCT。將反向PCR產(chǎn)物克隆至pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen)，接著使用測(cè)序儀(ABI，310型)進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)所得序列，設(shè)計(jì)出引物0F，GCCATCACAAATCAGCAAGC和引物3R，ATGGATTGAAGGCCAAGCCAC。使用這些引物和正常植物(未經(jīng)組織培養(yǎng))的總DNA進(jìn)行反向PCR，以擴(kuò)增出Tosl7插入的靶位點(diǎn)。如上所述對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序。
(實(shí)施例3對(duì)突變體中的引發(fā)基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析)按照下述方法制備在土壤中生長11天的野生型水稻(日本晴)幼苗的RNA。首先，使用ISOGEN溶液提取幼苗的總RNA。將總RNA上樣于mRNA純化試劑盒(Stratagene)中包括的寡(dt)纖維素柱以獲得poly(A)mRNA。通過常用方法，由所得的poly(A)mRNA合成cDNA。在HybriZAP-2.1載體(Stratagene)中構(gòu)建cDNA文庫。cDNA文庫的感染能力為5×105個(gè)噬斑。使用大腸桿菌菌株XL1-Blue MRF2體內(nèi)裂解包含cDNA插入片段的pBluescript質(zhì)粒。
根據(jù)Molecular Cloning，A Laboratory Manual(Sambrook等，1989)所述的方法篩選cDNA文庫，其中將實(shí)施例2中獲得的、Tosl7側(cè)翼序列的反向PCR產(chǎn)物用作探針。
從cDNA文庫中獲得9個(gè)表現(xiàn)出強(qiáng)雜交信號(hào)的cDNA克隆。
使用3100型測(cè)序儀(Applied Biosystems(ABI))，在兩個(gè)方向上對(duì)9個(gè)克隆中最長的，大小約為1.2kb的cDNA進(jìn)行測(cè)序，接著使用開放閱讀框(ORF)和BLAST(Altshul等，1997，Nucleic Acids Res.，25，3389-3402)進(jìn)行同源性分析，并使用Mac Vector 6.0程序(帝人系統(tǒng)技術(shù)株式會(huì)社)進(jìn)行分析。
根據(jù)測(cè)序分析，最長cDNA克隆的長度為1154bp(SEQ ID NO1)。使用Mac Vector 6.0程序包的mRNA分析鑒定出最長的開放閱讀框?yàn)?29bp，它編碼由243個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)。由SEQ ID NO1表示的1154bp cDNA序列示于圖3。開放閱讀框位于cDNA序列的第233-961位。由開放閱讀框編碼的多肽的推定氨基酸序列(SEQ ID NO2)示于圖4。
(實(shí)施例4搜索獨(dú)立的突變株系)在實(shí)施例1中，選擇突變株系ND1004，該株系在鹽脅迫條件下表現(xiàn)出莖干和根的生長抑制作用。在實(shí)施例3中，分離出控制該表型的候選基因。如果相同基因內(nèi)具有Tosl7插入突變的其它獨(dú)立的突變株系中也能觀察到相同的表型，即可得出以下結(jié)論實(shí)施例3中分離出的基因是控制上述表型的基因。為了證實(shí)這一點(diǎn)，按下述方法篩選獨(dú)立的突變株系。
按實(shí)施例2所述，由再分化的水稻組制備DNA。使用實(shí)施例3中所得cDNA的堿基序列設(shè)計(jì)出下列四個(gè)引物，使用上述DNA為模板進(jìn)行PCRGTCTGGCCAGTCGTGCAA TG；CTGCTGGCAAGAGGGCTGAT；TGGGTTCTTGGTGGCCTCAT；和GCCAAGCCACT GAAGCCATT。根據(jù)宮尾安藝雄和廣近洋彥(2001)，水稻Tosl7-基因破壞法[Gene DestructionMethod Using rice Tosl7]，細(xì)胞工程學(xué)續(xù)編[Special Issue of CellularEngineering]“植物基因科學(xué)的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃[Protocol for Plant Genome Science]”，秀潤社，73-81所述的方法，對(duì)突變體進(jìn)行PCR篩選。結(jié)果，獲得一種突變株系NC8328(得自日本晴品種)。
