本發(fā)明屬于夏威夷明鉤蝦，具體涉及一種用于夏威夷明鉤蝦性別鑒定的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、夏威夷明鉤蝦（ parhyale?hawaiensis）是甲殼動物中重要的模式動物，在科學(xué)研究上具有重要作用，在探索胚胎發(fā)育、附肢再生、潮汐節(jié)律和環(huán)境污染等多方面具有重要作用。同時也是對蝦、魚類等經(jīng)濟(jì)動物的優(yōu)質(zhì)餌料，具有較高的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)價值?，F(xiàn)今，許多水產(chǎn)養(yǎng)殖甲殼動物能夠通過性別調(diào)控技術(shù)實現(xiàn)單性化養(yǎng)殖從而提高產(chǎn)量，改善品質(zhì)。夏威夷明鉤蝦雌雄異體，雄性個體比雌性個體大，生長速度快，但目前仍然無法對夏威夷明鉤蝦進(jìn)行早期性別鑒定和性別控制。隨著科學(xué)研究和性控育種對于早期性別鑒定的需求逐步增加，開發(fā)便捷的性別鑒定方法具有重要意義。

2、目前對于夏威夷明鉤蝦的性別鑒定主要是從外部形態(tài)特征出發(fā)，雄性外部形態(tài)特征包括第二鰓足的強壯、膨大，第一觸角嗅毛較多，第二觸角鞭節(jié)較長，通常具有鞋型感受器，復(fù)眼較大。雌性夏威夷明鉤蝦的外部形態(tài)特征主要是胸部擁有4對育卵瓣，著生在胸足基節(jié)板內(nèi)側(cè)。此外，雄性的生殖孔位于第八胸節(jié)腹面，雌性的生殖孔位于第六胸節(jié)腹面。

3、但是對于幼體夏威夷明鉤蝦而言，受到發(fā)育階段的影響，許多性別相關(guān)特征并未發(fā)育完全，通過形態(tài)特征鑒定幼體夏威夷明鉤蝦的性別存在難度。此外，夏威夷明鉤蝦的細(xì)微形態(tài)特征區(qū)分對于缺乏形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)的人員具有鑒別難度。因此，開發(fā)一個簡單易實施的雌雄性別鑒定手段，具有應(yīng)用和科學(xué)的必要性。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于夏威夷鉤蝦性別鑒定的分子標(biāo)記。所要解決的技術(shù)問題不限于所描述的技術(shù)主題，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技術(shù)主題。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供一種夏威夷明鉤蝦性別鑒定分子標(biāo)記或檢測所述夏威夷明鉤蝦性別鑒定分子標(biāo)記的物質(zhì)在鑒定或輔助鑒定夏威夷明鉤蝦性別中的應(yīng)用，所述夏威夷明鉤性別鑒定分子標(biāo)記是核苷酸序列為seq?id?no.1的第27-318位的dna片段。

4、本發(fā)明還提供一種檢測夏威夷明鉤蝦基因組中是否含有核苷酸為seq?id?no.1的第27-318位的dna片段的物質(zhì)在鑒定或輔助鑒定夏威夷明鉤蝦性別中的應(yīng)用。

5、上述應(yīng)用中，所述物質(zhì)含有擴(kuò)增包含所述夏威夷明鉤性別鑒定分子標(biāo)記在內(nèi)的夏威夷明鉤蝦基因組dna片段的pcr引物。

6、上述應(yīng)用中，所述pcr引物為引物對，所述引物對由正向引物和反向引物組成，所述正向引物是核苷酸序列為seq?id?no.2的單鏈dna，所述反向引物是核苷酸序列為seq?idno.3的單鏈dna。

7、本發(fā)明還提供一種鑒定或輔助鑒定夏威夷明鉤蝦性別的方法，所述方法包括以下步驟：

8、（1）以待鑒定夏威夷明鉤蝦基因組dna為模板，利用前述任一所述pcr引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr產(chǎn)物；

9、（2）根據(jù)所述pcr產(chǎn)物是否含有前述的夏威夷明鉤蝦性別鑒定分子標(biāo)記來鑒定夏威夷明鉤蝦的性別。

10、本發(fā)明還提供一種鑒定或輔助鑒定夏威夷明鉤蝦性別的方法，所述方法包括以下步驟：

11、（1）以待鑒定夏威夷明鉤蝦基因組dna為模板，利用前述中任一所述pcr引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr產(chǎn)物；

12、（2）根據(jù)所述pcr產(chǎn)物是否含有特異性dna片段來鑒定夏威夷明鉤蝦的性別，所述特異性dna片段的大小為292?bp。

13、具體而言，前述pcr的程序如下：pcr擴(kuò)增體系為25μl，包括上游引物和下游引物各0.5μl，模板dna?1μl，2×?m5?hiper?plus?taq?hifi?pcr?mix?10μl，dd?h2o?8μl。pcr反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性?3min；94℃變性?25s，55℃退火?25s，72℃延伸?10s，共?30?個循環(huán)；72℃延伸?10min。

14、所述上游引物的序列為seq?id?no.2，所述下游引物的序列為seq?id?no.3。

15、上述方法中，所述pcr產(chǎn)物含有所述夏威夷明鉤蝦性別鑒定分子標(biāo)記或含有dna片段的大小為292?bp的待鑒定夏威夷明鉤蝦為或候選為雄性夏威夷明鉤蝦，所述pcr產(chǎn)物不含有所述夏威夷明鉤蝦性別鑒定分子標(biāo)記或不含有dna片段的大小為292?bp的待鑒定夏威夷明鉤蝦為或候選為雌性夏威夷明鉤蝦。

