本發(fā)明涉及酶工程，具體涉及一種吡咯賴氨酰-trna合成酶突變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、氨酰trna合成酶是蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中至關(guān)重要的酶。它在細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行兩個(gè)催化步驟：首先，它催化atp的磷酸基團(tuán)與氨基酸的羧基結(jié)合，生成氨酰-amp；其次，它結(jié)合trna，催化氨酰-amp中的氨基酸轉(zhuǎn)移到trna上，從而形成氨酰-trna參與蛋白質(zhì)肽鏈的延長(zhǎng)。吡咯賴氨酰-trna合成酶(pylrs)是基因密碼擴(kuò)展技術(shù)中常用的酶之一，其能夠催化具有不同側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸與正交的trna結(jié)合，隨后氨酰-trna識(shí)別空白的終止密碼子uag，并在核糖體合成肽鏈的過(guò)程中引入這些不同側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸。

2、改造pylrs以提高其活性和特異性是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。通過(guò)定向進(jìn)化等手段，科學(xué)家們致力于提升pylrs的催化效率和對(duì)不同非天然氨基酸(ncaas)的識(shí)別能力。這樣的改造不僅能夠擴(kuò)大ncaa在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用范圍，還可以降低工業(yè)生產(chǎn)成本，推動(dòng)基因密碼擴(kuò)展技術(shù)在生物制藥等領(lǐng)域的應(yīng)用。此外，優(yōu)化后的pylrs在合成生物學(xué)、蛋白質(zhì)工程等領(lǐng)域也將發(fā)揮更大的作用，促進(jìn)新型蛋白質(zhì)藥物和功能性蛋白質(zhì)的開(kāi)發(fā)。

3、目前報(bào)道的pylrs種類有mmpylrs、mbpylrs、mapylrs以及chpylrs等，不同的pylrs的發(fā)現(xiàn)為在蛋白質(zhì)內(nèi)實(shí)現(xiàn)引入更多的非天然氨基酸和更高的引入效率提供了可能，但在實(shí)際應(yīng)用中這些pylrs仍表現(xiàn)了較低的非天然氨基酸引入效率，比如mmpylrs、mbpylrs和chpylrs對(duì)高親和力底物bock的引入效率僅有野生型蛋白的2％-5％(continuousdirected?evolution?of?aminoacyl-trna?synthetases)，mapylrs跟mmpylsr引入效率差不多(mutually?orthogonal?pyrrolysyl-trna?synthetase/trnapairs)。如何將pylrs改造成一個(gè)高效普適的非天然氨基酸引入工具成為關(guān)鍵問(wèn)題。

4、綜上所述，pylrs的改造有助于克服其當(dāng)前活性較差的限制，顯著提升ncaa的引入效率和重組蛋白的表達(dá)量，推動(dòng)基因密碼擴(kuò)展技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了提高吡咯賴氨酰-trna合成酶(pylrs)對(duì)不同種類非天然氨基酸的引入效率，本發(fā)明提供了一種吡咯賴氨酰-trna合成酶突變體及其應(yīng)用，該突變體可以大幅度提高各類非天然氨基酸(ncaa)在蛋白質(zhì)中的引入效率。

2、本發(fā)明提供一種吡咯賴氨酰-trna合成酶突變體，以吡咯賴氨酰-trna合成酶的氨基酸序列為基準(zhǔn)，所述突變體包括如下突變中的一種或多種：

3、第2位的天冬氨酸突變?yōu)樘於０?，?1位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，?6位的蘇氨酸突變?yōu)楦彼?，?1位的精氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，?2位的組氨酸突變?yōu)槔野彼幔?22位的蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸和第193位的絲氨酸突變?yōu)榫彼幔?/p>

4、所述吡咯賴氨酰-trna合成酶的氨基酸序列包含如seq?id?no.1所示序列。

5、在某些實(shí)施方式中，所述吡咯賴氨酰-trna合成酶的核苷酸序列包含如seq?idno.2所示序列。

6、在某些實(shí)施方式中，所述吡咯賴氨酰-trna合成酶來(lái)源于馬氏甲烷八疊球菌(methanosarcina?mazei)。

7、在某些實(shí)施方式中，所述突變體還包括a1)-a5)中的一種或多種：

8、a1)第7位的天冬酰胺突變?yōu)槔野彼幔?/p>

9、a2)第63位的組氨酸突變?yōu)榱涟彼峄虍惲涟彼幔?/p>

10、a3)第67位的賴氨酸突變?yōu)樘於０罚?/p>

11、a4)第74位的纈氨酸突變?yōu)樯彼峄虮奖彼幔?/p>

12、a5)第76位的天冬氨酸突變?yōu)樘於０坊蚪M氨酸。

13、優(yōu)選的，所述突變體包含上述所述突變中的3種以上組合。

14、進(jìn)一步的，所述突變體包含4種突變，為：第7位的天冬酰胺突變?yōu)槔野彼?、?3位的組氨酸突變?yōu)榱涟彼?，?7位的賴氨酸突變?yōu)樘於０泛偷?4位的纈氨酸突變?yōu)樯彼帷?/p>