使用圖3中所述的cDNA序列為問句，搜索Tosl7側(cè)翼序列數(shù)據(jù)庫(http//pc7080.abr.affrc.go.jp/～miyao/pub/Tosl7/)。結(jié)果，鑒定出另一個(gè)突變株系H0851(得自Hitomebore品種)。
當(dāng)如實(shí)施例1中所述，在鹽脅迫條件下培養(yǎng)這些株系時(shí)，在它們的莖干和根中觀察到生長抑制作用和形態(tài)學(xué)異常(圖2A(NC8328；最左邊的植株表示野生型，中間和右邊的植株表示突變型)和圖2B(H0851；最左邊的植株表示野生型，4株其它幼苗為突變型))。
(實(shí)施例5評(píng)價(jià)鹽脅迫敏感性)在此實(shí)施例中將研究實(shí)施例2至4中獲得的基因與鹽脅迫敏感性之間的關(guān)系。將日本晴株系ND1004選定為具有該基因的株系，而將ND1004-/-株系用作基因已被破壞的突變體。
在ND1004株系的R2代，具有正常基因的個(gè)體和具有破壞基因的突變體被分離開來。在下述實(shí)驗(yàn)中，將前者稱為ND1004+/+株系，而將后者稱為ND1004-/-株系。進(jìn)行Southern分析以測(cè)定植物是否為突變體。具體地說，從R2代ND1004株系的植物中提取DNA。用限制性酶XbaI裂解DNA，接著進(jìn)行瓊脂糖電泳。將DNA轉(zhuǎn)印至尼龍膜上。然后，使用經(jīng)32P標(biāo)記的基因?yàn)樘结樳M(jìn)行雜交以證實(shí)基因的突變。將表現(xiàn)出突變型帶模式的個(gè)體稱為ND1004-/-株系。在Molecular Cloning，A Laboratory Manual(Sambrook等，1989)所述的條件下進(jìn)行上述分析。
用1.0％次氯酸鈉對(duì)野生型ND1004和突變型ND1004-/-的種子(每株植物約30粒種子)進(jìn)行消毒，接著徹底清洗。將種子浸入25℃水中達(dá)24小時(shí)。然后，將種子鋪在含有0mM和150mM氯化鈉的MS固體培養(yǎng)基(描述于Murashige and Skoog，文獻(xiàn)同上)上。在無菌條件下萌發(fā)種子，于25℃培養(yǎng)18天，其中在光照中放置14小時(shí)，在黑暗中放置10小時(shí)。圖5A和B中顯示了這些植物的生長。圖5A顯示了不含氯化鈉的培養(yǎng)基中的野生型和突變型的莖干和根(左邊)以及根(右邊)(在左邊的照片中，最左邊的植物是野生型，其它為突變型；在右邊的照片中，左邊的植物為野生型，右邊的植物為突變型)。B顯示了含氯化鈉的培養(yǎng)基中生長的野生型(最左邊)和突變型(其它三個(gè)個(gè)體)的莖干和根。在鹽脅迫條件下和非-鹽脅迫條件下，野生型ND1004株系的莖干和根的形態(tài)學(xué)沒有顯著差異，但野生型ND1004株系的生長稍有延遲(圖5A和5B)。在處于鹽脅迫條件之下的突變型ND1004-/-中，在莖干和根中觀察到顯著的生長抑制作用，并且在根中觀察到形態(tài)學(xué)異常(圖5B)。而在非-脅迫條件下未觀察到這種生長抑制作用和形態(tài)學(xué)異常(圖5A)。
另外，當(dāng)突變型萌發(fā)并生長于無鹽脅迫的土壤中時(shí)(在溫室中培養(yǎng)3個(gè)月)，它能正常生長(圖5C)。
因此，通過破壞基因能表達(dá)對(duì)鹽脅迫的敏感性。這表明基因決定了對(duì)鹽脅迫的敏感性。
(實(shí)施例6評(píng)價(jià)對(duì)滲透壓脅迫的敏感性)在此實(shí)施例中將研究實(shí)施例2至4中獲得的基因與滲透壓脅迫敏感性之間的關(guān)系。將日本晴株系ND1004選定為具有該基因的株系，而將ND1004-/-株系用作基因已被破壞的突變體。
用1.0％次氯酸鈉對(duì)野生型ND1004和突變型ND1004-/-的種子(每株植物約30粒種子)進(jìn)行消毒，接著徹底清洗。將種子浸入25℃水中達(dá)24小時(shí)。然后，在與實(shí)施例5中所述相同的條件下，在不含甘露糖醇的MS固體培養(yǎng)基(描述于Murashige and Skoog，文獻(xiàn)同上)中無菌萌發(fā)并培養(yǎng)種子11天。切取生長11天的幼苗的莖干和根的靠上方的部分(圖6中的箭頭表示切下的部分)。將其余的組織切片轉(zhuǎn)移至含有150mM甘露糖醇的MS固體培養(yǎng)基上，在與上述相同的條件下再培養(yǎng)7天。野生型的根重新長出并正常生長，而在突變型新長出的根中觀察到顯著的生長抑制作用(右邊的植物表示突變型，其余兩株植物表示野生型)。
因此，通過破壞基因也能表達(dá)對(duì)滲透壓脅迫的敏感性。這表明該基因決定了對(duì)滲透壓脅迫的敏感性。
