本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因及在制備巖白菜素上的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、朱砂根(ardisia?crenata?sims)為報(bào)春花科紫金牛屬(ardisia)植物。該屬植物分布于中國、印度、緬甸、馬來半島、印度尼西亞和日本；在中國分布于西藏東南部至臺灣，湖北至海南島等地區(qū)。朱砂根植物中所含藥用成分較多,巖白菜素是主要有效成分之一。巖白菜素因其多種藥理活性被廣泛關(guān)注，如鎮(zhèn)咳、抗炎、抗焦慮、抗氧化、抗瘧疾、抗癌、治療糖尿病、抗肝毒性、免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)等。與嗎啡類抑制中樞止咳藥不同，巖白菜素對咳嗽中樞具有選擇性抑制作用，對其他神經(jīng)中樞無抑制作用，具有毒副作用小、不良反應(yīng)少、連續(xù)使用不產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)。巖白菜素已被制成多種劑型在國內(nèi)廣泛用于治療呼吸系統(tǒng)疾病，如復(fù)方巖白菜素片，巖白菜素膠囊等。

2、巖白菜素生物合成前體為2-葡萄糖-4-甲氧基沒食子酸經(jīng)由分子內(nèi)脫水后重排后閉環(huán)生成；2-葡萄糖-4-甲氧基沒食子酸由4-甲氧基沒食子酸在碳糖基轉(zhuǎn)移酶(cgt,c-glucosyltransferase)的催化下以尿苷二磷酸葡萄糖(udp-glucose)為糖基供體在2位連接葡萄糖生成；4-甲氧基沒食子酸由沒食子酸氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(omt,o-methyltransferase)以沒食子酸為底物，s-腺苷-蛋氨酸(sam,s-adenosyl-methionine)為甲基供體催化生成；沒食子酸由莽草酸經(jīng)過莽草酸脫氫酶(sdh,shikimatedehydrogenases)在nadp+為質(zhì)子供體的條件下催化生成。

3、隨著慢性支氣管炎疾病日益增多，巖白菜素原料藥材缺口日益增大。目前市場上的巖白菜素原料主要依靠提取獲得，用于提取巖白菜素的干貨藥材年需求量已達(dá)2000余噸。近幾十年的大肆采挖已經(jīng)造成野生資源儲量銳減，瀕臨枯竭。同時(shí)，原產(chǎn)地海拔高、山區(qū)多、氣候條件寒冷，導(dǎo)致人工大面積栽培困難，進(jìn)一步擴(kuò)大了巖白菜素原料市場缺口，價(jià)格逐年攀升。近年來，隨著合成生物學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展，利用合成生物學(xué)技術(shù)生產(chǎn)天然藥物單體可以有效解決上述問題。但是，要搞清這些活性成分的生物合成途徑，必需鑒定這些途徑中相關(guān)的關(guān)鍵基因，發(fā)掘這些催化酶基因成為研究植物代謝產(chǎn)物生物合成途徑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。當(dāng)前，4-甲氧基沒食子酸在c-2位發(fā)生糖基化反應(yīng)催化形成2-葡萄糖-4-甲氧基沒食子酸的合成路徑已經(jīng)清晰，但是負(fù)責(zé)糖基化的碳糖基轉(zhuǎn)移酶的功能得到驗(yàn)證較少，影響了巖白菜素生物合成工作的推進(jìn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因，可作為巖白菜素的生物合成調(diào)控基因以及應(yīng)用于制備巖白菜素。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明第一方面提供一種朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因，所述朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因的核酸序列如seq?id?no.1所示，序列全長1359bp。

4、本發(fā)明第二方面提供了上述朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因所編碼的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.2所示，編碼了451個(gè)氨基酸殘基。

5、本發(fā)明第三方面提供了含有上述朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因的重組質(zhì)粒。

6、作為優(yōu)選，所述重組質(zhì)粒通過將上述的朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因與pet28a載體同源重組獲得，命名為pet28a-accgt64。

7、本發(fā)明第四方面提供了一種轉(zhuǎn)基因工程菌，含有所述的重組質(zhì)粒，或，所述基因工程菌的基因組中整合有外源的上述的朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因。

8、作為優(yōu)選，所述轉(zhuǎn)基因工程菌為大腸桿菌bl21(de3)菌株。

9、本發(fā)明第五方面提供了一種朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因在制備巖白菜素的應(yīng)用。

10、作為優(yōu)選，以4-甲氧基沒食子酸和糖基供體尿苷二磷酸葡萄糖(udp-glucose)為原料，在由上述的朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因編碼得到的朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下，在4-甲氧基沒食子酸的c-2位上進(jìn)行糖基化反應(yīng)，生成巖白菜素。