15、進(jìn)一步的，所述突變體包含5種突變，為：第7位的天冬酰胺突變?yōu)槔野彼?、?3位的組氨酸突變?yōu)榱涟彼帷⒌?7位的賴氨酸突變?yōu)樘於０?、?4位的纈氨酸突變?yōu)樯彼岷偷?6位的天冬氨酸突變?yōu)樘於０贰?/p>

16、進(jìn)一步的，所述突變體包含5種突變，為：第7位的天冬酰胺突變?yōu)槔野彼?、?3位的組氨酸突變?yōu)榱涟彼?、?7位的賴氨酸突變?yōu)樘於０?、?4位的纈氨酸突變?yōu)樯彼岷偷?6位的天冬氨酸突變?yōu)榻M氨酸。

17、進(jìn)一步的，所述突變體包含4種突變，為：第7位的天冬酰胺突變?yōu)槔野彼?、?3位的組氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?、?7位的賴氨酸突變?yōu)樘於０泛偷?4位的纈氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?/p>

18、本發(fā)明將mmpylrs的結(jié)構(gòu)域分成trna結(jié)合結(jié)構(gòu)域(tbd)和c端結(jié)構(gòu)域(cd)，并對(duì)mmpylrs的c端突變體ifrs(n346s/c348i)的tbd區(qū)域進(jìn)行改造，通過(guò)ifrs對(duì)3-溴-苯丙氨酸(3brf)引入到gfp蛋白后的相對(duì)熒光強(qiáng)度表示突變體的活性。

19、本發(fā)明通過(guò)對(duì)多個(gè)氨基酸突變進(jìn)行組合，構(gòu)建并獲得了組合突變體，使得吡咯賴氨酰-trna合成酶對(duì)非天然氨基酸的催化活性大幅提高。

20、本發(fā)明還提供一種分離的多核苷酸，編碼如上文所述的吡咯賴氨酰-trna合成酶突變體。

21、在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸的序列包含seq?id?no.4、seq?id?no.6、seq?idno.8和seq?id?no.10所示序列中的一種或多種。

22、突變體z1-ifrs、z2-ifrs、z3-ifrs、z4-ifrs的核苷酸序列分別如seq?id?no.4、seq?id?no.6、seq?id?no.8、seq?id?no.10所示。

23、本發(fā)明還提供一種核酸構(gòu)建體，包含如上文所述的多核苷酸。

24、本發(fā)明還提供一種宿主，包含如上文所述的核酸構(gòu)建體或基因中整合有如上文所述的多核苷酸。

25、在某些實(shí)施方式中，所述宿主選自大腸桿菌dh10b。宿主可以選自bl21(de3)、c321.δa.exp(一種改造過(guò)的確實(shí)rf-1基因的菌株，來(lái)源于bl21)、dh10b。比較常見(jiàn)的是在dh10b中表達(dá)。

26、本發(fā)明還提供如上文所述突變體或如上文所述多核苷酸或如上文所述核酸構(gòu)建體或如上文所述宿主在生產(chǎn)非天然氨基酸中的應(yīng)用。

27、在某些實(shí)施方式中，所述應(yīng)用包括：將所述重組載體與目標(biāo)蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到含非天然氨基酸的目標(biāo)蛋白。

28、在某些實(shí)施方式中，所述非天然氨基酸選自3-溴-l-苯丙氨酸(3brf)、3-氟-l-苯丙氨酸(3ff)、2，3-氟-l-苯丙氨酸(23ff)、2，4-氟-l-苯丙氨酸(24ff)、2,5-氟-l-苯丙氨酸(25ff)、3,4,5-氟-l-苯丙氨酸(345ff)、2,3,6-氟-l-苯丙氨酸(236ff)、5-溴-2-氯-l-苯丙氨酸(5br2clf)、2-氯-l-苯丙氨酸(2clf)、3,4-氯-l-苯丙氨酸(34clf)、2-噻吩基-l-丙氨酸(2thia)和3-溴-2-噻吩基-l-丙氨酸(brthia)中的一種或多種。

29、本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)非天然氨基酸的方法，將如上文所述突變體或如上文所述多核苷酸或如上文所述核酸構(gòu)建體或如上文所述宿主添加至含有非天然氨基酸的反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)。

30、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

31、1)本發(fā)明的吡咯賴氨酰-trna合成酶突變體能高效地將非天然氨基酸引入到目標(biāo)蛋白質(zhì)中，引入效率均獲得大幅度提升為45％-135.2％，并能提高重組蛋白的表達(dá)量。

32、2)本發(fā)明的吡咯賴氨酰-trna合成酶突變體對(duì)非天然氨基酸具有普適性，能將不同種類的苯丙氨酸，如3-溴-l-苯丙氨酸(3brf)、3-氟-l-苯丙氨酸(3ff)、2,3-氟-l-苯丙氨酸(23ff)、2,4-氟-l-苯丙氨酸(24ff)、2,5-氟-l-苯丙氨酸(25ff)、3,4,5-氟-l-苯丙氨酸(345ff)、2,3,6-氟-l-苯丙氨酸(236ff)、5-溴-2-氯-l-苯丙氨酸(5br2clf)、2-氯-l-苯丙氨酸(2clf)、3,4-氯-l-苯丙氨酸(34clf)、2-噻吩基-l-丙氨酸(2thia)、3-溴-2-噻吩基-l-丙氨酸(brthia)引入到目標(biāo)多肽中。