上述實(shí)施例闡明了本發(fā)明的多個(gè)方面，以及如何產(chǎn)生和使用本發(fā)明的特定寡核苷酸。本發(fā)明并不局限于此。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了能控制環(huán)境脅迫耐受性的新的多核苷酸，它可應(yīng)用于植物培育。另外，還提供了可用于操縱對(duì)環(huán)境脅迫的敏感性，選擇具有不同敏感性的植物和培育出對(duì)環(huán)境脅迫耐受性更強(qiáng)的有用植物的多核苷酸。
序列表序列表<110>獨(dú)立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所(President of National Institute of Agrobiological Sciences)生物系特定產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究推進(jìn)機(jī)構(gòu)(Chairman of the Board of Directors，Bio-oriented Technology ResearchAdvancement Institution)<120>控制對(duì)鹽脅迫的耐受性的新的水稻基因<130>J1-01412279<160>10<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1154<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<220><221>CDS<222>(233)..(964)<400>1aaaatttccc ctttcctctc cacgccaaga aacgcaaaac ccccacgccg accaaggcga 60gaagcgccgc cgccgaatcg aaccgcga tcgcgcccttct cccgccgccc ccgcgcgctc 120ttctcctcct cgtcctcgac gccgctgtgc cggagtttag gcggagatcg atccggagcg 180gggtttctct tctacctggc aaggttgagg aagaaaagct tgctgatttg tg atg gct 238Met Ala1gcc cca act gca aca gct gtt ttt ctt gat gag aac ctg cat atc cat 286Ala Pro Thr Ala Thr Ala Val Phe Leu Asp Glu Asn Leu His Ile His5 10 15agg ggg cct gct ggc aag agg gct gat gga ttg aag gcc aag cca ctg 334Arg Gly Pro Ala Gly Lys Arg Ala Asp Gly Leu Lys Ala Lys Pro Leu20 25 30aag cca tta gca gca aag caa ggg ctt caa gag aag aag gcc ctg agg 382Lys Pro Leu Ala Ala Lys Gln Gly Leu Gln Glu Lys Lys Ala Leu Arg35 40 45 50gat gta tcc aac att ggc aag ccc ccg gtg tct acg cgg aag ccc ctg 430Asp Val Ser Asn Ile Gly Lys Pro Pro Val Ser Thr Arg Lys Pro Leu55 60 65cag gac gtg tcc aac acc gcc aag ccc cga ggg cgc aac att tct gat 478Gln Asp Val Ser Asn Thr Ala Lys Pro Arg Gly Arg Asn Ile Ser Asp70 75 80ggc act acc ttg aag aag act gct ctt cgc agc cat gag gcc acc aag 526Gly Thr Thr Leu Lys Lys Thr Ala Leu Arg Ser His Glu Ala Thr Lys85 90 95aac cca gtg aag aag act gta atc ttt tct gat gag acc gca aaa tgt 574Asn Pro Val Lys Lys Thr Val Ile Phe Ser Asp Glu Thr Ala Lys Cys100 105 110cat gaa tgg gct aag gat ggg gtg gag ggc acc cac ttc act ggg aat 622His Glu Trp Ala Lys Asp Gly Val Glu Gly Thr His Phe Thr Gly Asn115 120 125 130gat tct cag aag ttg gaa aag gac agt caa gac aaa cgt gtc aag aag 