11、本發(fā)明通過重組質(zhì)粒，在體外表達(dá)后獲得目標(biāo)蛋白，經(jīng)進(jìn)一步對底物4-甲氧基沒食子酸進(jìn)行催化，直接生成巖白菜素。

12、本發(fā)明所述的朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因，是從朱砂根的植株中，通過轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學(xué)技術(shù)，經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)后篩選后得以鑒定出來的；采用rna試劑后提取朱砂根根狀莖的rna，并反轉(zhuǎn)錄成cdna后進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。所述的朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因的擴(kuò)增引物如下所示：

13、5'f：atgtctaactccggtaaccaag；(seq?id?no.3)

14、3'r：ctaatttttcttcaccgtagtaatt；(seq?id?no.4)

15、此外，與載體pet28a進(jìn)行同源重組時(shí)，accgt64基因則需要使用帶同源壁的引物進(jìn)行擴(kuò)增及回收，帶同源壁的引物如下：

16、上游同源臂引物：

17、5'f：cagcaaatgggtcgcggatccatgtctaactccggtaaccaag；(seq?id?no.5)

18、下游同源臂引物：

19、3'r：acggagctcgaattcggatccctaatttttcttcaccgtagtaatt；(seq?id?no.6)

20、從朱砂根中分離并鑒定的碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因，可作為朱砂根的分子輔助育種的重要標(biāo)記基因，同時(shí)也可作為酵母底盤細(xì)胞構(gòu)建中生產(chǎn)巖白菜素的重要候選基因。

21、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：

22、(1)本發(fā)明提供朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因，可作為巖白菜素的生物合成調(diào)控基因，并應(yīng)用于制備巖白菜素。

23、(2)隨著生物信息學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，極大地推進(jìn)了巖白菜素生物合成路徑關(guān)鍵酶基因的挖掘，本發(fā)明中巖白菜素的生物合成調(diào)控基因即朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因，是首次鑒定并成功驗(yàn)證，開辟了一種生產(chǎn)巖白菜素的生物合成新方法。本發(fā)明通過大腸桿菌異源表達(dá)蛋白在體外進(jìn)行酶催化的方式來獲得目標(biāo)產(chǎn)物，采用體外生物合成，進(jìn)行定向生產(chǎn)，具有副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)。

24、(3)本發(fā)明還提供了含有該朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因的重組質(zhì)粒、基因工程菌和重組蛋白，為通過生物工程方法大量合成巖白菜素，進(jìn)一步為構(gòu)建產(chǎn)巖白菜素的細(xì)胞工廠研究奠定基礎(chǔ)。

25、(4)通過體外生物合成巖白菜素，可控性強(qiáng)，可以減少對原料種植的需求，生產(chǎn)產(chǎn)物單一，便于后期巖白菜素的分離和純化，還可減少化學(xué)合成困難，合成路徑復(fù)雜等問題。所述朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因作為巖白菜素生物合成的關(guān)鍵基因，還可用于紫金牛等富含巖白菜素植物的育種研究。

技術(shù)特征：

1.一種朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因，其特征在于，所述朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因的核酸序列如seq?id?no.1所示。

2.權(quán)利要求1所述的朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因編碼蛋白，其特征在于，該編碼蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

3.含有權(quán)利要求1所述的朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因的重組質(zhì)粒。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含有朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因的重組質(zhì)粒，其特征在于，將朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因與pet28a載體同源重組，獲得pet28a?-?accgt64重組質(zhì)粒。

5.一種轉(zhuǎn)基因工程菌，其特征在于，權(quán)利要求3或4所述的重組質(zhì)粒，或，所述基因工程菌的基因組中整合有外源的權(quán)利要求1所述的朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因工程菌，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因工程菌為大腸桿菌bl21(de3)菌株。

7.權(quán)利要求1所述的朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因在制備巖白菜素的應(yīng)用。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶accgt64基因在制備巖白菜素的應(yīng)用，其特征在于，以4-甲氧基沒食子酸作為底物，尿苷二磷酸葡萄糖（udp-glucose）為糖基供體，在由上述的朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶aqcgt51基因編碼得到的朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下，在4-甲氧基沒食子酸的c-2位上進(jìn)行糖基化反應(yīng)，生成巖白菜素。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶AcCGT64基因及在制備巖白菜素上的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶AcCGT64基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，序列全長1359bp；編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，編碼了451個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明朱砂根碳糖基轉(zhuǎn)移酶AcCGT64基因可作為巖白菜素的生物合成調(diào)控基因，并應(yīng)用于制備巖白菜素，應(yīng)用前景顯著，易于推廣應(yīng)用。

技術(shù)研發(fā)人員：郝冰,杜江順,劉祥宇,王益娜,陳碧環(huán),陳麗,葉懿江,歐陽睿晨,毛柯軼,李姝嫻,李宏誠,張廣輝,楊生超,盧迎春,和四梅
受保護(hù)的技術(shù)使用者：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19