16、前述dna分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

17、前述核苷酸序列為seq?id?no.1的dna在夏威夷明鉤蝦種質(zhì)資源分析或分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。

18、前述pcr引物在夏威夷明鉤蝦種質(zhì)資源分析或分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。

19、本發(fā)明的優(yōu)點在于，目前端足目夏威夷明鉤蝦缺乏有效的雌雄性別鑒定的遺傳分子標(biāo)記，鑒別夏威夷明鉤蝦的雌雄特征主要依據(jù)形態(tài)分類，但是這一方法對于發(fā)育不成熟的幼體不能夠?qū)崿F(xiàn)有效區(qū)分，而且由于個體發(fā)育可能存在的缺陷使得雌雄之間存在相似性。比如第二鰓足等特征，在幼體期雄性個體并未完全膨大，在雌雄之間存在的差異并不明顯，因此形態(tài)鑒定在夏威夷明鉤蝦的幼體階段以及發(fā)育缺陷個體并不能完全的很好的實現(xiàn)完整鑒別。作為端足目中重要的模式物種夏威夷明鉤蝦（ parhyale?hawaiensis），本發(fā)明提供的分子標(biāo)記能夠有效地鑒定夏威夷明鉤蝦成體以及幼體的雌雄性別，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pcr）、凝膠電泳等方法可簡單快速實現(xiàn)夏威夷明鉤蝦的性別鑒定，提升性別鑒定的范圍和準(zhǔn)確度，結(jié)果穩(wěn)定，具有可靠性、可重復(fù)性和簡易性，從而不用依賴于對其外部形態(tài)的鑒定經(jīng)驗和判斷標(biāo)準(zhǔn)。

20、本發(fā)明中，檢測了15頭雌雄成體，4頭幼體的分子遺傳標(biāo)記和形態(tài)鑒定，證實該分子標(biāo)記的準(zhǔn)確率達(dá)到了100%。而且該方法存在可重復(fù)性，不需要依賴經(jīng)驗對形態(tài)特征進(jìn)行判斷，只需要通過實驗結(jié)果的條帶數(shù)量進(jìn)行雌雄判斷。

技術(shù)特征：

1.夏威夷明鉤蝦性別鑒定分子標(biāo)記或檢測所述夏威夷明鉤蝦性別鑒定分子標(biāo)記的物質(zhì)在鑒定或輔助鑒定夏威夷明鉤蝦性別中的應(yīng)用，所述夏威夷明鉤性別鑒定分子標(biāo)記是核苷酸序列為seq?id?no.1的第27-318位的dna片段。

2.檢測夏威夷明鉤蝦基因組中是否含有核苷酸為seq?id?no.1的第27-318位的dna片段的物質(zhì)在鑒定或輔助鑒定夏威夷明鉤蝦性別中的應(yīng)用。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述物質(zhì)含有擴(kuò)增包含所述夏威夷明鉤性別鑒定分子標(biāo)記在內(nèi)的夏威夷明鉤蝦基因組dna片段的pcr引物。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述pcr引物為引物對，所述引物對由正向引物和反向引物組成，所述正向引物是核苷酸序列為seq?id?no.2的單鏈dna，所述反向引物是核苷酸序列為seq?id?no.3的單鏈dna。

5.一種鑒定或輔助鑒定夏威夷明鉤蝦性別的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

6.一種鑒定或輔助鑒定夏威夷明鉤蝦性別的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述pcr產(chǎn)物含有所述夏威夷明鉤蝦性別鑒定分子標(biāo)記或含有dna片段的大小為292?bp的待鑒定夏威夷明鉤蝦為或候選為雄性夏威夷明鉤蝦，所述pcr產(chǎn)物不含有所述夏威夷明鉤蝦性別鑒定分子標(biāo)記或不含有dna片段的大小為292?bp的待鑒定夏威夷明鉤蝦為或候選為雌性夏威夷明鉤蝦。

8.?dna分子，其特征在于，所述dna分子為核苷酸序列是seq?id?no.1的第27-318位的夏威夷明鉤性別鑒定分子標(biāo)記。

9.核苷酸序列為seq?id?no.1的第27-318位的dna在夏威夷明鉤蝦種質(zhì)資源分析或分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。

10.權(quán)利要求3或4所述pcr引物在夏威夷明鉤蝦種質(zhì)資源分析或分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種用于夏威夷明鉤蝦性別鑒定的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明具體公開了夏威夷明鉤蝦性別鑒定分子標(biāo)記或檢測所述夏威夷明鉤蝦性別鑒定分子標(biāo)記的物質(zhì)在鑒定或輔助鑒定夏威夷明鉤蝦性別中的應(yīng)用，所述夏威夷明鉤性別鑒定分子標(biāo)記是核苷酸序列為SEQ?ID?No.1的第27?318位的DNA片段。本發(fā)明設(shè)計了該性別鑒定分子標(biāo)記的引物，并提供一種鑒定或輔助鑒定夏威夷明鉤蝦性別的方法。本發(fā)明的夏威夷明鉤蝦性別的分子標(biāo)記及其檢測物質(zhì)具有準(zhǔn)確度高，可重復(fù)性好和簡易方便的優(yōu)點。

技術(shù)研發(fā)人員：劉宏廣,童顏,侯仲娥
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國科學(xué)院動物研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/26