670Asp Ser Gln Lys Leu Glu Lys Asp Ser Gln Asp Lys Arg Val Lys Lys135 140 145aag gtg gag aaa ata atg tca gca ttg cac gac tgg cca gac gcg gta 718Lys Val Glu Lys Ile Met Ser Ala Leu His Asp Trp Pro Asp Ala Val150 155 160ttt gat cat gtg ctt ttt cca tct gag gtg gta gca gcg ttt ttt gaa 766Phe Asp His Val Leu Phe Pro Ser Glu Val Val Ala Ala Phe Phe Glu165 170 175gaa gta aaa gag atg gag ctg gaa cct gag att ctt cca gag aac aat 814Glu Val Lys Glu Met Glu Leu Glu Pro Glu Ile Leu Pro Glu Asn Asn180 185 190agg cgt cgc tca agt tca ggt gat aaa atg aag ctg gct gaa gat cct 862Arg Arg Arg Ser Ser Ser Gly Asp Lys Met Lys Leu Ala Glu Asp Pro195 200 205 210ttc acg gaa gac gag ctt gac tac tac cca ttt ctt gag aac aat ccc 910Phe Thr Glu Asp Glu Leu Asp Tyr Tyr Pro Phe Leu Glu Asn Asn Pro215 220 225gtt gag ttt cag ctg aga gat gag cta cca ctc ctg gag cct gga atg 958Val Glu Phe Gln Leu Arg Asp Glu Leu Pro Leu Leu Glu Pro Gly Met230 235 240aac tga agaatgctaa tctgccccac ttgaaaagac ctcagaacag tgctattatc 1014Asnatcattatcc tctttgcaaa ctctacttgc tcaggagcag tttatttgta gtagtagtag 1074tagtaactag tatcctagat gttctgctgt atgtggttgg tgtgataatc attcacactt 1134taggaagaac ccaagtagcg 1154<210>2<211>243<212>PRT<213>稻(Oryza sativa)<400>2Met Ala Ala Pro Thr Ala Thr Ala Val Phe Leu Asp Glu Asn Leu His1 5 10 15Ile His Arg Gly Pro Ala Gly Lys Arg Ala Asp Gly Leu Lys Ala Lys20 25 30Pro Leu Lys Pro Leu Ala Ala Lys Gln Gly Leu Gln Glu Lys Lys Ala35 40 45Leu Arg Asp Val Ser Asn Ile Gly Lys Pro Pro Val Ser Thr Arg Lys50 55 60Pro Leu Gln Asp Val Ser Asn Thr Ala Lys Pro Arg Gly Arg Asn Ile65 70 75 80Ser Asp Gly Thr Thr Leu Lys Lys Thr Ala Leu Arg Ser His Glu Ala85 90 95Thr Lys Asn Pro Val Lys Lys Thr Val Ile Phe Ser Asp Glu Thr Ala100 105 110Lys Cys His Glu Trp Ala Lys Asp Gly Val Glu Gly Thr His Phe Thr115 120 125Gly Asn Asp Ser Gln Lys Leu Glu Lys Asp Ser Gln Asp Lys Arg Val130 135 140Lys Lys Lys Val Glu Lys Ile Met Ser Ala Leu His Asp Trp Pro Asp145 150 155 160Ala Val Phe Asp His Val Leu Phe Pro Ser Glu Val Val Ala Ala Phe165 170 175Phe Glu Glu Val Lys Glu Met Glu Leu Glu Pro Glu Ile Leu Pro Glu180 185 190Asn Asn Arg Arg Arg Ser Ser Ser Gly Asp Lys Met Lys