本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種用于hiv-1核酸檢測的引物探針組合及試劑盒。

背景技術(shù)：

1、人類免疫缺陷病毒(human?immunodeficiency?virus，hiv)是一種可感染人類免疫系統(tǒng)細(xì)胞的慢病毒，感染hiv病毒后，因免疫系統(tǒng)受到破壞，逐漸成為許多伺機(jī)性疾病的攻擊目標(biāo)，促成多種臨床癥狀，即獲得性免疫缺陷綜合征(acquiredimmune?deficiencysyndrome，aids)，也稱艾滋病。根據(jù)血清學(xué)反應(yīng)和病毒核酸序列測定，世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的hiv病毒可分為hiv-1和hiv-2型。

2、hiv-1型和hiv-2型之間核苷酸序列有45％的同源性，并且存在免疫交叉反應(yīng)。在hiv-1型內(nèi)，根據(jù)編碼包膜蛋白的env基因和編碼殼蛋白的gag基因序列的同源性又進(jìn)一步分為三個組：m、n和o、p組。m組病毒是全球hiv流行的主要毒株，可進(jìn)一步分為a、b、c、d、f、g、h、j和k共9種亞型和多種重組型流行重組模式(crfs)?，F(xiàn)有技術(shù)中通常僅覆蓋個別常見流行重組型別。

3、目前的醫(yī)療技術(shù)對艾滋病仍沒有一個徹底的治愈辦法，因此預(yù)防和控制艾滋病的傳染是當(dāng)前的重要措施。

4、hiv感染后，血液中出現(xiàn)的病毒標(biāo)志物依次是hiv-1rna、hiv-1p24抗原和hiv-1抗體，診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是血清學(xué)抗體檢測。由于感染hiv到機(jī)體產(chǎn)生抗體可被檢測到存在窗口期，現(xiàn)有診斷技術(shù)檢測hiv抗體、抗原和核酸的窗口期分別為感染后的3周、2周和1周左右。為了有效檢出“窗口期”hiv感染，人們利用感染早期血液中核酸應(yīng)答早、病毒載量高、病毒rna可在體內(nèi)穩(wěn)定存在的特點，建立核酸檢測技術(shù)來實現(xiàn)hiv感染的早期診斷，能夠使hiv感染的窗口期明顯縮短，并對病程病毒載量實時定量監(jiān)測。

5、taqman探針技術(shù)是高度特異的熒光定量pcr技術(shù)。使用taqman探針技術(shù)進(jìn)行核酸檢測靶區(qū)段長度一般在150bp以內(nèi)，因此往往通過多序列比對從某個基因上找到相對保守區(qū)域進(jìn)行檢測，不同基因的突變率不同，其中env的變異率最大，可達(dá)30％，相比env區(qū)域，ltr，pol，gag，相對保守，突變率分別為3％，5％，6％。hiv-1一般選擇ltr區(qū)，pol基因和gag基因。

6、由于hiv-1病毒亞型眾多，基因序列變異復(fù)雜，難以用1對引物來擴(kuò)增hiv所有亞型，因此引物覆蓋度低就會產(chǎn)生漏檢或各種亞型間的定量不準(zhǔn)確的后果，尤其是a、crf01_ae、crf07_bc、crf08_bc、d等其他亞型基因序列差異較大時，這種技術(shù)缺陷會更明顯。目前市面上存在一些基于taqman探針技術(shù)的實時熒光定量pcr用于hiv-1檢測試劑盒，可覆蓋hiv-1型m、n、o組亞型和少數(shù)流行重組型，試劑盒并不能涵蓋hiv-1所有亞型，經(jīng)常存在漏檢的情況。

7、根據(jù)hiv?datebase數(shù)據(jù)庫顯示目前已有143種流行重組型(crfs)，hiv-1型別多、變異高、重組快，不同國家流行毒株不同，但是hiv檢測亞型覆蓋全面與否對早診斷早治療具有重要的意義，可盡可能降低hiv感染的漏檢率。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了一種用于hiv核酸檢測的引物探針組合及試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒能夠于2～8℃保存1年，穩(wěn)定性好，同時本發(fā)明的檢測方法及試劑盒特異性強(qiáng)、敏感度高、操作簡便、結(jié)果明晰、可靠性高。本發(fā)明對于hiv-1的檢測鑒定以及hiv感染者的輔助診斷具有潛在的應(yīng)用前景，對于艾滋病防治和公共衛(wèi)生具有重大影響。

2、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了引物組合，包括引物組ⅰ和/或引物組ⅱ；

4、所述引物組ⅰ具有：如seq?id?no:1～seq?id?no:4任意所示的核苷酸序列；

5、所述引物組ⅱ具有：如seq?id?no:5～seq?id?no:8任意所示的核苷酸序列。

6、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述引物組合中，所述引物組ⅰ包括：引物組ⅰ-ⅰ和引物組ⅰ-ⅱ；

7、所述引物組ⅰ-ⅰ具有：如seq?id?no:1和seq?id?no:2所示的核苷酸序列；

8、所述引物組ⅰ-ⅱ具有：如seq?id?no:3和seq?id?no:4所示的核苷酸序列；

9、所述引物組ⅱ包括：引物組ⅱ-ⅰ和引物組ⅱ-ⅱ；

10、所述引物組ⅱ-ⅰ具有：如seq?id?no:5和seq?id?no:6所示的核苷酸序列；

11、所述引物組ⅱ-ⅱ具有：如seq?id?no:7和seq?id?no:8所示的核苷酸序列。

12、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述引物組合中，所述核苷酸序列修飾甲氧基。

13、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述引物組合中，所述甲氧基位于所述核苷酸序列的靠近3’端的第1～3位。

14、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述引物組合中，所述引物組ⅰ擴(kuò)增hiv基因序列的ltr保守區(qū)；所述引物組ⅱ擴(kuò)增hiv基因序列的pol保守區(qū)。

15、本發(fā)明還提供了探針組合，包括：探針ⅰ和/或探針ⅱ；

16、所述探針ⅰ具有：如seq?id?no:9和/或seq?id?no:10所示的核苷酸序列；

17、所述探針ⅱ具有：如seq?id?no:11和/或seq?id?no:12所示的核苷酸序列。

18、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述探針組合中，所述核苷酸序列修飾鎖核酸。

19、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述探針組合中，所述鎖核酸的數(shù)量為1～3個。

20、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述探針組合中，所述鎖核酸位于所述核苷酸序列的靠近5’端的第10～12位。

21、本發(fā)明還提供了引物探針組，包括：上述引物組合和上述探針組合。

22、本發(fā)明還提供了檢測試劑，包括：上述引物組合、上述探針組合和/或上述引物探針組以及可接受的助劑。

23、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述檢測試劑，還包括：pcr反應(yīng)液、蛋白酶k、內(nèi)標(biāo)、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品中的一種或多種。

24、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述檢測試劑中，所述pcr反應(yīng)液包括：緩沖液、鉀離子、甘油、dmso、吐溫20、dna聚合酶、錳離子和nan3中的一種或多種。

25、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述檢測試劑中，所述pcr反應(yīng)液包括：

26、

27、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述檢測試劑中，所述緩沖液包括ph值為7.4～8.8的tricine緩沖液；tricine緩沖液(3～6mm)主要由tricine、去離子水組成，向其中加入氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)至所需ph。

28、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述檢測試劑中，所述鉀離子以koac的形式添加。

29、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述檢測試劑中，所述醋酸錳的濃度為10～1000mm/l。

30、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述檢測試劑中，所述內(nèi)標(biāo)包括：內(nèi)標(biāo)引物和/或內(nèi)標(biāo)探針；

31、所述內(nèi)標(biāo)引物具有：如seq?id?no:13～如seq?id?no:16任意所示的核苷酸序列；

32、所述內(nèi)標(biāo)探針具有：如seq?id?no:17或如seq?id?no:18所示的核苷酸序列。

33、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述檢測試劑中，所述內(nèi)標(biāo)還包括內(nèi)標(biāo)序列，所述內(nèi)標(biāo)序列具有：如seq?id?no:19所示的核苷酸序列。

34、本發(fā)明還提供了上述引物組合、上述探針組合、上述引物探針組和/或上述檢測試劑在如下任意項中的應(yīng)用；

35、(ⅰ)、制備檢測人類免疫缺陷病毒的產(chǎn)品；和/或

36、(ⅱ)、檢測人類免疫缺陷病毒；和/或

37、(ⅲ)、獲得性免疫缺陷綜合癥的抗病毒藥物的篩選；和/或

38、(ⅳ)、制備篩選獲得性免疫缺陷綜合癥的抗病毒藥物的產(chǎn)品；和/或

39、(v)、監(jiān)測獲得性免疫缺陷綜合癥的抗病毒藥物的治療效果。

40、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述應(yīng)用中，所述檢測包括：將待測樣品與所述檢測試劑混合、擴(kuò)增，獲得檢測結(jié)果。

41、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述應(yīng)用中，所述擴(kuò)增的反應(yīng)條件包括：所述擴(kuò)增的反應(yīng)條件包括：熱激活90～95℃反應(yīng)30～90s，兩段反轉(zhuǎn)錄58～60℃反應(yīng)5～15min，61～65℃反應(yīng)5～15min。

42、本發(fā)明還提供了檢測試劑盒，包括：上述引物組合、上述探針組合、上述引物探針組和/或上述檢測試劑以及可接受的裝置和/或載體。

43、本發(fā)明還提供了非診斷目的的篩選獲得性免疫缺陷綜合癥的抗病毒藥物的方法，將待測樣品與上述檢測試劑和/或上述檢測試劑盒混合、擴(kuò)增，獲得檢測結(jié)果。

44、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述方法中，所述擴(kuò)增的反應(yīng)條件包括：50～52℃反應(yīng)1～2min，90～95℃反應(yīng)30～90s，58～60℃反應(yīng)5～15min，61～65℃反應(yīng)5～15min，90～95℃1～3min，90～95℃10s→55～60℃22s，循環(huán)45次，并于55～60℃分別采集熒光通道的信號。

45、目前市面廠家型別覆蓋包括hiv-1的m、n、o群的亞型，其中m組包含a、b、c、d、e、f、g、h、i、j和k共11種亞型。部分廠家型別覆蓋匯總?cè)缦拢?/p>

46、

47、截止目前全球已有143種流行重組型(crfs)，境內(nèi)流行的hiv主要為m組hiv-1，其基因型主要為b/b’、crf?07_bc重組型、crf?08_bc重組型、crf?01_ae重組型。全球范圍內(nèi)crf?01_ae重組型、crf?02_ag重組型、crf?14_bg重組型、04_cpx重組型、06_cpx重組型等均占有一定比例，且許多國家都有流行重組型占比高于單一亞型占比的趨勢。

48、同時靈敏度，目前國內(nèi)hiv-1核酸檢測的產(chǎn)品靈敏度有25iu/ml，30iu/ml，50iu/ml，100iu/ml等，急性期感染檢測對靈敏度的期望更高。

49、本發(fā)明的有益效果包括：

50、1、本發(fā)明提供的檢測試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)2-8℃保存1年，其他試劑常采用-20℃以下冷凍保存。

51、2、本發(fā)明提供的檢測試劑盒靈敏度高：本發(fā)明方法原理是基于taqman水解探針熒光pcr原理，以病毒hiv-1rna為模板，采用病毒基因組特異性引物探針，輔以dna聚合酶和ung酶，經(jīng)一步法熒光rt-pcr實驗，可快速、準(zhǔn)確對人類免疫缺陷病毒1型(hiv-1)rna模板進(jìn)行分析；從逆轉(zhuǎn)錄到熒光pcr，一步即可完成，可有效的防止多重操作污染。所以，本發(fā)明的檢測方法及試劑盒特異性強(qiáng)、敏感度高、操作簡便、結(jié)果明晰、可靠性高，可用于血清中人類免疫缺陷病毒1型(hiv-1)rna的定量檢測。實驗證明，采用本發(fā)明提供的成套試劑檢測hiv-1，特異性好，靈敏度較高(靈敏度達(dá)到20iu/ml)。

52、3、本發(fā)明提供的檢測試劑盒型別覆蓋全(crf?01_ae重組型、crf?02_ag重組型、crf?07_bc重組型和crf?08_bc重組型等多種流行重組模式。)、特異性高：本發(fā)明基于分子生物學(xué)檢測手段pcr技術(shù)，可覆蓋多種亞型毒株的hiv核酸檢測成套引物對。并通過利用我國主要hiv流行毒株的血漿標(biāo)本及其他病毒(hbv、hcv)的標(biāo)本，對成套引物對進(jìn)行了特異性鑒定，證明本發(fā)明的成套引物對能有效檢出主要的hiv-1流行毒株，適用于多種亞型毒株核酸檢測，且與hbv、hcv無交叉反應(yīng)，可用于hiv-1核酸診斷試劑的設(shè)計和開發(fā)。本發(fā)明對于hiv-1的檢測鑒定以及hiv感染者的輔助診斷具有潛在的應(yīng)用前景，對于艾滋病防治和公共衛(wèi)生具有重大影響。