Leu Ala Glu195 200 205Asp Pro Phe Thr Glu Asp Glu Leu Asp Tyr Tyr Pro Phe Leu Glu Asn210 215 220Asn Pro Val Glu Phe Gln Leu Arg Asp Glu Leu Pro Leu Leu Glu Pro225 230 235 240Gly Met Asn<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>Tosl7-3911F引物<400>3gagagcatca tcggttacat cttctc 26<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>Tosl7-xbaI-R<400>4catgaaatag atccatgtat atct 24<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物0F<400>5gccatcacaa atcagcaagc 20<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物3R<400>6atggattgaa ggccaagcca c 21<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于探測(cè)Tosl7-插入突變體的引物<400>7gtctggccag tcgtgcaatg 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于探測(cè)Tosl7-插入突變體的引物<400>8ctgctggcaa gagggctgat 20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于探測(cè)Tosl7-插入突變體的引物<400>9tgggttcttg gtggcctcat 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于探測(cè)Tosl7-插入突變體的引物<400>10gccaagccac tgaagccatt 20
權(quán)利要求
1.一種編碼能控制鹽脅迫耐受性的植物基因的多核苷酸，其中多核苷酸包括具有編碼序列表中SEQ ID NO2的第1位甲硫氨酸至第243位天冬酰胺的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，或具有編碼具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸缺失，取代和/或附加的氨基酸序列的核苷酸序列，并能控制鹽脅迫耐受性的多核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的多核苷酸，其中植物基因還能控制滲透壓脅迫耐受性。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1的多核苷酸，其中多核苷酸得自水稻。
4.一種編碼能控制鹽脅迫耐受性的植物基因的多核苷酸，其中多核苷酸包括具有編碼序列表中SEQ ID NO1的第233位A至第961位C的核苷酸序列，或可在嚴(yán)緊條件下與該核苷酸序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4的多核苷酸，其中植物基因還能控制滲透壓脅迫耐受性。
6.根據(jù)權(quán)利要求
4的多核苷酸，其中多核苷酸得自水稻。
專利摘要
本發(fā)明提供了編碼能控制鹽脅迫耐受性的蛋白質(zhì)的基因。本發(fā)明提供了編碼能控制鹽脅迫耐受性的植物基因的多核苷酸。多核苷酸包括具有編碼序列表中SEQ ID NO2的第1位甲硫氨酸至第243位天冬酰胺的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，或具有編碼具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸缺失，取代和/或附加的氨基酸序列的核苷酸序列，并能控制鹽脅迫耐受性的多核苷酸。
文檔編號(hào)C12N15/29GKCN1464907SQ02802604
公開日2003年12月31日 申請(qǐng)日期2002年8月6日
發(fā)明者廣近洋彥, 宮尾安藝雄, 武田真, 阿部清美 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所, 生物系特定產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究推進(jìn)機(jī)構(gòu)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan